二丙基二硫醚在促进番茄生长中的应用

1.本发明属于生物技术领域，具体涉及二丙基二硫醚在促进番茄生长中的应用。


背景技术：

2.番茄是重要蔬菜之一。近年来，由于农民对经济效益的高追求，连作目前成为番茄栽培的主要方式。然而，当同一作物或其相关物种在同一土壤上连续种植时，即使进行正常的栽培管理方式，也会出现土壤理化性质劣变、土壤有害微生物富集、自毒物质产生和病虫害加重等现象，随即引发严重的连作障碍。最终会影响番茄生长，导致番茄果实质量和产量降低。
3.植物共存于不同的群落中，通过产生和释放次生代谢物质，如挥发性有机化合物(vocs)，可以感知和识别群落中同种或异种植物，并与其他植物相互作用，以创造和/或维持合适的生活条件。挥发性有机化合物是植物与其物理和生物环境之间相互作用的重要介质。越来越多的研究证明植物挥发物在植物间通信中发挥着重要的信号传递作用，正是通过这些空气传播的信号物质，如乙烯、茉莉酸甲酯、水杨酸甲酯、吲哚和几种挥发性萜烯的产生、释放和传递，最终被受体植物感知，这在很大程度上驱动了植物与植物的相互作用，实现了植物间的信息交流。研究表明，这类vocs也可以影响受体植物的防御和生长，当vocs被受体植物所感知，受体植物会及时做出响应，调整自身生长方式，如斑点矢车菊释放的主要挥发性物质β-石竹烯促进了同域邻近植物的种子萌发和生长；暴露于洋葱挥发物中的马铃薯，会改变其生理特征，从而避免了植食性昆虫的取食；同时，兰草的挥发物诱导了花生生理的变化，增加了花生根系分泌有机酸的量，有机酸含量的增加可能促进了花生根际对生物胁迫的抗性。
4.番茄作为人们生活中极为重要的一种蔬菜，其产量和品质需求较高。如果能够提供一种可以提高番茄对土传病原菌的抗性，或者可以参与调控番茄生长的vocs，无疑将对番茄种植业的发展具有十分重要的意义。


技术实现要素：

5.为解决现有技术中的上述问题，本发明提供了二丙基二硫醚在促进番茄生长中的应用，通过在番茄生长过程中外源添加挥发性有机化合物二丙基二硫醚，有效地提高番茄对病害的抗性，促进番茄的生长。
6.为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：
7.本发明提供了二丙基二硫醚在促进番茄生长中的应用。
8.作为本发明的优选方案，所述番茄为盆栽番茄；具体应用方法为：将二丙基二硫醚溶解于表面活性剂中，加水，得到二丙基二硫醚溶液，之后将所述溶液置于容器中，并使二丙基二硫醚从容器中向外挥发，将装有二丙基二硫醚溶液的容器置于盆栽番茄植株根部即可。
9.作为本发明的优选方案，所述二丙基二硫醚的纯度为99wt％，所述表面活性剂为
tween-80，所述二丙基二硫醚与所述表面活性剂的质量比为1∶(1.5～2.5)，所述二丙基二硫醚溶液的浓度为8～12mmol/l。
10.作为本发明的优选方案，二丙基二硫醚向外挥发的速度为0.8～1.3μmol/l。
11.作为本发明的优选方案，所述容器距离番茄植株的水平距离为4～5cm。
12.作为本发明的优选方案，在番茄植株定植缓苗后将装有二丙基二硫醚溶液的容器置于番茄植株根部。
13.作为本发明的优选方案，二丙基二硫醚向外挥发的时间为从定植缓苗后开始，直至番茄采收为止。
14.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
15.本发明运用一种安全、高效的有机化合物-二丙基二硫醚，通过外源添加的方法，诱导番茄提高了根系分泌苯丙氨酸、脯氨酸的含量，显著提高了番茄根际土壤微生物中细菌和真菌的菌群丰度，改变了细菌和真菌群落结构，改善番茄根际微生态环境，促进了番茄生长，提高了番茄对病害的抗性。
附图说明
16.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
17.图1为实施例1中的试验装置示意图，其中a为外源添加二丙基二硫醚，b为不添加二丙基二硫醚；
18.图2为实施例1中，二丙基二硫醚对番茄株高和生物量的影响结果图；
19.图3为实施例1中，外源添加二丙基二硫醚及不添加二丙基二硫醚的番茄植株根际细菌群落α-多样性测试结果图；
20.图4为实施例1中，外源添加二丙基二硫醚及不添加二丙基二硫醚的番茄植株基于bray-curtis距离差异的番茄根际细菌群落β-多样性的主坐标分析结果图；
21.图5为实施例1中，二丙基二硫醚对番茄根际土壤中细菌、真菌菌群丰度的影响结果图；
22.图6为实施例2中，二丙基二硫醚对番茄根系分泌物中苯丙氨酸、脯氨酸的影响；
23.图7为实施例3中，灭菌土壤中二丙基二硫醚对番茄生长的影响结果图。
具体实施方式
24.现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。
25.另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
26.除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
27.在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
28.关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
29.以下实施例中，所采用的原料均为市售。
30.实施例1
31.二丙基二硫醚对番茄根际微生物菌群的影响
32.将二丙基二硫醚(纯度99wt％)以1:2(w/w)的比例溶解在tween-80中，然后加入蒸馏水得到10mmol/l的二丙基二硫醚溶液，4℃保存，用于接下来的实验。采用盆栽的方式，土壤收集于东北农业大学试验站番茄连作温室上层土壤(0-15cm)。对收集的连作土壤过2mm筛，并将所有试验用土充分混合均匀，备用。番茄种子温汤浸种半个小时后置于灭菌土中进行萌发，待两片真叶时分苗到营养钵中。待番茄4片真叶时移栽到手工制作的装有1kg土的38μm大小尼龙膜袋中，将5ml的二丙基二硫醚溶液装入小玻璃瓶，玻璃瓶口用橡胶瓶塞封住，在橡胶瓶塞间插入10ul移液枪头，以同体积的tween-80作为对照，将玻璃瓶放置在尼龙袋外、距离番茄植株5cm处，试验装置示意图如图1所示(其中a为外源添加二丙基二硫醚；b中不添加二丙基二硫醚，容器中为同体积的tween-80，a和b中，容器与番茄根部的水平距离为5cm、与根部的竖直距离为5cm)。试验共设2个处理：(1)外源添加二丙基二硫醚(挥发物)；(2)不添加二丙基二硫醚(对照)，每套装置移栽一株番茄。处理(1)中，每两天更换一瓶二丙基二硫醚溶液(溶液中的二丙基二硫醚两天恰好挥发完全)，番茄定植20d后，测量番茄株高及生物量，具体方法为：取番茄植株后进行清洗，将样品先在105℃下杀青30分钟，而后调制60℃烘干至恒重，最后称取植株生物量。测量结果如图2所示。图2中，横坐标“对照”代表不添加二丙基二硫醚的番茄植株的测试结果，“挥发物”代表外源添加二丙基二硫醚的番茄植株的测试结果。由图2可以看出，二丙基二硫醚处理显著提高番茄生物量，促进了番茄生长。采用抖根法取番茄根际土壤样品，土壤过2mm土样筛，同一处理的5株混匀在一起作为一个生物学重复，每处理三次重复。根际土于-80℃冰箱保存，提取dna，用于土壤微生物的测定。
33.土壤微生物菌群丰度的测定
34.土壤dna的提取
35.称取番茄根际土壤0.25g。采用powersoil dna isolation kit(mo bio laboratories,ca,usa)试剂盒提取土壤总dna。保存在-20℃冰箱用于后续试验。
36.标准曲线的绘制
37.标准曲线的制备：扩增土壤中的细菌、真菌的相应基因片段，作为各自的模板。包括：pcr扩增清晰单一目的条带，然后在紫外成像仪下切胶回收，用试剂盒进行纯化和连接转化过程、涂布平板后进行蓝白斑筛选、用阳性克隆培养后提取质粒，将浓度与纯度适宜的
质粒以10倍梯度稀释成一系列的标准样品，保存在-20℃冰箱中。以相连的至少五个点为一个标准曲线，荧光定量pcr时与土壤样品同时进行。
38.质粒浓度(ng/μl)换算成模板拷贝数浓度(cn)的公式
75.[0039][0040]
real-time pcr分析
[0041]
细菌：20μl反应体系包含2μl dna，9μl sybr mixture，0.2/0.2μl(10mm)上/下游引物，其余体积以去离子水补齐。反应条件：95℃预变性5min，95℃变性50s，62℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环，72℃终延伸10min。真菌：20μl反应体系包含2μl dna，9μl sybr mixture，0.25/0.25μl(10mm)上/下游引物，其余体积以去离子水补齐。反应条件：94℃预变性5min，94℃变性1min，58℃退火1min，72℃延伸1min，31个循环，72℃终延伸10min。
[0042]
miseq高通量测序分析
[0043]
细菌采用338f/806r序列：338f(5
’‑
actcctacgggaggcagcag-3’)，806r(5
’‑
ggactachvgggtwtctaat-3’)对细菌16s rrna v3-v4区进行pcr扩增，使用2％琼脂糖凝胶电泳对pcr扩增产物进行鉴定和分离条带，随后使用dna胶纯化试剂盒(agarose gel dna purificaion kit，takara)对pcr产物进行纯化。然后对纯化后的产物进行高通量测序，数据结果使用qiime(quantitative insights into microbial ecology，version 1.9.0)软件进行质控以及分析。
[0044]
真菌采用its1f/its2r序列：its1f(5
’‑
cttggtcatttagaggaagtaa-3’)，its2r(5
’‑
gctgcgttcttcatcgatgc-3’)对真菌its1区进行pcr扩增，使用2％琼脂糖凝胶电泳对pcr扩增产物进行鉴定和分离条带，随后使用dna胶纯化试剂盒(agarose gel dna purificaion kit，takara)对pcr产物进行纯化。然后对纯化后的产物进行高通量测序，数据结果使用qiime(quantitative insights into microbial ecology，version 1.9.0)软件进行质控以及分析。
[0045]
采用上述方法对外源添加二丙基二硫醚及不添加二丙基二硫醚的番茄植株根际细菌群落α-多样性分析结果如图3所示；外源添加二丙基二硫醚及不添加二丙基二硫醚的番茄植株基于bray-curtis距离差异的番茄根际细菌群落β-多样性的主坐标分析结果如图4所示；二丙基二硫醚对番茄根际土壤中细菌、真菌菌群丰度的影响结果如图5所示。图3及图5中，横坐标“对照”代表不添加二丙基二硫醚的番茄植株的测试结果，“挥发物”代表外源添加二丙基二硫醚(+orsv)的番茄植株的测试结果。由3可以看出，二丙基二硫醚处理显著提高番茄根际细菌群落out数量。由图4可以看出，基于bray-curtis差异的主坐标分析(pcoa)表明，二丙基二硫醚处理的细菌群落与未添加对照的细菌群落明显不同。由图5可以看出，二丙基二硫醚处理的番茄根际细菌、真菌菌群丰度显著高于未添加处理。
[0046]
实施例2
[0047]
二丙基二硫醚对番茄根系分泌物中苯丙氨酸、脯氨酸的影响
[0048]
利用上述的试验装置研究二丙基二硫醚对番茄根系分泌氨基酸的影响，将4片真叶的番茄苗定植于装有1kg灭菌土壤的38μm大小尼龙膜袋中，试验共设2个处理：(1)外源添加二丙基二硫醚(挥发物)；(2)不添加二丙基二硫醚(对照)。番茄定植20d后，收集番茄根系分泌物，用于分析番茄根系分泌氨基酸组分。收集方法如下：用流水冲洗干净从塑料盆中小
心收集的番茄地下部，直至根系表面干净。同一处理5棵植株放入一个装有200ml无菌去离子水的250ml烧杯，记录水位，每杯水中含0.5mm氯化钙以维持根系渗透压。为防止光和灰尘进入，采用锡纸包围。在植物培养箱光照条件下收集，及时补充水分至原水位。6个小时后取出植株并擦干水分，剪取地下部并称重获得根鲜重数据，据此调整根系分泌物浓度至1g鲜重
·
10ml-1
。之后将根系进行烘干用于测定根干重。最后过0.22μm微孔滤膜，-20℃保存备用。通过测定根系分泌物总碳含量来标准化各处理根系分泌物。然后每培养皿装入20ml各处理根系分泌物，保鲜膜封口后用牙签扎孔，-20℃冷冻后放入冻干机。冻干结束后往每皿里加1ml无菌超纯水，得到番茄根系分泌物浓缩液。对浓缩液中的氨基酸种类及含量进行检测并分析，发现两种处理所得根系分泌物浓缩液中，苯丙氨酸和脯氨酸含量具有较大差异，如图6所示，由图6可以看出：二丙基二硫醚处理显著提高番茄根系分泌物中苯丙氨酸、脯氨酸含量。
[0049]
实施例3：灭菌土壤中二丙基二硫醚对番茄生长的影响
[0050]
利用上述的试验装置研究灭菌土壤中二丙基二硫醚对番茄生长的影响，将4片真叶的番茄苗定植于装有1kg灭菌土壤的38μm大小尼龙膜袋中，在土壤中分别浇灌浓度为107cfu/g pgpr悬浮液，每株番茄浇灌20ml，充分混匀，外源接种的pgpr菌株分别为已分离鉴定出的芽孢杆菌(b1)、假单胞菌(p8)。试验共设6个处理：(1)不接菌/外源添加二丙基二硫醚(0pt+)，(b)不接菌/不添加二丙基二硫醚(0pt-)，(c)接b1菌株/外源添加二丙基二硫醚(1pt+)，(d)接b1菌株/不添加二丙基二硫醚(1pt-)，(e)接p8菌株/外源添加二丙基二硫醚(8pt+)，(f)接p8菌株/不添加二丙基二硫醚(8pt-)，每套装置移栽一株番茄。番茄定植20d后，取出番茄植株，测量生物量等相关指标，结果如图7所示。由图7可以看出：分别接种b1和p8的情况下，二丙基二硫醚处理显著提高番茄地上、地下和全株生物量。
[0051]
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围内。

技术特征：
1.二丙基二硫醚在促进番茄生长中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述番茄为盆栽番茄；具体应用方法为：将二丙基二硫醚溶解于表面活性剂中，加水，得到二丙基二硫醚溶液，之后将所述溶液置于容器中，并使二丙基二硫醚从容器中向外挥发，将装有二丙基二硫醚溶液的容器置于盆栽番茄植株根部即可。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述二丙基二硫醚的纯度为99wt％，所述表面活性剂为tween-80，所述二丙基二硫醚与所述表面活性剂的质量比为1∶(1.5～2.5)，所述二丙基二硫醚溶液的浓度为8～12mmol/l。4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，二丙基二硫醚向外挥发的速度为0.8～1.3μmol/h。5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述容器距离番茄植株的水平距离为4～5cm。6.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，在番茄植株定植缓苗后将装有二丙基二硫醚溶液的容器置于番茄植株根部。7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，二丙基二硫醚向外挥发的时间为从定植缓苗后开始，直至番茄采收为止。

技术总结
本发明公开了二丙基二硫醚在促进番茄生长中的应用，属于生物技术领域。具体应用方法为：将二丙基二硫醚溶解于表面活性剂中，加水，得到二丙基二硫醚溶液，之后将所述溶液置于容器中，并使二丙基二硫醚以气体的形式从容器中向外挥发，将装有二丙基二硫醚溶液的容器置于番茄植株根部即可。本发明通过外源添加二丙基二硫醚的方法，诱导番茄提高了根系分泌苯丙氨酸、脯氨酸的含量，显著提高了番茄根际土壤微生物中细菌和真菌的菌群丰度，改变了细菌和真菌群落结构，诱导番茄代谢变化，改善番茄根际微生态环境，促进了番茄生长，提高了番茄对病害的抗性。害的抗性。害的抗性。


技术研发人员：周新刚 金雪 张敬禹 张鲜红 冉令义 吴凤芝 高丹美
受保护的技术使用者：东北农业大学
技术研发日：2023.06.30
技术公布日：2023/10/5