一种携带双特异性启动子的载体、构建方法及其应用与流程

1.本发明属于生物技术领域，涉及一种携带双特异性启动子的载体、构建方法及其应用。


背景技术：

2.以腺相关病毒(adeno-associated virus，aav)为载体的基因药物具有基因表达持久、免疫原性低等特点，已经被广泛运用到单基因遗传病、眼科疾病、神经系统疾病等领域。但由于aav对肿瘤细胞的侵染特异性不强，在侵染肿瘤细胞的同时也会侵染正常细胞，限制了其在肿瘤治疗领域的应用。
3.肿瘤特异启动子(tumor-specific promoter)为aav在肿瘤领域的应用带来了希望。肿瘤特异启动子是指在肿瘤细胞中特异性表达的启动子序列。这些启动子具有与正常细胞相比更高的活性，或者仅在肿瘤细胞中被激活。肿瘤特异启动子的应用可以实现多种目的。首先，它们可以用于肿瘤基因治疗，通过将治疗基因与肿瘤特异启动子组合，使治疗基因仅在肿瘤细胞中表达，从而提高治疗的特异性和安全性。其次，肿瘤特异启动子也可以用于肿瘤免疫治疗，通过将免疫相关基因与肿瘤特异启动子组合，促进免疫细胞在肿瘤局部特异性的抗肿瘤反应。此外，肿瘤特异启动子还可以用于肿瘤诊断，通过将报告基因与肿瘤特异启动子组合，实现肿瘤细胞的可视化或分子探针的发展。


技术实现要素：

4.肿瘤特异性启动子在正常细胞中有时也会异常启动，而每一次的启动表达都会对正常细胞或者组织产生一定的杀伤作用，为了弥补现有技术的不足，解决目前现有技术中存在的具体问题，本发明提供了一种携带双特异性启动子的载体、构建方法及其应用，在两个特异性启动子同时启动时具备杀伤功能，提高肿瘤治疗的精确性和安全性。
5.本发明提供了一种双特异性启动子的载体，所述双特异性启动子为两个特异性启动子。
6.所述载体包括：双特异性启动子分别连接目的基因。
7.所述目的基因包括以下组合中的至少一种：casp1 act和gsdmd的组合、gsdmd c和gsdmd n的组合。
8.所述目的基因每一个组合中的两个组成成分可分别叫做目的基因1、目的基因2。
9.术语“载体”包括核酸序列的生物或化学部分，所述核酸序列可引入适当宿主细胞中以用于复制或表达所述核酸序列。载体包含非病毒载体和病毒载体。在本发明的一些实施方案中，非病毒载体可选自纳米颗粒、新颖生物材料、裸dna、噬菌体、转座子、质粒、粘粒、人工染色体。质粒、其它克隆和表达载体、其特性以及可根据本发明使用的构建方法对本领域的技术人员显而易见。
10.进一步，所述双特异性启动子的两个启动子可分别叫做特异性启动子1、特异性启动子2。
11.进一步，所述双特异性启动子的载体的结构包括顺次连接的特异性启动子1、目的基因1、特异性启动子2、目的基因2。
12.进一步，所述特异性启动子与目的基因之间以特殊的粘性末端确保连接准确性。
13.进一步，所述特异性启动子是癌症相关特异性启动子。
14.进一步，所述癌症包括鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌，肺的腺癌、肺的鳞状细胞癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃肠癌、胰腺癌、胶质母细胞瘤、颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝癌、乳癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌、肛门癌、阴茎癌、阴囊癌、食道癌、胆道肿瘤、以及头和颈部的癌。
15.进一步，所述双特异性启动子对应的两个启动子为pca3、peg3、人端粒酶逆转录酶启动子，survivin启动子，medkine启动子，癌胚抗原启动子，muc-1启动子、probasin基因启动子中的任意两种。
16.进一步，所述载体包括质粒、慢病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、线性多核苷酸。
17.进一步，所述载体包括aav病毒核心质粒。
18.进一步，所述双特异性启动子的载体包括结构为aav-pca3-casp1act-peg3-gsdmd的载体。
19.进一步，所述双特异性启动子的载体包括如seq id no:1所示的casp1 act核苷酸序列。
20.进一步，所述双特异性启动子的载体包括如seq id no:2所示的gsdmd核苷酸序列。
21.进一步，所述双特异性启动子的载体包括如seq id no:3所示的pca3核苷酸序列。
22.进一步，所述双特异性启动子的载体包括如seq id no:4所示的peg3核苷酸序列。
23.进一步，所述双特异性启动子的载体的结构包括顺次连接的seq id no:3、seq id no:1、seq id no:4、seq id no:2的核苷酸序列。
24.在某些实施方案中，所述双特异性启动子的载体的结构为aav-pca3-casp1act-peg3-gsdmd，是指在aav病毒中顺次连接pca3启动子、casp1 act、peg3启动子、gsdmd。在某些具体的实施方案中，所述aav病毒中顺次连接pca3启动子、casp1 act、peg3启动子、gsdmd包括顺次连接的seq id no:3、seq id no:1、seq id no:4、seq id no:2的核苷酸序列。在某些实施方案中，所述双特异性启动子的载体的结构为aav-peg3-gsdmd-pca3-casp1 act，是指在aav病毒中顺次连接peg3启动子、gsdmd、pca3启动子、casp1 act。在某些具体的实施方案中，所述aav病毒中顺次连接peg3启动子、gsdmd、pca3启动子、casp1 act包括顺次连接seq id no:4、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:1的核苷酸序列。
25.在某些实施方案中，所述载体除启动子以外，还可包含有其他适当的“调控元件”或“调控序列”，其包括但不限于增强子；转录因子；转录终止子；高效rna处理信号，如剪接和聚腺苷酸化信号(polya)；稳定胞质mrna的序列，例如土拔鼠肝炎病毒(whv)转录后调控元件(wpre)；增强翻译效率的序列(即，kozak共有序列)；增强蛋白质稳定性的序列；和在需要时，增强所编码产物的分泌的序列。在某些实施方案中，所述polya的实例包括sv40、牛生长激素(bgh)和tk polya。在某些实施方案中，所述增强子的实例包括α胎蛋白增强子、ttr最小启动子/增强子、lsp(th结合球蛋白启动子/α1-微球蛋白/比库蛋白(bikunin)增强子)
以及其它增强子。
26.本发明还提供了一种双特异性启动子的载体的构建方法，所述构建方法用于构建前面所述的载体，所述构建方法包括：
27.获取目的基因，所述目的基因包括以下组合中的至少一种：casp1 act和gsdmd的组合、gsdmd c和gsdmd n的组合；
28.获取双特异性启动子；
29.将所述目的基因的组合和所述双特异性启动子组装在载体上，得到所述的载体。
30.进一步，所述目的基因每一个组合中的两个组成成分可分别叫做目的基因1、目的基因2。
31.进一步，所述双特异性启动子的两个启动子可分别叫做特异性启动子1、特异性启动子2。
32.进一步，所述双特异性启动子的载体的结构包括顺次连接的特异性启动子1、目的基因1、特异性启动子2、目的基因2。
33.进一步，所述特异性启动子与目的基因之间以特殊的粘性末端确保连接准确性。
34.进一步，所述双特异性启动子的两个启动子包括pca3、peg3、人端粒酶逆转录酶启动子，survivin启动子，medkine启动子，癌胚抗原启动子，muc-1启动子、probasin基因启动子中的任意两种。
35.进一步，所述载体包括质粒、慢病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、线性多核苷酸。
36.进一步，所述载体为aav病毒核心质粒。
37.在某些实施方案中，所述aav病毒包括aav病毒核心质粒或aav病毒核心质粒改造的质粒，所述aav病毒的结构包括aav衣壳和包装于衣壳中的载体基因组。
38.术语“载体基因组”是指已改造的病毒或非病毒核心载体，一般指质粒，慢病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体中的核心遗传物质以及线性多核苷酸等。“载体基因组”在适当条件下，可以是非原病毒载体的核心遗传物质或非原病毒载体的核心遗传物质改造的核心遗传物质。在某些具体的实施方案中，所述载体基因组可以是本发明中所述的双特异性启动子的载体。在某些具体的实施方案中，所述载体基因组包括病毒的核心质粒或病毒的核心质粒改造的质粒。
39.在某些实施方案中，提供一种aav病毒载体。“aav病毒”是含有两个元件的dna酶抗性病毒颗粒，所述两个元件即aav衣壳和至少包含有包装在aav衣壳内的非aav编码序列的载体基因组。aav衣壳的来源可以是几十种天然存在且可获得的腺相关病毒中的任一种以及工程化的aav。
40.术语“aav衣壳”或“aav载体中间体”是指缺少包装于其中的所需基因组序列的组装的aav衣壳。其也可称为“空”衣壳。此衣壳可不含有目的基因序列，或仅含有不足以实现基因产物的表达的部分包装的基因组序列。“空”衣壳是非功能性的，以将所关注基因转移到宿主细胞。
41.进一步，所述构建方法包括以下任意一种：
42.a、将所述目的基因的组合进行扩增，双特异性启动子的两个启动子进行扩增，然后所述目的基因与特异性启动子分别连接，然后将连接物克隆到所述载体上，得到所述包
括双特异性启动子和目的基因的载体；
43.b、将所述目的基因与特异性启动子的两个启动子进行扩增，然后直接进行克隆到所述载体上，得到所述包括双特异性启动子和目的基因的载体。
44.进一步，所述特异性启动子与目的基因之间以特殊的粘性末端确保连接准确性。
45.本发明还提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包括前面所述的载体。
46.进一步，所述宿主细胞包括原核细胞、真核细胞。
47.进一步，所述原核细胞包括细菌、放线菌、蓝细菌、支原体、衣原体、立克次氏体。
48.进一步，所述真核细胞包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母细胞。
49.进一步，所述哺乳动物细胞包括成纤维细胞、293t细胞。
50.在一个实施方案中，所述宿主细胞为能够工程化培养的细胞。术语“宿主细胞”可指包装细胞系，其中载体由生产质粒产生。在某一个实施方案中，术语“宿主细胞”可以指其中需要转基因表达的任何靶细胞。因此，“宿主细胞”是指含有已经以任何手段(例如，电穿孔、磷酸钙沉淀、微注射、转化、病毒感染、转染、脂质体递送、膜融合技术、高速dna包被的团粒、病毒感染和原生质体融合)引入细胞中的外源性或异源性核酸序列的原核或真核细胞。
51.在某个具体的实施方案中，术语“宿主细胞”是指用于试管内评估本文中所描述的组合物的各种哺乳动物物种的细胞的培养物。在本文中的其它实施方案中，术语“宿主细胞”是指用于产生和包装病毒载体或重组病毒的细胞。在另一实施方案中，术语“宿主细胞”意图指针对如本文中所描述的疾病或病状在活体内治疗的个体的靶细胞。在某些实施方案中，术语“宿主细胞”是前列腺细胞。
52.本发明还提供了一种病毒，所述病毒包括前面所述的载体。
53.载体产生过程可包含例如以下方法步骤：细胞培养的开始、细胞传代、细胞接种、用质粒dna转染细胞、将转染后培养基更换成无血清培养基以及采集含载体的细胞和培养基。
54.进一步，所述病毒包括慢病毒、逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、痘病毒、乳多空病毒、杆状病毒、乳头状瘤病毒。
55.进一步，所述病毒为腺相关病毒。
56.本发明还提供了一种前面所述的病毒的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
57.将前面所述的载体转染进入宿主细胞中；以及对转染后的宿主细胞扩增表达，获得所述的病毒。
58.进一步，所述病毒包括慢病毒、逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、痘病毒、乳多空病毒、杆状病毒、乳头状瘤病毒。
59.进一步，所述病毒为腺相关病毒。
60.进一步，所述载体转化进入宿主细胞的方式包括电穿孔、磷酸钙沉淀、微注射、转化、病毒感染、转染、脂质体递送、膜融合技术、高速dna包被的团粒、病毒感染和原生质体融合。
61.进一步，所述宿主细胞包括原核细胞、真核细胞。
62.进一步，所述原核细胞包括细菌、放线菌、蓝细菌、支原体、衣原体、立克次氏体。
63.进一步，所述真核细胞包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母细胞。
64.进一步，所述哺乳动物细胞包括成纤维细胞、293t细胞。
65.本发明还提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括前面所述的载体、前面所述的宿主细胞、前面所述的病毒。
66.进一步，所述药物组合物还包括药学上可接受的辅助性成分。
67.进一步，所述辅助性成分包括溶剂、分散介质、媒剂、涂层、稀释剂、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂、缓冲剂、载剂溶液、悬浮液、胶质物。
68.进一步，所述药物组合物以脂质颗粒、脂质体、囊泡、纳米球或纳米颗粒或类似物的形式存在。
69.在某些实施方案中，所述药物组合物被工程化成非病毒载体，例如质粒或者其它基因元件，所述载体与载剂、稀释剂和/或赋形剂等混合形成药物组合物。在某些实施方案中，所述药物组合物被工程化成病毒载体，所述病毒载体与载剂、稀释剂和/或赋形剂等混合形成药物组合物。在某些实施方案中，所述药物组合物被工程化成载体基因组，载体基因组包装到aav衣壳中以形成腺相关病毒，所述腺相关病毒与载剂、稀释剂和/或赋形剂等混合形成药物组合物。在某些实施方案中，所述载体基因组可以包装到不同病毒中。
70.术语“辅助性成分”包含任何和所有溶剂、分散介质、媒剂、涂层、稀释剂、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂、缓冲剂、载剂溶液、悬浮液、胶质物等。此类培养基和药剂用于药物活性物质的用途在本领域中是熟知的。还可将补充性活性成分并入组合物中。“药学上可接受的”是指当向宿主施用时不会产生过敏或类似不良反应的分子实体和组合物。常规和药学上可接受的施用途径包含但不限于直接递送到所需器官(例如，肝脏(任选地经由肝动脉)、肺、心脏、眼睛、肾脏)、口服、吸入、鼻内、鞘内、气管内、动脉内、眼内、静脉内、肌内、皮下、皮内和其它亲本施用途径。视需要，可组合施用途径。
71.可选择任何合适的施用途径(例如，口服、吸入、鼻内、气管内、动脉内、眼内、静脉内、肌内、腹膜内和其它亲本途径)。因此，可将药物组合物调配成用于任何适当施用途径，例如呈液体溶液或悬浮液的形式(例如以用于静脉内施用、用于口服施用等)。可替代地，药物组合物可呈固体形式(例如，呈片剂或胶囊的形式，例如以用于口服施用)。在一些实施方案中，药物组合物可呈粉剂、滴剂、喷雾剂等的形式。
72.本发明还提供了前面所述的载体、前面所述的构建方法、或前面所述的宿主细胞在制备病毒或质粒中的应用。
73.进一步，所述病毒包括慢病毒、逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、痘病毒、乳多空病毒、杆状病毒、乳头状瘤病毒。
74.进一步，所述病毒为腺相关病毒。
75.本发明还提供了前面所述的载体、前面所述的构建方法、前面所述的宿主细胞、前面所述的病毒、或前面所述的制备方法在制备治疗肿瘤的药物中的应用。
76.进一步，所述癌症包括鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌，肺的腺癌、肺的鳞状细胞癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃肠癌、胰腺癌、胶质母细胞瘤、颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝癌、乳癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌、肛门癌、阴茎癌、阴囊癌、食道癌、胆道肿瘤、以及头和颈部的癌。
77.术语“包括”、“含有”、“包含”和其变体包含其它组分、元件、整数、步骤等。相反，术语“由
……
组成”和其变体不包含其它组分、元件、整数、步骤等。
78.本发明具备的有益效果：
79.本发明提供了一种双特异启动子的载体，其具备能够在肿瘤细胞中特异性表达的功能，在两种启动子启动的情况下表达出必须的两个目的基因，两个目的基因相互作用行使杀伤肿瘤细胞的功能；同时本发明中双特异性启动子的载体在非肿瘤细胞中不表达、极少表达，若一种启动子在非肿瘤细胞中异常表达，也不会行使杀伤细胞的功能，降低了正常细胞受到误伤的概率，提高了安全性，具备广阔的市场应用前景。
附图说明
80.图1是不同启动子在成纤维细胞(fb)中的启动表达图；
81.图2是不同启动子在正常前列腺细胞(rwpe-1)中的启动表达图；
82.图3是不同启动子在前列腺癌细胞(c4-2)中的启动表达图；
83.图4是不同质粒在前列腺癌细胞(c4-2)细胞中的杀伤作用图；
84.图5是不同质粒在正常前列腺细胞(rwpe-1)中的杀伤作用图；
85.图6是aav体内实验有效性研究图，其中，a为对照组小鼠和实验组小鼠接种不同质粒后的肿瘤效果图，b为接种后的肿瘤体积图；
86.图7是对照组小鼠和实验组小鼠接种不同质粒后的体重统计图；
87.图8是小鼠血液生化检测图，其中，a为谷氨酰胺基转移酶检测图，b为谷丙转氨酶检测图，c为碱性磷酸酶检测图，d为谷草转氨酶检测图。
具体实施方式
88.以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
89.实施例1特异启动子验证
90.1、实验材料
91.①
前列腺癌细胞c4-2、正常前列腺细胞rwpe-1、成纤维细胞fb、293t细胞；
92.②
pei转染试剂。
93.2、实验方法
94.1)载体构建
95.采用egfp最为对照，合成sffv-egfp基因(对照组)、aav-sffv-casp1act-gsdmd、pca3-casp1 act-peg3-gsdmd，分别通过酶切位点5
’‑
paci和3
’‑
ecori连接到aav载体。
96.各元件核苷酸序列如下：
97.casp1 act核苷酸序列(seq id no：1)：
98.atgaacccagctatgcccacatcctcaggctcagaagggaatgtcaagctttgctccctagaagaagctcaaaggatatggaaacaaaagtcggcagagatttatccaataatggacaagtcaagccgcacacgtcttgctctcattatctgcaatgaagaatttgacagtattcctagaagaactggagctgaggttgacatcacaggcatgacaatgctgctacaaaatctggggtacagcgtagatgtgaaaaaaaatctcactgcttcggacatgactacagagctggaggcatttgcacaccgcccagagcacaagacctctgacagcacgttcctggtgttcatgtctcatggtattcgggaaggcatttgtgggaagaaacactctgagcaagtcccagatatactacaactcaatgcaatctttaacatgttgaataccaagaactgcccaagtttgaaggacaaaccgaaggtgatcatcatccaggcctgccgtggtgacagccctggtgtggtgtggtttaaagatggaagcggagctactaacttcagcctgctgaagcaggctggagacgtggaggagaaccctggacctatggctattaagaaagcccacatagagaaggattttatcgctttctgctcttccacaccagataatgtttcttggagacatc
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99.gsdmd核苷酸序列(seq id no：2)：
100.atggggtcggcctttgagcgggtagtccggagagtggtccaggagctggaccatggtggggagttcatccctgtgaccagcctgcagagctccactggcttccagccctactgcctggtggttaggaagccctcaagctcatggttctggaaaccccgttataagtgtgtcaacctgtctatcaaggacatcctggagccggatgccgcggaaccagacgtgcagcgtggcaggagcttccacttctac gatgccatggatgggcagatacagggcagcgtggagctggcagccccaggacaggcaaagatcgcaggcggggccgcggtgtctgacagctccagcacctcaatgaatgtgtactcgctgagtgtggaccctaacacctggcagactctgctccatgagaggcacctgcggcagccagaacacaaagtcctgcagcagctgcgcagccgcggggacaacgtgtacgtggtgactgaggtgctgcagacacagaaggaggtggaagtcacgcgcacccacaagcgggagggctcgggccggttttccctgcccggagccacgtgcttgcagggtgagggccagggccatctgagccagaagaagacggtcaccatcccctcaggcagcaccctcgcattccgggtggcccagctggttattgactctgacttggacgtccttctcttcccggataagaagcagaggaccttccagccacccgcgacaggccacaagcgttccacgagcgaaggcgcctggccacagctgccctctggcctctccatgatgaggtgcctccacaacttcctgacagatggggtccctgcggagggggcgttcactgaagacttccagggcctacgggcagaggtggagaccatctccaaggaactggagcttttggacagagagctgtgccagctgctgctggagggcctggagggggtgctgcgggaccagctggccctgcgagccttggaggaggcgctggagcagggccagagccttgggccggtggagcccctggacggtccagcaggtgctgtcctggagtgcctggtgttgtcctccggaatgctggtgccggaactcgctatccctgttgtctacctgctgggggcactgaccatgctgagtgaaacgcagcacaagctgctggcggaggcgctggagtcgcagaccctgttggggccgctcgagctggtgggcagcctcttggagcagagtgccccgtggcaggagcgcagcaccatgtccctgccccccgggctcctggggaacagctggggcgaaggagcaccggcctgggtcttgctggacgagtgtggcctagagctgggggaggacactccccacgtgtgctgggagccgcaggcccagggccgcatgtgtgcactctacgcctccctggcactgctatcaggactgagccaggagccccactaapca3核苷酸序列(seq id no：3)：
101.tgtcaacatagtgtgacgggaaggagcatgatgagacagaaggaaggtttaaactgggaaatctgagaaatggtatggttgtatgtgggttggcattcttgcatgatgggagtggccacctgctttcatattctgaagtcagagtgttccagacagaagaaatagcaagtgccgagaagctggcatcagaaaaacagag gggagatttgtgtgg
102.peg3核苷酸序列(seq id no：4)：
103.gaaagagaaagagaatgggacggcatgtgactgcctgatgaagttggcgtgcttgctcaaaagttctgcgagattgacggctctctggatttgagccaaggacacgcctgggaagccacggtgacctcacaaggcccggaatctccgcgagaatttcagtgttgttttcctctctccacctttctcagggacttccgaaactccgcctctccggtgacgtcagcatagcgctgcgtcagactataaactcccgggtgatcgtgttggcgcagattgactcagttcgcagcttgtggaagattacatgcgagaccccgcgcgactccgcatccctttgccgggacagcctttgcgacagcccgtgagacatcacgtccccgagccccacgcctgagggcgacatgaacgcgctggccttgagagcaatccggacccacgaccgcttttggcaaaccgaaccggac
104.egfp核苷酸序列(seq id no：5)：
105.atggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgct
accccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaacggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactacctgagcacccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtacaag
106.2)aav病毒包装与浓缩
107.a、提前一天将约2
×
107个293ft细胞铺至t175培养瓶(25ml dmem培养基)置于5％ co2的37℃温箱中孵育约16h～24h；
108.b、制备pei-dna混合物：准备1.5ml、15ml离心管，将aav病毒核心质粒10.5ug、衣壳质粒10.5ug、辅助质粒helper 30ug与3ml opti-mem在50ml离心管中混匀，将150ul pei(100um浓度)与3ml opti-mem在15ml离心管中混匀，室温孵育5分钟后，将二者充分混匀，室温孵育20分钟；
109.c、将293t细胞上清小心吸走，使用3ml dpbs小心清洗一遍，将dpbs吸走，在步骤2中50ml离心管中加入18ml opti-mem培养基，反复吹打数次混匀后全部加入至293ft细胞培养瓶；
110.d、将步骤3中培养皿置于含5％ co2的37℃温箱孵育约6小时后，吸走全部上清，加入25ml dmem完全培养基；
111.e、分别在48小时、72小时收取上清，混合后使用0.45um滤膜过滤；
112.f、加入12.5ml 5
×
peg8000沉淀病毒，完全混匀后4℃过夜；
113.g、第二天4℃，4000g离心30min；
114.h、弃掉上清，加入500ul pbs重悬病毒；
115.i、利用qpcr法测定病毒滴度。
116.3)aav感染靶细胞
117.a、感染前一天将c4-2、rwpe-1、fb细胞铺入6孔板中，每孔6
×
105(c4-2、rwpe-1)、3
×
105(fb)加入到6孔版中；
118.b、感染当天按moi 1000加入各种病毒；
119.c、置于细胞培养箱中培养。
120.4)启动子启动检测
121.通过共聚焦显微镜观察表达绿色荧光蛋白细胞。
122.3、实验结果
123.携带不同启动子的aav病毒感染不同细胞后，结果显示组成型启动子sffv在三种细胞中均可以正常启动下游egfp基因的表达(图1、图2、图3)，而肿瘤特异启动子pca3和peg3在正常细胞中表现出较差的启动能力(图1、图2)，但在前列腺癌细胞中可以有效启动egfp的表达(图3)。同时，结果显示cea特异启动子在正常前列腺细胞系rwpe-1中有少量泄露启动(图2)。
124.实施例2体外验证特异启动子启动杀伤基因对肿瘤细胞的杀伤能力
125.1、实验材料
126.①
前列腺癌细胞c4-2、正常前列腺细胞rwpe-1；
②
c.live tox red死细胞指示试剂。
127.2、实验方法
128.①
细胞转染前一天将c4-2、rwpe-1细胞按4
×
105/孔接种到12孔板中；
129.②
细胞转染当天每孔弃掉就培养基，跟换750ul 1640完全培养基，置于细胞培养箱培养30min；
130.③
取38ul无血清dmem培养基稀释0.75ug质粒，另取38ul无血清dmem培养基稀释2.25ul ployjet试剂，立即将稀释好的polyjet加入到稀释好的治理中，混匀后室温放置15min；
131.④
将
③
得到的混合液加入对应孔中，并加入1
×
c.live tox red死细胞指示试剂，“8”字混匀后加入对应孔中，立即放入cellcyte中采集荧光信号(指示死细胞)，每孔采集4个视野，每3小时采集一次；
132.⑤
待采集完成后，分离各孔荧光面积，统计细胞死亡情况。
133.3、实验结果
134.结构显示，在c4-2细胞中与对照组aav空载体相比，转染aav-sffv-casp1act-gsdmd和aav-pca3-casp1 act-peg3-gsdmd的细胞出现大量死亡(图4)；而在前列腺正常细胞rwpe-1中，只有转染了组成型启动子的质粒aav-sffv-casp1 act-gsdmd后细胞出现死亡，转染aav空载体和特异启动子aav-pca3-casp1 act-peg3-gsdmd后细胞均没有发生明显死亡现象(图5)。证明双特异启动子在控制杀伤基因的表达可以在保证有效性的前提下提高安全性。
135.实施例3体外验证特异启动子启动杀伤基因对肿瘤细胞杀伤的有效性和安全性
136.1、实验材料
137.①
nude裸鼠；
②
前列腺癌细胞c4-2。
138.2、实验方法
139.a、小鼠皮下成瘤
140.①
消化c4-2肿瘤细胞，调整细胞浓度为2
×
107个细胞/ml
141.②
选取小鼠右侧腋下进针，向前方穿行，注射前针头稍微动一动，确保位于皮下；
142.③
将整根针头缓慢插入皮下后缓慢注射细胞悬液100μl，可看见明显的鼓包；
143.④
注射完毕后，缓慢旋转退出针头，尽量避免漏液；
144.⑤
待皮下肿瘤形成后进行肿瘤体积测量，肿瘤体积计算依据公式：
145.体积＝长径
×
短径
×
短径
×
1/2
146.根据肿瘤体积将小鼠分成对照组(con)和实验组(aav)；
147.b、小鼠给药及肿瘤体积、体重监测
148.①
通过尾静脉注射100ul aav病毒(1
×
10
10
，实验组)，对照组注射100ul pbs；
149.②
每3到4天对肿瘤体积、小鼠体重进行测量并记录；
150.③
每利用血生化仪对小鼠血生化进行检测。
151.c、小鼠血液生化检测及脏器系数
152.①
给药4周后，对所有小鼠进行眼眶取血，采集血清，通过血生化仪检测小鼠血液中谷丙转氨酶、谷草转氨酶、碱性磷酸酶、谷氨酰胺基转移酶含量；
153.②
取血完成后，对小鼠进行安乐死，摘取主要脏器(心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏、脑)，计算脏器系数。
154.3、实验结果
155.小鼠实验结果显示aav治疗组可以显著抑制肿瘤的生长(图6)，且小鼠体重与对照组没有显著差异(图7)。说明双启动子启动杀伤基因aav病毒可以有效抑制肿瘤生长且没有明显毒副作用。
156.aav-pca3-casp1-peg3-gsdmd与对照组相比，血液中谷丙转氨酶、谷草转氨酶、碱性磷酸酶、谷氨酰胺基转移酶含量没有明显差异(图8)，同时心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾、脑的脏器系数也没有明显差异(表1)。表明5aav-pca3-casp1-peg3-gsdmd对小鼠没有明显毒性。
157.表1主要脏器的脏器系数
[0158][0159]
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

技术特征：
1.一种双特异性启动子的载体，其特征在于，所述双特异性启动子为两个特异性启动子；所述载体包括：双特异性启动子分别连接目的基因；所述目的基因包括以下组合中的至少一种：casp1 act和gsdmd的组合、gsdmd c和gsdmd n的组合；所述目的基因每一个组合中的两个组成成分可分别叫做目的基因1、目的基因2；优选地，所述双特异性启动子的两个启动子可分别叫做特异性启动子1、特异性启动子2；优选地，所述双特异性启动子的载体的结构包括顺次连接的特异性启动子1、目的基因1、特异性启动子2、目的基因2；优选地，所述特异性启动子是癌症相关特异性启动子；优选地，所述癌症包括鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌，肺的腺癌、肺的鳞状细胞癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃肠癌、胰腺癌、胶质母细胞瘤、颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝癌、乳癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌、肛门癌、阴茎癌、阴囊癌、食道癌、胆道肿瘤、以及头和颈部的癌；优选地，所述双特异性启动子对应的两个启动子为pca3、peg3、人端粒酶逆转录酶启动子，survivin启动子，medkine启动子，癌胚抗原启动子，muc-1启动子、probasin基因启动子中的任意两种；优选地，所述载体包括质粒、慢病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、线性多核苷酸；优选地，所述双特异性启动子的载体包括结构为aav-pca3-casp1act-peg3-gsdmd的载体；优选地，所述双特异性启动子的载体包括如seq id no:1所示的casp1 act核苷酸序列；优选地，所述双特异性启动子的载体包括如seq id no:2所示的gsdmd核苷酸序列；优选地，所述双特异性启动子的载体包括如seq id no:3所示的pca3核苷酸序列；优选地，所述双特异性启动子的载体包括如seq id no:4所示的peg3核苷酸序列；优选地，所述双特异性启动子的载体结构包括顺次连接的seq id no:3、seq id no:1、seq id no:4、seq id no:2的核苷酸序列。2.一种双特异性启动子的载体的构建方法，其特征在于，所述构建方法用于构建权利要求1所述的载体，所述构建方法包括：获取目的基因，所述目的基因包括以下组合中的至少一种：casp1 act和gsdmd的组合、gsdmd c和gsdmd n的组合；获取双特异性启动子；将所述目的基因的组合和所述双特异性启动子组装在载体上，得到所述的载体；优选地，所述双特异性启动子的两个启动子包括pca3、peg3、人端粒酶逆转录酶启动子，survivin启动子，medkine启动子，癌胚抗原启动子，muc-1启动子、probasin基因启动子中的任意两种。3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述载体包括质粒、慢病毒载体、逆转
录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、线性多核苷酸；优选地，所述载体为aav病毒核心质粒。4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括以下任意一种：a、将所述目的基因的组合进行扩增，双特异性启动子进行扩增，然后所述目的基因与特异性启动子连接，然后将连接物克隆到所述载体上，得到所述包括双特异性启动子和目的基因的载体；b、将所述目的基因与特异性启动子进行扩增，然后直接进行克隆到所述载体上，得到所述包括双特异性启动子和目的基因的载体。5.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包括权利要求1所述的载体；优选地，所述宿主细胞包括原核细胞、真核细胞；优选地，所述原核细胞包括细菌、放线菌、蓝细菌、支原体、衣原体、立克次氏体；优选地，所述真核细胞包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母细胞；优选地，所述哺乳动物细胞包括成纤维细胞、293t细胞。6.一种病毒，其特征在于，所述病毒包括权利要求1所述的载体；优选地，所述病毒包括慢病毒、逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、痘病毒、乳多空病毒、杆状病毒、乳头状瘤病毒；优选地，所述病毒为腺相关病毒。7.一种权利要求6所述的病毒的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：将权利要求1所述的载体转染进入宿主细胞中；以及对转染后的宿主细胞扩增表达，获得所述的病毒；优选地，所述病毒包括慢病毒、逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、痘病毒、乳多空病毒、杆状病毒、乳头状瘤病毒；优选地，所述病毒为腺相关病毒；优选地，所述宿主细胞包括原核细胞、真核细胞；优选地，所述原核细胞包括细菌、放线菌、蓝细菌、支原体、衣原体、立克次氏体；优选地，所述真核细胞包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母细胞；优选地，所述哺乳动物细胞包括成纤维细胞、293t细胞。8.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括权利要求1所述的载体、权利要求5所述的宿主细胞、权利要求6所述的病毒；优选地，所述药物组合物还包括药学上可接受的辅助性成分；优选地，所述辅助性成分包括溶剂、分散介质、媒剂、涂层、稀释剂、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂、缓冲剂、载剂溶液、悬浮液、胶质物。9.权利要求1所述的载体、权利要求2-4任一项所述的构建方法或权利要求5所述的宿主细胞在制备病毒或质粒中的应用；优选地，所述病毒包括慢病毒、逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、痘病毒、乳多空病毒、杆状病毒、乳头状瘤病毒；优选地，所述病毒为腺相关病毒。10.权利要求1所述的载体、权利要求2-4任一项所述的构建方法、权利要求5所述的宿主细胞、权利要求6所述的病毒、或权利要求7所述的制备方法在制备治疗肿瘤的药物中的
应用；优选地，所述癌症包括鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌，肺的腺癌、肺的鳞状细胞癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃肠癌、胰腺癌、胶质母细胞瘤、颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝癌、乳癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌、肛门癌、阴茎癌、阴囊癌、食道癌、胆道肿瘤、以及头和颈部的癌。

技术总结
本发明公开了一种携带双特异性启动子的载体、构建方法及其应用，本发明提供了一种双特异性启动子的载体，还提供了双特异性启动子的载体的构建方法，本发明还提供了包括前述双特异性启动子载体的宿主细胞、病毒及其制备方法，本发明还提供了相关的药物组合物，其能够在特定肿瘤细胞中特异性表达，实现肿瘤细胞的精准杀伤，同时本发明中双特异性启动子的载体在非肿瘤细胞中不表达或极少表达，降低了正常细胞受到误伤的概率，提高了安全性，具有广阔的市场应用前景。的市场应用前景。的市场应用前景。


技术研发人员：宋灿 王振宇 冉杰 田甜 于杨 郭平 顾雨春 吴理达
受保护的技术使用者：呈诺再生医学科技（北京）有限公司
技术研发日：2023.06.30
技术公布日：2023/10/5