基于Fiber1蛋白的检测4型禽腺病毒的抗体的制作方法

基于fiber 1蛋白的检测4型禽腺病毒的抗体
技术领域
1.本发明涉及生物技术检测领域，具体涉及基于fiber 1蛋白的检测4型禽腺病毒的抗体。


背景技术：

2.禽腺病毒(fowl adenovirus，fadv)属于腺病毒科(adenoviridae)禽腺病毒属(aviadenovirus)，是一种无囊膜的线状双股dna病毒。根据抗原差异分为三个群，传统的i群禽腺病毒(fadv-i)分为12个血清型。fadv感染引起鸡产蛋量下降、呼吸道疾病等症状，急性感染引起心包积液、肌胃糜烂以及包涵体肝炎等疾病，严重时可导致死亡，给养殖业造成巨大损失。当前我国主要流行毒株为fadv-4。
3.成熟的禽腺病毒由衣壳和芯髓组成，包括六邻体蛋白(hexon)、五邻体蛋白(penton)、纤突蛋白(fiber)和次要结构蛋白。fiber蛋白上有禽腺病毒的重要抗原，在病毒感染过程中发挥重要作用。fiber蛋白可分为fiber1(长纤维蛋白)和fiber2(短纤维蛋白)，其中fiber1为fadv的表面蛋白，对宿主细胞膜上的特异性受体具有强识别能力，在fadv-4的感染、吸附过程中起到关键作用，能够有效刺激体液免疫，甚至产生中和抗体。
4.目前还没有一种具有高活性和高特异性的fadv-4fiber 1蛋白的重组抗体，用于间接免疫荧光和间接elisa等特异性检测。


技术实现要素：

5.有鉴于此，本发明提供了基于fiber 1蛋白的检测4型禽腺病毒的抗体。
6.本发明提供了基于fiber 1蛋白的检测4型禽腺病毒的抗体。本发明中所述抗体是基于fiber 1蛋白作为禽腺病毒重要的免疫原性蛋白，在禽腺病毒i群不同血清型毒株之间相对保守，所制备的重组抗体具有良好的特异性和稳定性，不仅可以用于禽腺病毒i群的间接免疫荧光，还可以用于间接elisa检测，具有广泛的应用前景。
7.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
8.本发明提供了单链抗体，其包括重链和轻链：
9.所述重链的cdr区包括cdr1、cdr2和cdr3：
10.(ⅰ)、所述重链的cdr1具有如seq id no.2所示的氨基酸序列；和
11.(ⅱ)、所述重链的cdr2具有如seq id no.3所示的氨基酸序列；和
12.(ⅲ)、所述重链的cdr3具有如seq id no.4所示的氨基酸序列；或
13.(ⅳ)、在如(ⅰ)～(ⅲ)任一项所示的氨基酸序列的基础上经取代、缺失、添加和/或替换1个或多个氨基酸的序列；或
14.(v)、与如(ⅰ)～(ⅳ)任一项所示的氨基酸序列同源性80％以上的序列；
15.所述轻链的cdr区包括cdr1、cdr2和cdr3：
16.(ⅵ)、所述轻链的cdr1具有如seq id no.11所示的氨基酸序列；和
17.(ⅶ)、所述轻链的cdr2具有如seq id no.12所示的氨基酸序列；和
18.(
ⅷ
)、所述轻链的cdr3具有如seq id no.13所示的氨基酸序列；或
19.(
ⅸ
)、在如(ⅵ)～(
ⅷ
)任一项所示的氨基酸序列的基础上经取代、缺失、添加和/或替换1个或多个氨基酸的序列；或
20.(
ⅹ
)、与如(ⅵ)～(
ⅸ
)任一项所示的氨基酸序列同源性80％以上的序列。
21.在本发明的一些具体实施方案中，所述单链抗体，其重链可变区具有：
22.(ⅰ)、如seq id no.5所示的氨基酸序列；或
23.(ⅱ)、在如(ⅰ)所示的氨基酸序列的基础上经取代、缺失、添加和/或替换1个或多个氨基酸的序列；或
24.(ⅲ)、与如(ⅰ)所示的氨基酸序列同源性80％以上的序列；
25.其轻链可变区具有：
26.(ⅳ)、如seq id no.14所示的氨基酸序列；或
27.(
ⅴ
)、在如(ⅳ)所示的氨基酸序列的基础上经取代、缺失、添加和/或替换1个或多个氨基酸的序列；或
28.(ⅵ)、与如(ⅳ)所示的氨基酸序列同源性80％以上的序列。
29.在本发明的一些具体实施方案中，所述重链可变区与轻链可变区由连接肽linker连接；
30.所述连接肽linker具有：
31.(ⅰ)、如seq id no.16所示的氨基酸序列；或
32.(ⅱ)、在如(ⅰ)所示的氨基酸序列的基础上经取代、缺失、添加和/或替换1个或多个氨基酸的序列；或
33.(ⅲ)、与如(ⅰ)所示的氨基酸序列同源性80％以上的序列。
34.在本发明的一些具体实施方案中，所述单链抗体包括重链和轻链：
35.所述重链包括ch1、铰链区、ch2、ch3：
36.所述重链具有：
37.(ⅰ)、如seq id no.1所示的氨基酸序列；或
38.(ⅱ)、在如(ⅰ)所示的氨基酸序列的基础上经取代、缺失、添加和/或替换1个或多个氨基酸的序列；或
39.(ⅲ)、与如(ⅰ)所示的氨基酸序列同源性80％以上的序列；
40.所述ch1具有：
41.(ⅰ)、如seq id no.6所示的氨基酸序列；或
42.(ⅱ)、在如(ⅰ)所示的氨基酸序列的基础上经取代、缺失、添加和/或替换1个或多个氨基酸的序列；或
43.(ⅲ)、与如(ⅰ)所示的氨基酸序列同源性80％以上的序列；
44.所述铰链区具有：
45.(ⅰ)、如seq id no.7所示的氨基酸序列；或
46.(ⅱ)、在如(ⅰ)所示的氨基酸序列的基础上经取代、缺失、添加和/或替换1个或多个氨基酸的序列；或
47.(ⅲ)、与如(ⅰ)所示的氨基酸序列同源性80％以上的序列；
48.所述ch2具有：
49.(ⅰ)、如seq id no.8所示的氨基酸序列；或
50.(ⅱ)、在如(ⅰ)所示的氨基酸序列的基础上经取代、缺失、添加和/或替换1个或多个氨基酸的序列；或
51.(ⅲ)、与如(ⅰ)所示的氨基酸序列同源性80％以上的序列；
52.所述ch3具有：
53.(ⅰ)、如seq id no.9所示的氨基酸序列；或
54.(ⅱ)、在如(ⅰ)所示的氨基酸序列的基础上经取代、缺失、添加和/或替换1个或多个氨基酸的序列；或
55.(ⅲ)、与如(ⅰ)所示的氨基酸序列同源性80％以上的序列；
56.所述轻链包括cl1；
57.所述轻链具有：
58.(ⅳ)、如seq id no.10所示的氨基酸序列；或
59.(
ⅴ
)、在如(ⅳ)所示的氨基酸序列的基础上经取代、缺失、添加和/或替换1个或多个氨基酸的序列；或
60.(ⅵ)、与如(ⅳ)所示的氨基酸序列同源性80％以上的序列；
61.所述cl1具有：
62.(ⅰ)、如seq id no.15所示的氨基酸序列；或
63.(ⅱ)、在如(ⅰ)所示的氨基酸序列的基础上经取代、缺失、添加和/或替换1个或多个氨基酸的序列；或
64.(ⅲ)、与如(ⅰ)所示的氨基酸序列同源性80％以上的序列。
65.在本发明的一些具体实施方案中，扩增所述重链可变区的引物具有：
66.(ⅰ)、如seq id no.17～22所示的核苷酸序列；或
67.(ⅱ)、与(ⅰ)所示的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(ⅰ)所示的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或
68.(ⅲ)、与(ⅰ)或(ⅱ)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(ⅰ)或(ⅱ)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
69.(ⅳ)、与(ⅰ)～(ⅲ)任一项所述核苷酸序列具有至少80％序列同源性的核苷酸序列；
70.扩增所述轻链可变区的引物具有：
71.(ⅰ)、如seq id no.23～28所示的核苷酸序列；或
72.(ⅱ)、与(ⅰ)所示的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(ⅰ)所示的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或
73.(ⅲ)、与(ⅰ)或(ⅱ)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(ⅰ)或(ⅱ)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
74.(ⅳ)、与(ⅰ)～(ⅲ)任一项所述核苷酸序列具有至少80％序列同源性的核苷酸序列。
75.在本发明的一些具体实施方案中，扩增所述重链可变区和轻链可变区的pcr程序包括：95℃预变性体5min，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸60s，35个循环后，72℃再延伸5min。
76.在本发明的一些具体实施方案中，经重叠pcr构建所述单链抗体的抗体库；
77.所述重叠pcr包括：重叠延伸第一轮pcr：不加引物，98℃变性1min，45℃退火30s，72℃延伸1min，重复10个循环，最后72℃作用5min；加入引物重叠pcr-fp、重叠pcr-rp，98℃变性30s，然后58℃复性30s，72℃延伸1min，30个循环后72℃再延伸5min；
78.所述重叠pcr-fp具有：
79.(ⅰ)、如seq id no.29所示的核苷酸序列；或
80.(ⅱ)、与(ⅰ)所示的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(ⅰ)所示的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或
81.(ⅲ)、与(ⅰ)或(ⅱ)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(ⅰ)或(ⅱ)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
82.(ⅳ)、与(ⅰ)～(ⅲ)任一项所述核苷酸序列具有至少80％序列同源性的核苷酸序列；
83.所述重叠pcr-rp具有：
84.(ⅰ)、如seq id no.30所示的核苷酸序列；或
85.(ⅱ)、与(ⅰ)所示的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(ⅰ)所示的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或
86.(ⅲ)、与(ⅰ)或(ⅱ)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(ⅰ)或(ⅱ)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
87.(ⅳ)、与(ⅰ)～(ⅲ)任一项所述核苷酸序列具有至少80％序列同源性的核苷酸序列。
88.本发明还提供了核酸分子，编码所述的单链抗体。
89.在上述研究的基础上，本发明还提供了表达元件，其包括启动子、终止子和所述核酸分子。
90.在本发明的一些具体实施方案中，所述启动子包括但不限于cmv启动子；所述终止子包括但不限于poly(a)。
91.本发明还提供了表达载体，包括如下任意项以及可接受的载体：
92.(ⅰ)、所述核酸分子；和/或
93.(ⅱ)、所述表达元件。
94.在本发明的一些具体实施方案中，所述载体包括pcomb3xss、ptt5-v7和/或ptt5-v8。
95.本发明还提供了重组抗体，包括表达所述表达载体。
96.本发明还提供了宿主，包括如下任意项：
97.(ⅰ)、所述单链抗体；和/或
98.(ⅱ)、所述核酸分子；和/或
99.(ⅲ)、所述表达元件；和/或
100.(ⅳ)、所述表达载体；和/或
101.(
ⅴ
)、所述重组抗体。
102.在本发明的一些具体实施方案中，宿主包括大肠杆菌和/或hek293f细胞。
103.本发明还提供了如下任意项在制备特异性检测4型禽腺病毒的产品中的应用：
104.(ⅰ)、所述单链抗体；和/或
105.(ⅱ)、所述核酸分子；和/或
106.(ⅲ)、所述表达元件；和/或
107.(ⅳ)、所述表达载体；和/或
108.(
ⅴ
)、所述重组抗体；和/或
109.(ⅵ)、所述宿主。
110.在本发明的一些具体实施方案中，所述特异性检测的方法包括间接免疫荧光和间接elisa。
111.在本发明的一些具体实施方案中，所述特异性检测4型禽腺病毒包括基于如下任意项与fadv-4fiber 1蛋白特异性结合：
112.(ⅰ)、所述单链抗体；和/或
113.(ⅱ)、所述核酸分子；和/或
114.(ⅲ)、所述表达元件；和/或
115.(ⅳ)、所述表达载体；和/或
116.(
ⅴ
)、所述重组抗体；和/或
117.(ⅵ)、所述宿主。
118.本发明还提供了检测4型禽腺病毒的产品，包括如下任意项：
119.(ⅰ)、所述单链抗体；和/或
120.(ⅱ)、所述核酸分子；和/或
121.(ⅲ)、所述表达元件；和/或
122.(ⅳ)、所述表达载体；和/或
123.(
ⅴ
)、所述重组抗体；和/或
124.(ⅵ)、所述宿主。
125.本发明还提供了重组抗体的制备方法，包括培养所述宿主，获得所述重组抗体。
126.本发明还提供了检测4型禽腺病毒的方法，取待测样本，采用如下任意项检测：
127.(ⅰ)、所述单链抗体；和/或
128.(ⅱ)、所述核酸分子；和/或
129.(ⅲ)、所述表达元件；和/或
130.(ⅳ)、所述表达载体；和/或
131.(
ⅴ
)、所述重组抗体；和/或
132.(ⅵ)、所述宿主。
133.本发明的优点在于：本发明构建的噬菌体展示文库在特异性抗体筛选方面具有极高的应用前景，筛选到的抗fadv-4fiber 1重组抗体ab-fadv-4fiber 1特异性强、亲和力高，可用于fadv-4的特异性检测，具有很好的市场应用前景。
附图说明
134.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
135.图1示实施例中fadv-4fiber 1-scfv噬菌体文库的构建和免疫文库的多样性分
析；其中，a示新西兰兔免疫4次的抗体效价检测；b示扩增条带为vl基因文库和vh基因文库，m：marker；1：vl目的条带；2：vh目的条带；3：vl-linker-vh目的条带；
136.图2示实施例中高亲和力fadv-4fiber 1-scfv的筛选；其中，a示电转后pcr鉴定结果；；b示第一轮噬菌体展示筛选后的抗体文库多样性；c示第二轮噬菌体展示筛选后的抗体文库多样性；d示第二轮噬菌体elisa确定筛选抗原fadv-4fiber 1高特异性结合的scfv抗体；
137.图3示实施例中ab-fadv-4fiber 1的表达与亲和力；其中，a示ab-fadv-4fiber 1的sds-page结果，m：marker；1：ab-fadv-4fiber 1目的条带；b示ab-fadv-4fiber1抗体与抗原fadv-4fiber 1的ec
50
；c示ab-fadv-4fiber 1与fadv-4病毒的间接免疫荧光实验结果；
138.图4示ptt5-v7和ptt5-v8质粒图谱；其中，a示ptt5-v7质粒图谱；b示ptt5-v8质粒图谱。
具体实施方式
139.本发明公开了基于fiber 1蛋白的检测4型禽腺病毒的抗体，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
140.本发明通过噬菌体展示技术构建了一个大容量噬菌体单链抗体库，经过两轮富集筛选到1株能与fadv-4fiber 1蛋白特异性结合的单链抗体(single chain antibody fragment，scfv)fadv-4fiber 1-scfv。利用分子生物学技术将vh和vl嫁接到含有鼠抗体骨架的载体ptt5-v7与ptt5-v8，在真核细胞hek293f中表达并纯化。通过间接elisa实验证实，纯化后获得的重组抗体ab-fadv-4fiber 1可以特异性的结合抗原，具有高亲和力。基于此，本发明要求保护如下技术方案：
141.一种抗fadv-4fiber 1蛋白的重组抗体，所述重组抗体为ab-fadv-4fiber 1，所述重组抗体包含重链vh和轻链vl。
142.所述ab-fadv-4fiber 1和fadv-4fiber 1-scfv的重链可变区氨基酸序列如seq id no.5所示，所述ab-fadv-4fiber 1和fadv-4fiber 1-scfv的轻链可变区氨基酸序列如seq id no.14所示；
143.所述单链抗体fadv-4fiber 1-scfv的重链可变区与轻链可变区由连接肽linker连接，所述连接肽linker的氨基酸序列如seq id no.16所示；
144.本发明还保护编码上述抗fadv-4fiber 1蛋白重组抗体的所有核苷酸序列。
145.本发明还保护一种包含上述多核苷酸分子的重组dna表达载体。
146.对scfv同源重组形成单链抗体fadv-4fiber 1-scfv，首先通过噬菌体展示获得的亲和力较高的scfv序列。其次利用分子生物学技术将vh和vl嫁接到含有鼠抗体骨架的载体ptt5-v7与ptt5-v8，使用hek293f表达ab-fadv-4fiber 1重组抗体，用间接elisa实验检测抗原抗体的结合情况。结果表明，有2株fadv-4fiber 1-scfv在elisa检测中呈强阳性。最终通过ec50筛选到1株针对fadv-4fiber 1靶抗原的高亲和力ab-fadv-4fiber1。
147.本发明所用菌株、质粒、试验动物与试剂
148.成年新西兰兔购自安徽定远县永康清源养殖场；fadv-4fiber 1蛋白由深圳赫兹生物科技技术有限公司实验室制备和保存(氨基酸序列为seq id no.33)；fadv-4病毒由深圳赫兹生物科技技术有限公司实验室保存(genbank:km096544.1)；含有鼠抗体骨架的载体ptt5-v7与ptt5-v8质粒为深圳赫兹生物科技技术有限公司实验室保存(图4)；hrp标记的重组蛋白g购自生工生物工程(上海)股份有限公司；hrp标记的鼠抗m13k07噬菌体购自成都阿帕克生物科技有限公司；hrp标记的羊抗鼠igg购自北京梅科万德生物科技有限公司；pcomb3xss质粒、大肠杆菌dh5α感受态细胞购自山东赫兹生物科技技术有限公司；m13k07辅助噬菌体、大肠杆菌er2738感受态细胞购自南京禾鸣英固生物科技有限公司；sds-page蛋白胶试剂盒购自雅酶生物科技技术有限公司；青霉素-链霉素溶液购自ge公司(用于细胞培养)；弗氏佐剂购自sigma公司；clonexpress ii one step cloning kit购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司；premix taq、plasmid mini kit、gel extraction及转染试剂均购自takara公司。
149.本发明所用序列：
150.seq id no.1：单链抗体fadv-4fiber1-scfv和重组抗体ab-fadv-4fiber1的重链氨基酸序列：
151.qkqlvesggrlvtpgaaltltctvsgidlnsygmswvrqapgkglewigmidttdivdyaswangrftiskssttvdlkiispttedtatyfcarssgsagvwgygmdpwgpgtlvtvssgqpkapsvfplapccgdtpsstvtlgclvkgylpepvtvtwnsgtltngvrtfpsvrqssglyslssvvsvtsssqpvtcnvahpatntkvdktvapstcskptcpppellggpsvfifppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvsqddpevqftwyinneqvrtarpplreqqfnstirvvstlpiahqdwlrgkefkckvhnkalpapiektiskargqplepkvytmgppreelssrsvsltcmingfypsdisvewekngkaednykttpavldsdgsyflysklsvptsewqrgdvftcsvmhealhnhytqksisrspgkapstcskptcppgqpkapsvfplapccgdtpsstvtlgclvkgylpepvtvtwnsgtltngvrtfpsvrqssglyslssvvsvtsssqpvtcnvahpatntkvdktvapstcskptcpppellggpsvfifppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvsqddpevqftwyinneqvrtarpplreqqfnstirvvstlpiahqdwlrgkefkckvhnkalpapiektiskargqplepkvytmgppreelssrsvsltcmingfypsdisvewekngkaednykttpavldsdgsyflysklsvptsewqrgdvftcsvmhealhnhytqksisrspgkgqpkapsvfplapccgdtpsstvtlgclvkgylpepvtvtwnsgtltngvrtfpsvrqssglyslssvvsvtsssqpvtcnvahpatntkvdktvapstcskptcpppellggpsvfifppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvsqddpevqftwyinneqvrtarpplreqqfnstirvvstlpiahqdwlrgkefkckvhnkalpapiektiskargqplepkvytmgppreelssrsvsltcmingfypsdisvewekngkaednykttpavldsdgsyflysklsvptsewqrgdvftcsvmhealhnhytqksisrspgk
152.其中，cdr1：gidlnsyg(seq id no.2)、cdr2：idttdiv(seq id no.3)、cdr3：arssgsagvwgygmdp(seq id no.4)
153.单链抗体fadv-4fiber1-scfv和重组抗体ab-fadv-4fiber1的重链可变区氨基酸序列(seq id no.5)：
154.qkqlvesggrlvtpgaaltltctvsgidlnsygmswvrqapgkglewigmidttdivdyaswangrftiskssttvdlkiispttedtatyfcarssgsagvwgygmdpwgpgtlvtvss
155.ch1(seq id no.6)：
156.gqpkapsvfplapccgdtpsstvtlgclvkgylpepvtvtwnsgtltngvrtfpsvrqssglyslssvvsvtsssqpvtcnvahpatntkvdktvapstcskptcpppellggpsvfifppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvsqdd
178.seq id no.20vh-scfv-f4
[0179]5’–
ggtgggggtggttcctctagatcttcccagtcggtggaggagtcc-3’[0180]
seq id no.21vh-scfv-r1
[0181]5’–
aggaggctattggccggcctggcctgargagayggtgaccagggtgcc-3’[0182]
seq id no.22vh-scfv-r2
[0183]5’–
aggaggctattggccggcctggccgcagcagggggccagtgggaagactga c-3’[0184]
seq id no.23vl-scfv-f1
[0185]5’–
aaaagaggcccaggcggccgagctcgtgmtgacccagactcca-3’[0186]
seq id no.24vl-scfv-f2
[0187]5’–
aaaagaggcccaggcggccgagctcgatmtgacccagactcca-3’[0188]
seq id no.25vl-scfv-f3
[0189]5’–
aaaagaggcccaggcggccgcycaagtgctgacccag-3’[0190]
seq id no.26vl-scfv-f4
[0191]5’–
aaaagaggcccaggcggccgcccwagtgatgacccag-3’[0192]
seq id no.27vl-scfv-r1
[0193]5’–
ggaagatctagaggaaccacccccaccaccgcccgagccaccgccaccttt gatttccacattggtgcc-3’[0194]
seq id no.28vl-scfv-r2
[0195]5’–
ggaagatctagaggaaccacccccaccaccgcccgagccaccgccacctag gatctccagctcggtccc-3’[0196]
seq id no.29重叠pcr-fp
[0197]5’‑
gaggaggaaaaagaggcccaggcggcc-3’[0198]
seq id no.30重叠pcr-rp
[0199]5’‑
agaggaggctattggccggcctggcc-3’[0200]
seq id no.31pcomb3xss-fp
[0201]5’–
gctggtttcgctaccgtggcccaggcggcc-3’[0202]
seq id no.32pcomb3xss-rp
[0203]5’–
gtgatggtgatggtgctggccggcctggcc-3’[0204]
seq id no.33fadv-4fiber 1蛋白的氨基酸序列
[0205]
msaliasaadtvsasgkkrprralsepsrylsegderrkpkrarpatrangplldlvypfdfnagggggsgggggggggqqiavdpdgpleltgdlltlntktpiyvsdravslliddntlatkqangalmvktaaplnsgtgggvtlgfdprtmaldsvtgvlkvlvdsqgplqadtggitlqfdtqdfvvnngvlalassvgptylspfatyevtpvlgisqrngnvkskglqnwsigyyiymvssaglvnglitlelahdltgasgensltsglnftfvlspmypietevnlslivpptvsptnqnhvfvpnsnqsdvgylglpphtrdnwyvpidspglrlvsfmptatgnekfgqgtlgycaatiqntssgttpsdaiaftvslpqtsgsnwfdqnapdtvvttgpipfsyqgyvyspngnnapgp
[0206]
鉴于本领域对于fadv-4检测性抗体的技术需求，本发明目的在于提供一种具有高活性和高特异性的fadv-4fiber 1蛋白的重组抗体，用于间接免疫荧光和间接elisa等特异性检测。
[0207]
本发明提供的基于fiber 1蛋白的检测4型禽腺病毒的抗体中所用原料及试剂均
可由市场购得。
[0208]
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
[0209]
实施例1动物免疫
[0210]
实验选用健康成年新西兰兔，免疫前静脉采血，分离血清作为阴性对照。取1
×
105tcid
50
/ml的fadv-4病毒在新西兰兔的后颈部注射，每周免疫一次，共免疫4次，在第0、7、14、21天的每次免疫前静脉采血0.5ml分离血清保存。第4次免疫后7天(即第28天)，静脉采血0.5ml分离血清保存。elisa结果显示接种第一次免疫后血清抗体滴度显著上升，第二次免疫后抗体滴度大于104，第三次免疫后超过6.4
×
104，第四次免疫后达1.28
×
105，与免疫之前血清抗体效价相比，均有显著提高(图1所示的a)，原始数据如表1所示。第28天处死新西兰兔，收集血液0.5ml分离血清保存，解剖并取出脾脏，用于淋巴细胞分离。
[0211]
表1禽腺病毒免疫兔子抗体效价
[0212] 阴性组一免二免三免四免兔12001600064000128000256000兔2200160001600064000128000兔3200160001600064000128000兔4200320006400064000128000
[0213]
实施例2淋巴细胞总rna的抽提及抗体轻重链基因的扩增
[0214]
用trizol试剂提取淋巴细胞总rna，以其为模板用oligo(dt)为引物反转录合成cdna。根据兔抗序列的轻重链框架区设计引物序列组合(引物序列为seq id no.17～seq id no.28)，进行pcr扩增抗体vh和vl的编码区。pcr反应条件为：95℃预变性体5min，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸60s，35个循环后，72℃再延伸5min。pcr产物经1％琼脂糖凝胶电泳验证在350bp左右有目的条带，纯化回收备用(图1所示的b)。
[0215]
实施例3fadv-4fiber 1-scfv抗体库的构建
[0216]
以纯化的vh和vl为模板，经重叠pcr后在vh和vl之间插入linker(序列为seq id no.16)，合成scfv片段vh-linker-vl，序列两端含有sfii限制性酶切位点。
[0217]
重叠延伸第一轮pcr：不加引物，98℃变性1min，45℃退火30s，72℃延伸1min，重复10个循环，最后72℃作用5min。加入引物重叠pcr-fp、重叠pcr-rp，98℃变性30s，然后58℃复性30s，72℃延伸1min，30个循环后72℃再延伸5min。pcr产物经1％琼脂糖凝胶电泳以胶回收的方式回收扩增产物，条带约800bp(图1所示的b)，保存于-20℃。重叠pcr引物序列为seq id no.29～seq id no.30。
[0218]
将胶回收后的pcr产物和pcomb3xss载体分别使用限制性内切酶sfii在50℃条件下酶切30min，酶切产物经1％琼脂糖凝胶电泳验证后柱回收纯化并用t4 dna连接酶连接得到fadv-4fiber 1-scfv-pcomb3xss文库。连接产物转化至er2738感受态细胞中，用四环素和氨苄青霉素抗性2yt(2
×
yeast extract and tryptone)固体培养基筛选阳性克隆。随机挑选文库中的20个单克隆进行pcr鉴定(引物序列为seq id no.31～seq id no.32)，计算得抗体库重组率为65％(图2所示的a)。将固体培养基上的所有克隆用2yt培养基洗下，4℃保存。
[0219]
实施例4噬菌体的扩增
[0220]
从上述用2yt培养基洗下的所有克隆的文库菌液中取2ml，接种于50ml 2yt液体培
养基中，37℃200rpm活化至od
600
达到0.8～1.0，加入终浓度为1
×
10
12
pfu/ml的m13k07辅助噬菌体进行侵染，静置30min后加入卡那霉素(终浓度为50μg/ml)，在30℃200rpm培养过夜。次日10000rpm 4℃离心20min，保留上清液并向其中加入1/2体积的peg8000，在冰上静置2h使噬菌体沉淀。10000rpm 4℃离心20min，弃上清。用5ml pbs使沉淀重悬，并加入3ml peg8000复沉，重复离心操作后，用4ml pbs重悬沉淀并过滤除菌后，保存于4℃备用。
[0221]
实施例5fadv-4fiber 1-scfv筛选
[0222]
提前将fadv-4fiber 1蛋白生物素化。扩增的scfv文库噬菌体、标记了fadv-4fiber1蛋白的dynabeads m-280磁珠和2％脱脂奶粉封闭液混合后，25℃
±
5℃孵育1h，磁珠用pbst洗涤5～10次。用0.1mol/l glycine-hcl(ph＝2.0)洗脱磁珠表面噬菌体，洗脱后用1mol/l tris中和至ph为7.0。用洗脱后中和的噬菌体感染对数生长期的er2738感受态细胞，在2yt固体培养基上培养富集，收获菌落进行下一轮筛选。
[0223]
重复上述实验两次。从两轮富集亲和筛选文库中分别随机挑选20个单克隆进行pcr验证，结果显示所建fadv-4fiber 1-scfv文库第一轮淘选测得阳性率达90％，第二轮淘选测的阳性率达100％(图2所示的b和所示的c)。
[0224]
实施例6phage elisa
[0225]
将纯化的fadv-4fiber 1抗原按每孔50μg/ml的浓度包被酶标板，4℃过夜。用含有0.05％tween-20的pbst溶液洗涤5次，弃pbst，加入2％脱脂奶粉封闭液，37℃封闭1h。用pbst溶液洗涤5次，拍干孔中残留液体，将待筛阳性克隆抗体上清和2％脱脂奶粉封闭液按照3：2比例混合，25℃
±
5℃静置10min去干扰化处理后，加入酶标板中，37℃孵育1h。用pbst溶液洗涤5次，拍干孔中残留液体，加入标记hrp的鼠抗m13k07抗体(用封闭液1：3000稀释)，37℃孵育1h。用pbst溶液洗涤5次，拍干孔中残留液体，加入tmb显色液，避光静置15min后，加入2mol/l h2so4终止显色，读取450nm处吸光度(表2，加粗序号所示，从左往右递增，从上往下递增)。如图2所示的d显示，筛选到2株高亲和力抗体，选择亲和力更高的10号用于后续实验。
[0226]
表2ab-fadv-4fiber 1与抗原fadv-4fiber 1的亲和力检测
[0227] 12345678910111210.04560.04730.0460.04670.05490.0470.0450.04830.25340.73210.04430.0421 130.0510.05170.04320.04450.31420.24880.05320.14430.06750.05340.15480.0451 250.05470.04190.27680.04910.06030.05170.04890.04990.0540.36060.04930.0509 370.03360.02360.02520.02110.02280.10690.02390.04590.21680.01670.01840.0152 490.06210.05470.05680.05610.06040.05960.05210.0520.61470.05740.06070.0622 610.05680.05310.05390.05270.06180.05590.05330.05320.05660.05360.05380.064 730.06530.06090.05710.06670.26150.05720.06020.06050.24050.05760.05860.0593 850.0640.05540.05840.06220.05370.2890.09230.05520.05360.25430.0540.0503
[0228]
实施例7fadv-4fiber 1重组抗体ab-fadv-4fiber 1的重组、表达及纯化
[0229]
扩增并纯化单链抗体scfv的vh和vl序列，用ecori和hindiii限制性内切酶对含有鼠抗体骨架的ptt5-v7与ptt5-v8载体进行双酶切，经同源重组得到抗体表达质粒vh-ptt5-v7和vl-ptt5-v8。将重组质粒vh-ptt5-v7和vl-ptt5-v8并通过pei共转染至hek293f细胞中进行真核表达。48h后10000rpm 4℃离心20min收集培养液上清，利用protein a亲和层析柱纯化抗体，最终用pbs溶液保存融合蛋白。
[0230]
将纯化后的样品加入还原型蛋白上样缓冲液，变性后进行sds-page电泳检测，结
果如图3所示的a所示，抗体的重链和轻链之间的二硫键被还原，在50kda和25kda左右处检测到目的条带，与预期结果一致。
[0231]
实施例8间接elisa法检测重组抗体ab-fadv-4fiber 1与fadv-4fiber 1抗原的结合
[0232]
采用间接elisa方法测定ab-fadv-4fiber 1与抗原fadv-4fiber 1的亲和力。酶标板中加入抗原孵育，4℃过夜，用2％脱脂奶粉封闭液37℃封闭2h。用2％脱脂奶粉将抗体稀释12个梯度加入孔中，37℃孵育1h。加入hrp标记羊抗鼠igg二抗，用tmb进行显色反应，并在酶标仪中检测450nm波长处吸光度(表3)。
[0233]
检测上述抗体ab-fadv-4fiber 1结合效果如图3所示的b所示，量效曲线与回归模型成功拟合，ab-fadv-4fiber 1能够有效结合fadv-4fiber 1蛋白，抗体ab-fadv-4fiber1和重组表达fadv-4fiber 1蛋白的结合的ec
50
为1.95
×
10-1
μg/ml，表明该重组抗体具有活性且亲和力良好。
[0234]
表3抗体ab-fadv-4fiber 1和抗原fadv-4fiber 1的结合的ec
50
[0235][0236]
实施例9间接免疫荧光检测重组抗体
[0237]
使用含有10％fbs的dmem/f12复苏lmh贴壁细胞，待细胞融合度达到80～90％时，接种moi为0.1的fadv-4毒液，于37℃5％co2培养箱感染1h后弃掉培养液，加入2％fbs dmem/f12，于细胞培养箱中培养，同时设置未感染fadv-4病毒的lmh细胞作为阴性对照。5天后用pbs洗涤细胞3次，加入300μl 4％多聚甲醛固定细胞，30min后用pbs洗涤细胞3次。加入500μl 0.1％tritonx100，15min后用pbs洗涤细胞3次。用含3％酪蛋白钠的pbs于37℃封闭1h，用pbs洗涤3次。将重组抗体ab-fadv-4fiber 1作为间接免疫荧光的一抗，浓度为1μg/ml，37℃孵育1h，二抗为羊抗鼠fitc，37℃孵育1h，使用倒置荧光显微镜观察(图3所示的c)。如图3所示的c所示，重组抗体ab-fadv-4fiber 1可以特异性地检测fadv-4病毒，反应结果显示为阳性，证明该重组抗体特异性高，可以应用于禽腺病毒fadv-4的特异性检测。
[0238]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

技术特征：
1.单链抗体，其特征在于，其包括重链和轻链：所述重链的cdr区包括cdr1、cdr2和cdr3：(ⅰ)、所述重链的cdr1具有如seq id no.2所示的氨基酸序列；和(ⅱ)、所述重链的cdr2具有如seq id no.3所示的氨基酸序列；和(ⅲ)、所述重链的cdr3具有如seq id no.4所示的氨基酸序列；或(ⅳ)、在如(ⅰ)～(ⅲ)任一项所示的氨基酸序列的基础上经取代、缺失、添加和/或替换1个或多个氨基酸的序列；或(v)、与如(ⅰ)～(ⅳ)任一项所示的氨基酸序列同源性80％以上的序列；所述轻链的cdr区包括cdr1、cdr2和cdr3：(ⅵ)、所述轻链的cdr1具有如seq id no.11所示的氨基酸序列；和(ⅶ)、所述轻链的cdr2具有如seq id no.12所示的氨基酸序列；和(
ⅷ
)、所述轻链的cdr3具有如seq id no.13所示的氨基酸序列；或(
ⅸ
)、在如(ⅵ)～(
ⅷ
)任一项所示的氨基酸序列的基础上经取代、缺失、添加和/或替换1个或多个氨基酸的序列；或(
ⅹ
)、与如(ⅵ)～(
ⅸ
)任一项所示的氨基酸序列同源性80％以上的序列。2.如权利要求1所述的单链抗体，其特征在于，其重链可变区具有：(ⅰ)、如seq id no.5所示的氨基酸序列；或(ⅱ)、在如(ⅰ)所示的氨基酸序列的基础上经取代、缺失、添加和/或替换1个或多个氨基酸的序列；或(ⅲ)、与如(ⅰ)所示的氨基酸序列同源性80％以上的序列；其轻链可变区具有：(ⅳ)、如seq id no.14所示的氨基酸序列；或(
ⅴ
)、在如(ⅳ)所示的氨基酸序列的基础上经取代、缺失、添加和/或替换1个或多个氨基酸的序列；或(ⅵ)、与如(ⅳ)所示的氨基酸序列同源性80％以上的序列。3.如权利要求2所述的单链抗体，其特征在于，所述重链可变区与轻链可变区由连接肽linker连接；所述连接肽linker具有：(ⅰ)、如seq id no.16所示的氨基酸序列；或(ⅱ)、在如(ⅰ)所示的氨基酸序列的基础上经取代、缺失、添加和/或替换1个或多个氨基酸的序列；或(ⅲ)、与如(ⅰ)所示的氨基酸序列同源性80％以上的序列。4.核酸分子，其特征在于，编码如权利要求1至3任一项所述的单链抗体。5.表达元件，其特征在于，其包括启动子、终止子和权利要求4所述的核酸分子。6.表达载体，其特征在于，包括如下任意项以及可接受的载体：(ⅰ)、如权利要求4所述的核酸分子；和/或(ⅱ)、如权利要求5所述的表达元件。7.重组抗体，其特征在于，包括表达如权利要求6所述的表达载体。8.宿主，其特征在于，包括如下任意项：
(ⅰ)、如权利要求1至3任一项所述的单链抗体；和/或(ⅱ)、如权利要求4所述的核酸分子；和/或(ⅲ)、如权利要求5所述的表达元件；和/或(ⅳ)、如权利要求6所述的表达载体；和/或(
ⅴ
)、如权利要求7所述的重组抗体。9.如下任意项在制备特异性检测4型禽腺病毒的产品中的应用：(ⅰ)、如权利要求1至3任一项所述的单链抗体；和/或(ⅱ)、如权利要求4所述的核酸分子；和/或(ⅲ)、如权利要求5所述的表达元件；和/或(ⅳ)、如权利要求6所述的表达载体；和/或(
ⅴ
)、如权利要求7所述的重组抗体；和/或(ⅵ)、如权利要求8所述的宿主；所述特异性检测的方法包括间接免疫荧光和间接elisa。10.检测4型禽腺病毒的产品，其特征在于，包括如下任意项：(ⅰ)、如权利要求1至3任一项所述的单链抗体；和/或(ⅱ)、如权利要求4所述的核酸分子；和/或(ⅲ)、如权利要求5所述的表达元件；和/或(ⅳ)、如权利要求6所述的表达载体；和/或(
ⅴ
)、如权利要求7所述的重组抗体；和/或(ⅵ)、如权利要求8所述的宿主。

技术总结
本发明涉及生物技术检测领域，具体涉及基于Fiber1蛋白的检测4型禽腺病毒的抗体。本发明中所述抗体是基于Fiber1蛋白作为禽腺病毒重要的免疫原性蛋白，在禽腺病毒I群不同血清型毒株之间相对保守，所制备的重组抗体具有良好的特异性和稳定性，不仅可以用于禽腺病毒I群的间接免疫荧光，还可以用于间接ELISA检测，具有广泛的应用前景。具有广泛的应用前景。


技术研发人员：周宇杭 查丽莎 郑琪 黄茜
受保护的技术使用者：深圳赫兹生命科学技术有限公司
技术研发日：2023.06.30
技术公布日：2023/10/5