一种基于点击化学和氧化石墨烯检测碱性磷酸酶的方法

1.本发明属于生物分析检测技术领域，具体涉及一种基于点击化学和氧化石墨烯检测碱性磷酸酶的方法。


背景技术：

2.碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，alp)是一种定位于多个哺乳动物细胞和器官的金属酶，有一个含金属的活性位点，每个单体包含两个zn
2+
和一个mg
2+
。alp可以催化多类磷酸单酯的水解，并参与信号转导、分子转运、物质代谢等多种生物过程。成人血清中alp正常值为40～190u/l，alp活性水平异常与心血管疾病、糖尿病、癌症、阿尔茨海默病、低磷酸缺乏症、溶血、牙周炎、骨损伤、肝功能障碍等疾病密切相关，alp作为一种生物标志物被广泛用于相关疾病的临床诊断和治疗的研究中，因此alp的检测对临床诊断和生物医学研究具有重要意义。
3.目前在生物医学研究中迫切需要通过快速准确的方法来检测细胞外或细胞内以及组织、体液中的alp，因此各种生物分析方法已被用于检测alp，例如电分析方法、表面增强拉曼散射、酶联免疫吸附试验(elisa)、放射免疫试验、石英晶体微量天平、场效应晶体管(fet)、比色法、磁性共振成像和荧光方法等。然而上述各种生物分析方法大多存在灵敏度不高、抗干扰能力差、步骤繁琐、需要大型仪器、成本高等缺陷。近些年，随着荧光探针技术的快速发展，方便快捷、高灵敏度等优点使荧光法检测alp成为了研究热点。
4.点击化学(click chemstry)是在2001年由诺贝尔化学奖获得者k.b.sharpless引入的一个合成概念，该类反应可通过小单元拼接来快速可靠地完成化学合成过程，且具有产率高、副产物无害、原料试剂易得、合成反应快速等优点，在化学合成、药物开发、生物医用材料等诸多领域得到广泛的应用。点击化学最为经典的代表反应就是铜催化的叠氮炔基环加成反应(copper-catalyzed azide-alkyne cycloadddition，cuaac)，该反应具有反应高效、条件温和、产物收率高和后处理简单等特点。
5.石墨烯被视为目前世界上最薄和最理想的新型二维纳米材料，目前，石墨烯及其衍生物在荧光分析方法中也得到了广泛的应用，例如石墨烯量子点(gqds)具有优良的荧光性，可作为荧光探针使用；氧化石墨烯(graphene oxide，go)由于拥有丰富的氧官能团(如羧基和环氧基)在水溶液和其他溶剂中表现出巨大的分散性和溶解性，能有效猝灭荧光基团，在分析方法的构建中作为荧光猝灭剂而被广泛应用。氧化石墨烯因其具有良好的的吸附能力和猝灭效果，该试剂在荧光传感方面有着巨大的应用前景，尤其是氧化石墨烯对单链dna具有较强的吸附性能力，而对双链吸附能力较弱。
6.在本技术中，申请人基于点击化学反应连接dna和氧化石墨烯对单双链dna的吸附能力不同的特点提出一种简便检测alp的方法，该方法具有反应条件温和、抗干扰能力强、稳定性好、成本低等特点。


技术实现要素：

7.本发明提供了一种基于点击化学和氧化石墨烯检测碱性磷酸酶的方法，以解决现有技术中基于荧光检测碱性磷酸酶的方法检测抗干扰能力差、需要大型仪器、灵敏度低、稳定性差、成本高等问题。
8.为了解决上述问题，本发明提供如下技术方案：
9.一种基于点击化学和氧化石墨烯检测碱性磷酸酶的方法，包括以下步骤：
10.步骤一：将测试样品分别与2-磷酸-抗坏血酸(aap)混合，置于水浴中充分反应；
11.步骤二：将修饰了叠氮基团且短的单链核酸、修饰了炔基基团且短的单链核酸和作为连接模板且修饰了荧光基团的核酸分别溶解在纯水中配制成核酸溶液；
12.步骤三：将步骤二配制的三种核酸溶液混合，配制成核酸混合溶液，然后向核酸混合溶液中加入步骤一反应好的测试样品与aap的反应液、铜离子和tris-hcl缓冲溶液，形成反应体系；
13.步骤四：向步骤三的反应体系中加入纯水、氧化石墨烯、tris-hcl缓冲溶液，升温后对检测体系的荧光强度进行检测；
14.步骤五：以已知碱性磷酸酶浓度的样品和对应的荧光强度值所建立的标准曲线，来检测未知碱性凝酸酶浓度的待测样品，待测样品按照步骤一至步骤四操作得到荧光强度，计算得到其中含有碱性凝酸酶的浓度。
15.本发明的工作原理和有益效果：
16.本技术先将测试样品和磷酸化的抗坏血酸，在酶合适的反应温度下水浴一定时间；同时将修饰了叠氮基团且短的单链核酸、修饰了炔基基团且短的单链核酸和作为连接模板且修饰了荧光基团的核酸分别溶解在纯水中配制成核酸溶液；然后将核酸溶液和作为连接模板的修饰了荧光基团的长链核酸溶液混合，配制成核酸混合溶液，向核酸混合溶液中加入测试样品与磷酸化的抗坏血酸反应液、铜离子和三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(tris-hcl)缓冲溶液，形成反应体系；在适宜的温度下反应一段时间后，将反应体系、水、氧化石墨烯和tris-hcl缓冲溶液混合，形成检测体系，升高温度，对检测体系的强度进行荧光检测；以已知碱性磷酸酶浓度为横坐标，相对的荧光强度值为纵坐标，绘制标准曲线，得到碱性磷酸酶浓度和荧光强度之间的线性关系方程，然后根据测试样品的荧光强度，计算得出对应的测试样品中碱性磷酸酶的浓度。
17.本方案中2-磷酸-抗坏血酸(aap)是磷酸化的抗坏血酸，有碱性磷酸酶(alp)存在时，aap可以被alp水解成抗坏血酸(aa)，aa具有还原性，从而可以将二价铜离子还原成一价铜，从而催化“点击化学”叠氮炔基环加成反应(cuaac)的发生，即催化相邻的叠氮和炔基之间发生环加成反应，将两个分别标记有叠氮基和炔基的dna短单链形成的缺口通过化学键连接，继而和标记有荧光基团的长单链dna形成稳定的dna双链，其熔解温度将远远高于两条短单链与作为模板的长单链之间的熔解温度；若无alp，aap无法水解成aa还原铜离子，则cuaac反应将不发生；体系升高合适温度后，因没有发生cuaac反应而带有缺口的dna双链将变为三条单链，而发生了cuaac反应后因其熔解温度较高，其双链结构将稳定存在，此时再利用氧化石墨烯对单双链dna吸附力的不同而对荧光的猝灭程度不同，没有发生cuaac反应荧光弱，发生cuaac反应则荧光强，其荧光强弱与体系中alp浓度呈正相关，从而可以通过荧光强弱检测alp浓度。
18.和现有技术相对比，本发明利用点击化学来连接核酸的反应和氧化石墨烯的猝灭作用，反应条件温和、抗干扰能力强、稳定性好、不需要大型仪器；本发明所用材料试剂均为市售，成本低、性质稳定，不需要复杂繁琐的制备过程和预处理过程，只需要简单的溶液混合和溶液的温育过程，操作简便、采用的是标记了广泛应用的荧光基团的dna长单链，生物适应性强，基本无毒害，检测过程简单；同时，本发明采用的是荧光增强模式，能大大降低出现假阳性信号的可能性；本发明的检测方法具有高特异性、稳定性好、成本低、操作简单等特点，在0～1u/ml范围内有很好的线性响应，检测限低至0.0036u/ml。
19.优选的，所述步骤一中aap的浓度为0.5mm～10mm，水浴反应温度为20℃～50℃，反应时间为10min～50min。
20.优选的，所述步骤二中作为连接模板的核酸包括tm值40℃的一条长单链和tm值20℃的两条短单链。
21.优选的，步骤三中修饰了叠氮基团且短的单链核酸、修饰了炔基基团且短的单链核酸和作为连接模板核酸之间的浓度比例为(1～6)：(1～6)：1。
22.优选的，步骤三反应体系中，修饰了叠氮基团且短的单链核酸和修饰了炔基基团且短的单链核酸的终浓度相同，终浓度均为10nm～80nm；作为连接模板且修饰了荧光基团的核酸终浓度为5nm～30nm。
23.优选的，所述步骤三的反应体系中，铜离子浓度为5μm～20μm，tris-hcl缓冲溶液的盐浓度为10mm～60mm，ph 6.6～8.2；形成反应体系的反应时间为20min～5h，反应温度为10℃～40℃。
24.优选的，所述步骤三中氧化石墨烯为荧光猝灭剂，其用量为浓度为0.5mg/ml的氧化石墨烯2μl～20μl。
25.优选的，所述步骤四检测体系中，tris-hcl缓冲溶液的盐浓度为100mm～500mm，ph6.6～8.2，所述步骤四荧光强度检测时间为10min～50min，检测温度为20℃～50℃。
26.优选的，修饰了叠氮基团的短的单链核酸为5
’‑
gat cta aat tcc aa-叠氮-3’、5
’‑
叠氮-tgg caa cag c-3’、5
’‑
gac ggg aac t-叠氮-3’、5
’‑
叠氮-t aca aga cac gg-3’所示的核苷酸序列；
27.所述的修饰了炔基基团的短的单链核酸优选如5
’‑
炔基-caa act gat ag-3’、5
’‑
ggg agc tag ag-炔基-3’、5
’‑
炔基-aca aga cac g-3’、5
’‑
ctg acg gga ag-炔基-3’所示的核苷酸序列。
28.优选的，所述作为连接模板的核酸具体为以下的一种或多种核苷酸序列结构：
[0029]5’‑
fam-att cta tca gtt tct tgg aat tta gcg a-3’、5
’‑
catata tgt tgc cac tct agc ggc cgt gg-tamra-3’、5
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fam-ccg tgc cgt gtc ttg tag ttc ccg tcg aat cg-3’、5
’‑
tamra-cct cta cgt gtc ttg tac ttc gga tca gag agg-3’。
附图说明
[0030]
图1为本发明实施例1中的反应体系中加入1u/ml alp和不加入alp情况下检测体系荧光光谱图；
[0031]
图2为本发明实施例2加入不同浓度alp的响应曲线；
[0032]
图3为为本发明实施例3对alp检测特异性曲线。
具体实施方式
[0033]
下面通过具体实施方式进一步详细说明：
[0034]
实施例1：一种基于点击化学和氧化石墨烯检测碱性磷酸酶的方法，包括以下步骤：
[0035]
步骤一：将1u/ml的碱性磷酸酶(alp)、4mm的aap在37℃水浴中反应30min；
[0036]
步骤二：将修饰了叠氮基团的短的单链核酸，如seq id no:1(5
’‑
cta aat tcc aa-叠氮-3’)所示、修饰了炔基基团的短的单链核酸，如seq id no:5(5
’‑
炔基-gaa act gat ag-3’)所示、和作为连接模板的核酸，如seq id no:9(5
’‑
fam-tcg cta tca gtt tct tgg aat tta gcg a-3’)所示，分别溶解在纯水中，均配制成终浓度为200nm的核酸溶液；
[0037]
步骤三：按2：2：1的比例将修饰了叠氮基团的短的单链核酸溶液、修饰了炔基基团的短的单链核酸溶液和作为连接模板的修饰了荧光基团的长链核酸的核酸溶液混合，配制成混合溶液，然后向混合溶液中加入步骤一的反应液、5μm铜离子和tris-hcl缓冲溶液(40mm tris-hcl(30mm nacl，ph 7.4))形成反应体系，反应体系中修饰了叠氮基团的短的单链核酸溶液和修饰了炔基基团的短的单链核酸溶液的终浓度为20nm，作为连接模板的核酸溶液的终浓度为10nm，将反应体系置于20℃水浴中分别反应3h。
[0038]
步骤四：向反应体系中加入3μl 0.5mg/ml氧化石墨烯、纯水、tris-hcl缓冲溶液(20mm tris-hcl(400mm nacl，ph 7.4))，升温至35℃，10min后用荧光光谱仪检测升温条件下检测体系的荧光强度。
[0039]
如图1为本发明实施例1中的反应体系中加入1u/ml alp和不加入alp情况下检测体系荧光光谱图，图1中曲线2说明在不加alp时，荧光强度没有明显变化，图1中曲线3说明体系中加入1u/ml alp之后荧光强度增强，图1中曲线2和3能很好的说明用本发明的检测方法可以通过监测alp水解磷酸基团从而还原铜离子来催化核酸连接反应来检测alp。
[0040]
实施例2:一种基于点击化学和氧化石墨烯检测碱性磷酸酶的方法，包括以下步骤：
[0041]
步骤一：将不同浓度的alp(0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1、1.2、1.4、1.6、1.8、2、3、4、5u/ml)、4mm aap在37℃水浴反应30min；
[0042]
步骤二：将修饰了叠氮基团的短的单链核酸，如seq id no:1(5
’‑
cta aat tcc aa-叠氮-3’)所示、修饰了炔基基团的短的单链核酸，如seq id no:5(5
’‑
炔基-gaa act gat ag-3’)所示和作为连接模板的修饰了荧光基团的长链核酸，如seq id no:9(5
’‑
fam-tcg cta tca gtt tct tgg aat tta gcg a-dabcyl-3’)所示，分别溶解在纯水中配制成浓度都为200nm的核酸溶液；
[0043]
步骤三：按2：2：1的比例将修饰了叠氮基团的短的单链核酸溶液、修饰了炔基基团的短的单链核酸溶液和作为连接模板的修饰了荧光基团的长链核酸溶液混合，配制成混合溶液，然后向混合溶液中加入步骤一的反应混合液、5μm铜离子和tris-hcl缓冲溶液(40mm tris-hcl(30mm nacl，ph 7.4))缓冲溶液，形成反应体系，其中修饰了叠氮基团的短的单链核酸溶液和修饰了炔基基团的短的单链核酸溶液的终浓度为20nm，作为连接模板的修饰了荧光基团的长链核酸溶液的终浓度为10nm，20℃温育3h。
[0044]
步骤四：向反应体系中加入3μl 0.5mg/ml氧化石墨烯、水和tris-hcl缓冲溶液(20mm tris-hcl(400mm nacl，ph 7.4))，升温至35℃，10min后用荧光光谱仪检测升温条件
下检测体系的荧光强度。
[0045]
步骤五：以已知alp浓度为横坐标，对应的荧光强度值为纵坐标，绘制标准曲线，得到铜离子浓度和荧光强度之间的曲线关系图，在alp浓度在0～1u/ml的区间里，碱性磷酸酶的浓度与荧光强度呈现良好的线性关系，符合线性方程y＝570359.59181x+39975.20021(y代表检测体系的荧光强度，x代表以u/ml为单位的检测体系中alp浓度)，其r2＝0.997，通过计算(3δ/s)本方法对水中铜离子的检测限约为0.0036u/ml。
[0046]
如图2为本发明实施例2加入不同浓度的alp的响应曲线。图2说明，从0～1u/ml，检测体系的荧光强度随alp的浓度升高而增强，并且体系的荧光强度在alp浓度达到1u/ml时逐渐到达平台期，说明随着alp的增加，连接反应的效率/速率增强；另外，检测体系在0～1u/ml范围内与荧光强度有良好的线性关系和较小的数据偏差，说明本方法在检测alp方面具有很好的重现性。
[0047]
实施例3：一种基于点击化学和氧化石墨烯检测碱性磷酸酶的方法，包括以下步骤，
[0048]
步骤一：将不同种类的蛋白(alp、牛血清蛋白bsa、凝血酶、胰蛋白酶、α-葡萄糖苷酶、木瓜蛋白酶，其中alp的浓度为1u/ml，其他蛋白浓度为10u/ml，bsa为0.1g/ml)、4mmaap在37℃水浴反应30min；
[0049]
步骤二：将修饰了叠氮基团的短的单链核酸，如seqidno:1(5
’‑
ctaaattccaa-叠氮-3’)所示，修饰了炔基基团的短的单链核酸，如seqidno:5(5
’‑
炔基-gaaactgatag-3’)所示，和作为连接模板的修饰了荧光基团的长链核酸，如seqidno:9(5
’‑
fam-tcgctatcagtttcttggaatttagcga-3’)所示，分别溶解在纯水中配制成浓度都为200nm的核酸溶液。
[0050]
步骤三：按2：2：1的比例将修饰了叠氮基团的短的单链核酸溶液、修饰了炔基基团的短的单链核酸溶液和作为连接模板的修饰了荧光基团的长链核酸作为连接模板的核酸溶液混合，形成配制成核酸混合溶液，然后向核酸混合溶液中加入步骤一的反应液、铜离子、水和tris-hcl缓冲溶液(40mmtris-hcl(30mmnacl，ph7.4))，形成反应体系，其中修饰了叠氮基团的短的单链核酸溶液和修饰了炔基基团的短的单链核酸溶液的终浓度为20nm，作为连接模板的修饰了荧光基团的长链核酸作为连接模板的核酸溶液的终浓度为10nm，反应体系在20℃温育3h。
[0051]
步骤四：向反应体系中加入3μl0.5mg/ml氧化石墨烯、水和tris-hcl缓冲溶液(20mmtris-hcl(400mmnacl，ph7.8))，升温至35℃，10min后用荧光光谱仪检测升温条件下检测体系的荧光强度。
[0052]
如图3为本发明实施例3对alp检测特异性曲线。其中i为检测体系温育后的荧光强度，i0是温育之前的荧光强度，(i-i0)/i0是代表检测体系温育之后荧光强度增加的倍数；图3说明，在温育之后，含有1u/mlalp的检测体系荧光增强了17倍左右，而分别含有10倍于alp(10u/ml)的干扰蛋白的检测体系的荧光强度没有明显变化，这说明检测体系中干扰蛋白的存在不影响alp的检测。
[0053]
实施例4：一种基于点击化学和氧化石墨烯检测碱性磷酸酶的方法，包括以下步骤，
[0054]
步骤一：实际样品为血清，使用离心机10000rpm离心10min，取上清液置于低温保
存待用。将稀释后的血清加入低(200mu/ml)、中(400mu/ml)、高(800mu/ml)三个不同浓度的alp，4mm磷酸化的抗坏血酸在37℃水浴反应30min；
[0055]
步骤二：将修饰了叠氮基团的短的单链核酸，如seq id no:1(5
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cta aat tcc aa-叠氮-3’)所示，修饰了炔基基团的短的单链核酸，如seq id no:5(5
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炔基-gaa act gat ag-3’)所示，和作为连接模板的修饰了荧光基团的长链核酸，如seq id no:9(5
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fam-tcg cta tca gtt tct tgg aat tta gcg a
ꢀ‑3’
)所示，分别溶解在纯水中配制成浓度都为200nm的核酸溶液；
[0056]
步骤三：按2：2：1的比例将修饰了叠氮基团的短的单链核酸溶液、修饰了炔基基团的短的单链核酸溶液和作为连接模板的修饰了荧光基团的长链核酸作为连接模板的核酸溶液混合，形成配制成核酸混合溶液，然后向核酸混合溶液中加入步骤一的反应液、5μm铜离子和tris-hcl缓冲溶液(40mm tris-hcl(30mm nacl，ph 7.4))，形成反应体系，其中修饰了叠氮基团的短的单链核酸溶液和修饰了炔基基团的短的单链核酸溶液的终浓度为20nm，作为作为连接模板的修饰了荧光基团的长链核酸连接模板的核酸溶液的终浓度为10nm，反应体系在20℃温育3h。
[0057]
步骤四：向反应体系中加入3μl 0.5mg/ml氧化石墨烯、水和tris-hcl缓冲溶液(40mm tris-hcl(400mm nacl，ph 7.8))，升温至35℃，10min后用荧光光谱仪检测升温条件下检测体系的荧光强度。
[0058]
步骤五：记录荧光强度结果，计算回收率和相对标准偏差(rsd)。
[0059]
实验结果表明，所有回收率均在99％-103％的范围内。证明了该方法有应用于复杂样本检测的潜力。
[0060]
实施例5：一种基于点击化学和氧化石墨烯检测碱性磷酸酶的方法，包括以下步骤，
[0061]
步骤一：实际样品为唾液，使用离心机10000rpm离心10min，取上清液置于低温保存待用。将稀释后的唾液加入低(200mu/ml)、中(400mu/ml)、高(800mu/ml)三个不同浓度的alp，4mm磷酸化的抗坏血酸在37℃水浴反应30min；
[0062]
步骤二：将修饰了叠氮基团的短的单链核酸，如seq id no:1(5
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cta aat tcc aa-叠氮-3’)所示，修饰了炔基基团的短的单链核酸，如seq id no:5(5
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炔基-gaa act gat ag-3’)所示，和作为连接模板的修饰了荧光基团的长链核酸，如seq id no:9(5
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fam-tcg cta tca gtt tct tgg aat tta gcg a-3’)所示，分别溶解在纯水中配制成浓度都为200nm的核酸溶液；
[0063]
步骤三：按2：2：1的比例将修饰了叠氮基团的短的单链核酸溶液、修饰了炔基基团的短的单链核酸溶液和作为连接模板的修饰了荧光基团的长链核酸作为连接模板的核酸溶液混合，形成配制成核酸混合溶液，然后向核酸混合溶液中加入步骤一的反应液、5μm铜离子和tris-hcl缓冲溶液(40mm tris-hcl(30mm nacl，ph 7.4))，形成反应体系，其中修饰了叠氮基团的短的单链核酸溶液和修饰了炔基基团的短的单链核酸溶液的终浓度为20nm，作为作为连接模板的修饰了荧光基团的长链核酸连接模板的核酸溶液的终浓度为10nm，反应体系在20℃温育3h。
[0064]
步骤四：向反应体系中加入3μl 0.5mg/ml氧化石墨烯、水和tris-hcl缓冲溶液(20mm tris-hcl(400mm nacl，ph 7.8))，升温至35℃，10min后用荧光光谱仪检测升温条件
下检测体系的荧光强度。
[0065]
步骤五：记录荧光强度结果，计算回收率和相对标准偏差(rsd)。
[0066]
实验结果表明，所有回收率均在98％-103％的范围内。证明了该方法有应用于复杂样本检测的潜力。
[0067]
本发明利用点击化学来连接核酸的反应和氧化石墨烯的猝灭作用，反应条件温和、抗干扰能力强、稳定性好、灵敏度高；本发明所用材料试剂均为市售，成本低、性质稳定，不需要复杂繁琐的制备过程和预处理过程，只需要简单的溶液混合和溶液的温育过程，操作简便、采用的是标记了广泛应用的荧光基团的dna长单链，生物适应性强，基本无毒害，检测过程简单；同时，本发明采用的是荧光增强模式，能大大降低出现假阳性信号的可能性；本发明的检测方法稳定性好、特异性高，在0～1u/ml范围内有很好的线性响应，线性方程为y＝570359.59181x+39975.20021，检测限低至0.0036u/ml。
[0068]
对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明技术构思的前提下，还可以作出多个变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。本技术要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。

技术特征：
1.一种基于点击化学和氧化石墨烯检测碱性磷酸酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一：将测试样品分别与2-磷酸-抗坏血酸(aap)混合，置于水浴中充分反应；步骤二：将修饰了叠氮基团且短的单链核酸、修饰了炔基基团且短的单链核酸和作为连接模板且修饰了荧光基团的核酸分别溶解在纯水中配制成核酸溶液；步骤三：将步骤二配制的三种核酸溶液混合，配制成核酸混合溶液，然后向核酸混合溶液中加入步骤一反应好的测试样品与aap的反应液、铜离子和tris-hcl缓冲溶液，形成反应体系；步骤四：向步骤三的反应体系中加入纯水、氧化石墨烯、tris-hcl缓冲溶液，升温后对检测体系的荧光强度进行检测；步骤五：以已知碱性磷酸酶浓度的样品和对应的荧光强度值所建立的标准曲线，来检测未知碱性凝酸酶浓度的待测样品，待测样品按照步骤一至步骤四操作得到荧光强度，计算得到其中含有碱性凝酸酶的浓度。2.根据权利要求1所述的基于点击化学和氧化石墨烯检测碱性磷酸酶的方法，其特征在于，所述步骤一中aap的浓度为0.5mm～10mm，水浴反应温度为20℃～50℃，反应时间为10min～50min。3.根据权利要求2所述的基于点击化学和氧化石墨烯检测碱性磷酸酶的方法，其特征在于，所述步骤二中作为连接模板的核酸包括tm值为30℃～50℃的一条长单链和tm值为15℃～25℃的两条短单链。4.根据权利要求3所述的基于点击化学和氧化石墨烯检测碱性磷酸酶的方法，其特征在于，步骤三中修饰了叠氮基团且短的单链核酸、修饰了炔基基团且短的单链核酸和作为连接模板核酸之间的浓度比例为(1～6)：(1～6)：1。5.根据权利要求4所述的基于点击化学和氧化石墨烯检测碱性磷酸酶的方法，其特征在于，步骤三反应体系中，修饰了叠氮基团且短的单链核酸和修饰了炔基基团且短的单链核酸的终浓度相同，终浓度均为10nm～80nm；作为连接模板且修饰了荧光基团的核酸终浓度为5nm～30nm。6.根据权利要求5所述的基于点击化学和氧化石墨烯检测碱性磷酸酶的方法，其特征在于，所述步骤三的反应体系中，铜离子浓度为5μm～20μm，tris-hcl缓冲溶液的盐浓度为10mm～60mm，ph 6.6～8.2；形成反应体系的反应时间为20min～5h，反应温度为10℃～40℃。7.根据权利要求6所述的基于点击化学和氧化石墨烯检测碱性磷酸酶的方法，其特征在于，所述步骤三中氧化石墨烯为荧光猝灭剂，其用量为浓度为0.5mg/ml的氧化石墨烯2μl～20μl。8.根据权利要求7所述的基于点击化学和氧化石墨烯检测碱性磷酸酶的方法，其特征在于，所述步骤四检测体系中，tris-hcl缓冲溶液的盐浓度为100mm～500mm，ph 6.6～8.2，所述步骤四荧光强度检测时间为10min～50min，检测温度为20℃～50℃。9.根据权利要求8所述的基于点击化学和氧化石墨烯检测碱性磷酸酶的方法，其特征在于，修饰了叠氮基团的短的单链核酸为5
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gat cta aat tcc aa-叠氮-3’、5
’‑
叠氮-tgg caa cag c-3’、5
’‑
gac ggg aac t-叠氮-3’、5
’‑
叠氮-t aca aga cac gg-3’所示的核苷酸
序列；所述的修饰了炔基基团的短的单链核酸优选如5
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炔基-caa act gat ag-3’、5
’‑
ggg agc tag ag-炔基-3’、5
’‑
炔基-aca aga cac g-3’、5
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ctg acg gga ag-炔基-3’所示的核苷酸序列。10.根据权利要求1～9任一项所述的基于点击化学和氧化石墨烯检测碱性磷酸酶的方法，其特征在于，所述作为连接模板的核酸具体为以下的一种或多种核苷酸序列结构：5
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fam-att cta tca gtt tct tgg aat tta gcg a-3’、5
’‑
catata tgt tgc cac tct agc ggc cgt gg-tamra-3’、5
’‑
fam-ccg tgc cgt gtc ttg tag ttc ccg tcg aat cg-3’、5
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tamra-cct cta cgt gtc ttg tac ttc gga tca gag agg-3’。

技术总结
本发明涉及一种基于点击化学和氧化石墨烯检测碱性磷酸酶的方法，属于生物分析检测技术领域。该方法利用磷酸化的抗坏血酸可以被碱性磷酸酶水解成抗坏血酸还原铜离子，催化点击化学反应的发生从而连接DNA短片段，因其连接前后在氧化石墨烯作用下荧光强度有明显变化，构建了一种新型检测碱性磷酸酶的荧光方法。本方法在0～1U/mL范围内有很好的线性响应，检测限为0.0036U/mL。本申请具有高特异性、稳定性好、成本低、操作简单等特点。操作简单等特点。操作简单等特点。


技术研发人员：王方远 叶敏 彭龙英 晏若水 张娜 白青 孙靖婷 刘建国
受保护的技术使用者：遵义医科大学
技术研发日：2023.07.03
技术公布日：2023/10/5