一种白色念珠菌人源化抗体的制备方法与流程

1.本发明涉及白色念珠菌人源化抗体制备技术领域，具体为一种白色念珠菌人源化抗体的制备方法。


背景技术：

2.白色念珠菌是自然界中广泛存在的一种可以造成体表或深部感染条件致病性的真核微生物。该菌是人体的共生菌群，通常寄生在人体不同的解剖部位，如体表、口腔、咽喉、肠道、阴道黏膜等部位，可引起皮肤感染及免疫功能明显下降的严重全身感染，近20年来，随着广谱抗生素、糖皮质激素、免疫抑制剂的临床广泛应用及各种导管的介入治疗、外科手术的操作、癌症患者的化疗等引起白色念珠菌感染率呈不断上升趋势，在免疫抑制患者中白色念珠菌的感染率居第1位，成为此类患者主要的致病菌，深部白色念珠菌感染的病死率高达68.9％。
3.对侵袭性真菌感染，目前只有少数几类抗真菌药物可供使用，如多烯类、唑类、烯丙胺类、棘白菌素类和嘧啶类，它们的作用机制仅限于针对细胞被膜(壁和质膜)，抑制dna合成。此外，这些药物中的大多数会对宿主产生严重的不良影响，如由两性霉素b引起的肾毒性，由伏立康唑引起的视觉障碍和由伊曲康唑引起的充血性心力衰竭，人源治疗性抗体因其高特异、高疗效、高安全性特点，是治疗白色念珠菌感染及其并发症最有效的免疫防治手段。目前常用的抗真菌药物主要有氮唑类、多烯类、棘白菌素类等，存在品种少、真菌耐药性增加和毒副作用大等问题，给临床抗真菌治疗的药物选择带来很大困扰，迫切需要研制新型抗真菌药物。而系统性念珠菌感染有较高的病死率，导致该病高病死率的主要原因有：
4.(1)由于系统性念珠菌感染没有特征性的临床表现，所以在早期诊断方面存在一定的困难，往往错过最佳的治疗时机。
5.(2)抗真菌药物有一定的局限性，现用的抗真菌药物主要有氮唑类、多烯类、棘白菌素类等，存在品种少、真菌耐药性增加和毒副作用大等问题，给临床抗真菌治疗的药物选择带来很大困扰，迫切需要研制新型抗真菌药物。在多数侵袭性真菌感染患者的免疫功能低下、真菌易对小分子药物产生耐药性、小分子药物抗侵袭性真菌感染的有效性和安全性亟待提高的情况下，研究抗真菌治疗的新策略具有极其重要的意义。因此，就真菌感染治疗而言，通过激发和增强机体本身潜能的免疫疗法将成为克服真菌感染的主要策略。
6.而白色念珠菌其细胞壁表面和细胞浆内存在着大量的抗原，诸如甘露糖、葡聚糖、甘露糖蛋白和热休克蛋白70等，念珠菌也合成、分泌大量的毒性分子和免疫调节分子，包括热休克蛋白90，天冬氨酸蛋白酶和烯醇化酶，它们参与真菌粘附、降解宿主组织蛋白，以及调节白色念珠菌形态转换，宿主能够识别这些抗原的b细胞和t细胞表位，产生相应的免疫应答反应，可以看出单克隆抗体具有精准靶向的抗真菌作用，兼有调节机体免疫反应的功能，是治疗真菌感染的一种可行且具有独特优势的方法。
7.综上可知，单克隆抗体具有精准靶向的抗真菌作用，兼有调节机体免疫反应的功能，是治疗真菌感染的一种可行且具有独特优势的方法，但是目前制备的抗体多为鼠源性，
临床应用时，对人是异种抗原，临床重复给药时可使人产生抗鼠抗体，从而减弱或失去疗效，又因人源单抗存在制备困难、杂交瘤细胞不稳定、产量低及亲和力弱的问题，限制了其在临床上的应用。因此，有效检测和治疗白色念珠菌和耐药性白色念珠菌的感染是目前临床上抗真菌研究中亟待解决的问题之一。


技术实现要素：

8.本发明的目的是为了解决现有技术中存在的人源单抗存在制备困难、杂交瘤细胞不稳定、产量低及亲和力弱的问题。
9.为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：
10.本发明提供了一种白色念珠菌人源化抗体的制备方法，其特征在于，该方法包括：
11.外周血采集及初筛步骤，采集患者的外周血样本，并对采集的血样进行血清抗体滴度elisa检测和b淋巴细胞elispot分析，对血样中抗体滴度高的样本进行单个核细胞pbmc的分离；
12.单克隆抗体的分离筛选及构建表达步骤，通过流式细胞分选筛选具有白色念珠菌特异性抗体分泌能力的单个b淋巴细胞，提取其mrna并进行rt-pcr扩增，再通过深度测序获得抗体可变区基因信息，将基因信息与启动子和恒定区基因连接构建表达载体，转染至293t细胞中表达并通过elisa筛选，最后收集上清进行抗体浓缩和纯化；
13.单克隆抗体的改构优化及活性鉴定步骤，通过elisa检测抗体结合活性并计算ec50值，使用westernblot验证抗体表达，并进行抗体结构分析与改构优化，利用电化学发光免疫分析和表面等离子共振技术评价抗体结合活性和亲和力，使用bli技术检测抗原－抗体亲和力；
14.单克隆抗体体外中和作用、效应功能及活性表位鉴定步骤，根据白色念珠菌的结构特点及生物学活性，评价人源单克隆抗体对相应野生型白色念珠菌的结合及中和作用，使用cdc和adcc活性检测方法评估单克隆抗体的细胞毒性活性和吞噬作用，通过合成肽步移技术鉴定抗体的活性表位，并利用分子模拟和x－衍射蛋白质晶体结构解析分析单克隆抗体与抗原复合物的结构。
15.单克隆抗体的免疫保护效果评价及配伍优化步骤，采用来自中国不同地区和医院的临床分离菌株和相应的野生型白色念珠菌，评估获得的全人源抗白色念珠菌单克隆抗体的免疫保护效果，通过ivis活体成像技术追踪荧光标记抗体在小鼠体内的分布情况，并对白色念珠菌抗原的特异性单克隆抗体进行配伍优化。
16.本发明进一步地设置为：所述外周血采集及初筛步骤中的采集患者为白色念珠菌感染恢复期患者；
17.所述外周血采集及初筛步骤中血清抗体滴度elisa检测方式具体为，采用3种重组表达的白色念珠菌蛋白及活性片段作为包被抗原，制备阴、阳性质控标准品，建立3种白色念珠菌蛋白特异性抗体滴度间接elisa检测技术体系，以p/n比值是否大于1.8，获得血清特异性抗体的最高稀释度；
18.所述外周血采集及初筛步骤中对采集的外周血样本进行b淋巴细胞elispot分析方式具体包括：包被、封闭、加入待检测外周血样本、加入生物素标记的羊抗鼠igg二抗、加入亲和素标记的底物(gaba)、银染、计数、统计；
19.所述外周血采集及初筛步骤中对血清抗体滴度高的外周血样本进行单个核细胞(pbmc)的分离方式具体包括：抗凝全血取样稀释等体积离心分离、稀释混悬；
20.本发明进一步地设置为：所述单克隆抗体的分离筛选及构建表达步骤具体为：
21.一、采用流式细胞分选技术，将特异性人b淋巴细胞表面标志物及白色念珠菌种保护性抗原蛋白标记荧光，分选分离好的pbmc中具有白色念珠菌特异性抗体分泌能力的单个b淋巴细胞；
22.二、裂解分选的单个b淋巴细胞，以细胞中的mrna为模板，利用特异性引物进行rt-pcr，逆转录获得抗体可变区基因cdna，并进行扩增；
23.三、利用特异性引物，以获得的cdna为模板进行pcr，分别扩增抗体重链、轻链可变区基因；
24.四、将扩增得到的重链、轻链可变区基因进行深度测序，并将基因序列与imgt数据库中的抗体可变区基因序列进行比对，获得基因信息；
25.五、将比对成功的抗体可变区基因与cmv启动子及恒定区基因(含polya尾)片段进行overlappingpcr；
26.六、将单克隆抗体重链与轻链基因线性表达载体按照0.7:1的质量比转染入293t细胞中进行表达；
27.七、elisa板包被白色念珠菌重组抗原，筛选293t细胞培养上清使上清中具有相应抗体；
28.八、将重链、轻链线性表达载体克隆连接到pcdna3.3质粒载体上，作为稳定的质粒表达载体；
29.九、将重链、轻链质粒表达载体按0.8:1的质量比转染入293t细胞中进行表达；
30.十、收集293t细胞培养上清进行抗体浓缩、纯化；
31.本发明进一步地设置为：所述单克隆抗体的改构优化及活性鉴定步骤具体包括：
32.一、elisa检测抗体结合活性：将5种重组抗原按0.75ug/ml浓度每孔95ul包被elisa板，5℃过夜，以对应的单克隆抗体为一抗梯度稀释后孵育1h—1.5h，再加入酶标二抗，孵育30min—40min后加入底物，在36.5℃下避光显色4—10min，测定550nm/750nm波长下的吸光度值，用spss13.0计算单克隆抗体的ec50值；
33.二、wester-blot对抗体表达进行鉴定：将表达的抗体培养上清进行sds电泳，并用半干转移法转到pvdf膜上，浸于4％—6％脱脂奶粉中，5℃过夜以封闭抗体，用pbst洗脱后加入ap(alkalinephosphatase，碱性磷酸酶)标记的羊抗人igg平稳摇动脱色，室温1.5小时—3小时，加入ap底物，利用化学发光法进行显色；
34.三、抗白色念珠菌人源单克隆抗体的结构分析与改构优化：通过计算机模拟，对单克隆抗体与相应抗原形成的抗原－抗体复合物进行结构预测，初步确定重链可变区与轻链可变区的突变氨基酸的位点与种类；通过fab与抗原表位的互作(复合物大小、fc段的方向和几何特征)，分析抗体亚型及fcγ受体(fcγr)介导的效应功能；根据结构预测、位点与种类、互作以及效应功能对分析后的单克隆抗体进行结构改造及优化，具体的：通过选择igg亚型、fc糖基化及氨基酸序列改造；
35.四、利用电化学发光免疫分析(eclia)对单克隆抗体与相应抗原的结合活性及亲和力进行评价；
36.五、利用表面等离子共振技术(spr)对单克隆抗体与相应抗原的结合活性及亲和力进行评价；
37.六、采用bli(生物膜干涉)技术对单克隆抗体与相应抗原的亲和力进行检测分析：分离得到的单克隆抗体以120nm、60nm、30nm、15nm及7.5nm的不同浓度在bli传感器中分别与20nm的相应重组毒素蛋白溶液反应，分析传染图，计算平衡常数(kds，kd/karatio)；
38.本发明进一步地设置为：所述利用电化学发光免疫分析(eclia)对单克隆抗体与相应抗原的结合活性及亲和力进行评价具体包括：
39.一、直接固载法电化学发光检测抗体结合活性：选用三联吡啶钌([ru(bpy)3]2+)、鲁米诺(luminol)作为标记物，通过化学反应将其修饰到贵金属纳米粒子表面，再通过共价交联标记在抗原上，选用石墨烯、碳纳米管纳米材料修饰电极表面，形成基底电极，将标记有发光剂的抗原固定在电极表面，并确定抗原的附着量，在修饰后的电极系统中，加入待测抗体，充分结合孕育后，移除多余的抗体后再次加入标记有发光剂的抗原，二次孕育后，移除多余的发光剂的抗原，最后进行电化学发光检测；
[0040]
二、流动磁性分离法电化学发光检测抗体结合活性：合成标记有发光剂的抗原，设计2-3种选用磁性、碳复合的纳米材料，以纳米材料为固定化基材，将标记有发光剂的抗原固定在纳米材料上，将标记有发光剂的抗原与抗体结合后，再加入固载在磁性材料上的抗原，分离后的双抗原夹心结构在磁性电极表面进行电化学发光检测，根据电流大小获得电极表面特异性结合的抗体数目；
[0041]
本发明进一步地设置为：所述利用表面等离子共振技术(spr)对单克隆抗体与相应抗原的结合活性及亲和力进行评价具体包括：
[0042]
一、基于biacore技术建立测定单克隆抗体与细菌毒素保护性抗原结合的动力学和热力学常数的方法：直接无标记spr免疫法检测抗体结合活性，通入不同浓度的单克隆检测抗体，记录抗原－抗体结合的spr信号曲线，注入缓冲液，对抗原－抗体复合物进行解离反应，记录spr信号曲线。
[0043]
二、纳米信号放大spr夹心免疫法检测抗体结合活性：将proteina共价固定于处理后的spr金片表面，通过proteina将单克隆抗体固定于传感界面，通入不同浓度的检测抗原，记录抗原－抗体结合的spr信号曲线，将二抗固定于纳米粒子表面，制得spr纳米信号放大探针，随后注入spr传感芯片，记录抗原－抗体结合的spr信号放大曲线注入缓冲液，对抗原－抗体复合物进行解离反应，记录spr信号曲线；
[0044]
本发明进一步地设置为：所述单克隆抗体体外中和作用、效应功能及活性表位鉴定步骤中的cdc活性检测步骤具体如下：
[0045]
一、将1支gx-16株冻干工作种子溶解于10mltsb液体培养基中，36.5℃、200rpm/min培养5小时；
[0046]
二、将溶解后的菌液画线接种于下层固体培养基平皿上，38℃倒置培养过夜；
[0047]
三、从培养好的下层固体平皿中挑取35个单克隆，接种于150ml液体培养基中，36.5℃、180rpm/min培养1—2小时，控制od600nm在0.5-0.6之间；
[0048]
四、将单克隆抗体置于56℃恒温水浴中加热30分钟；
[0049]
五、取一支细菌甘油冻存液，溶化后进行离心，去除上清液，用0.5mlhbss缓冲液重悬菌体，再次离心，去除上清液，用0.5mlhbss缓冲液重悬菌体，按工作浓度稀释后备用；
[0050]
六、对96孔u形板的h行1、2列两孔加入30μlhbss缓冲液，其余h行各孔依次加入30μl稀释好的单克隆抗体，u形板其余每孔加入20μlhbss缓冲液，然后从h行开始自下而上进行两倍系列稀释，直至a行；
[0051]
七、将稀释后的gx-16株细菌菌液加入每孔10μl，并添加10μl灭活乳兔补体(对照)于第1列每孔，其余各孔加入10μl活性乳兔补体；
[0052]
八、轻轻震荡混匀后，将96孔u形板置于37℃孵育箱中孵育30分钟；
[0053]
九、从每孔取10μl反应混合液点样于含下层固体培养基的方形平皿中，使其形成条状，待反应液完全被吸收后，铺上层胶(10ml/板)，将方形平皿置于37℃孵箱中培养过夜，第二天进行细菌克隆计数；
[0054]
本发明进一步地设置为：所述单克隆抗体体外中和作用、效应功能及活性表位鉴定步骤中的adcc活性检测方式具体如下：
[0055]
一、在56℃水浴中灭活单克隆抗体30分钟；
[0056]
二、将96孔板的第1、2列分别设置为controla组(无血清灭活补体组)和controlb组(无血清活补体组)，每孔加入20μlobb(调理吞噬缓冲液：含9.5％的10xhbss、9.5％的0.1％明胶以及5％灭活胎牛血清)；
[0057]
三、将40μl单克隆抗体分别加入第一行的3～12列，设置复孔；其余每孔加入20μlobb；从3～12列进行2倍系列稀释；
[0058]
四、按照计算好的稀释倍数对工作菌种进行稀释并加入96孔板中，每孔加入10μl；
[0059]
五、在微型振荡器上，700rpm，室温下孵育30、45、60分钟，将hl-60细胞清洗并调整浓度为107个/ml，将细胞和补体以4:1的比例混合，加入96孔板中，每孔加入50μl；
[0060]
六、在37℃、5％co2、700rpm条件下孵育45、60、90分钟；
[0061]
七、将96孔板置于冰上20分钟，终止噬菌反应；
[0062]
八、从每个反应混合物的孔中取10μl分别点在mha平板上，倒置孵育18～20小时；
[0063]
九、使用菌落计数仪计数菌落，以血清稀释度和菌落数分别作为横纵坐标绘制曲线；
[0064]
十、以杀灭controlb组50％细菌量所对应的抗体最大稀释度作为样品的调理吞噬指数(opsonnophagocyticindex，oi)；
[0065]
本发明进一步地设置为：所述单克隆抗体体外中和作用、效应功能及活性表位鉴定步骤中合成肽步移技术活性表位分析以及通过分子模拟及x－衍射蛋白质晶体结构解析对单克隆抗体与相应抗原复合物进行结构分析方式具体如下：
[0066]
一、合成肽步移技术活性表位分析：设计3种重组白色念珠菌蛋白的合成肽，每条多肽包含18个氨基酸，相邻多肽之间有6个氨基酸的重叠，每条多肽的n端连有生物素(biotin)，使用亲和素(sa)包被板，将合成的多肽稀释为2μg/ml，加入板中，37℃孵育1小时，洗板后，稀释单克隆抗体为2μg/ml，加入板中，37℃孵育1小时，洗板后，加入酶标二抗，37℃孵育1小时，洗板后，加入反应底物，观察显色反应，与抗体结合的多肽片段会出现显色反应，对阳性多肽的氨基酸位点进行逐个点突变，生成22条多肽；
[0067]
二、通过分子模拟及x－衍射蛋白质晶体结构解析对单克隆抗体与相应抗原复合物进行结构分析：选用表达人源单克隆抗体并对其进行酶切，分离纯化fab段，将纯化的fab段与相应的重组白色念珠菌蛋白抗原混合，形成抗原抗体复合物，进行晶体生长条件的优
化，培养出可用于收集数据的蛋白晶体，对培养出的晶体进行x射线衍射，采集衍射数据，利用分子置换法进行结构解析，分析单克隆抗体与相应抗原复合物的结构；
[0068]
本发明进一步地设置为：所述抗白色念珠菌人源单克隆抗体的结构分析与改构优化步骤中的计算机模拟具体方式如下：
[0069]
一、选用x射线晶体学、核磁共振确定抗体和白色念珠菌抗原结构；
[0070]
二、选用rosetta和分子建模软件将抗体和抗原的结构转化为pdb格式的分子结构文件；
[0071]
三、根据抗体和抗原的分子结构特征，确定分子对接的搜索空间；
[0072]
四、选用zdock、patchdock、autodock分子对接算法在搜索空间中寻找最佳的抗体和抗原结合方式；
[0073]
五、通过评估抗体－抗原复合物的能量得分，确定最优的结合构型；
[0074]
六、根据分子对接模拟的结果，分析抗体和抗原之间的相互作用，包括氢键、离子相互作用和疏水效应。
[0075]
采用本发明提供的技术方案，与已知的公有技术相比，具有如下有益效果：
[0076]
本发明通过流式细胞分选筛选具有白色念珠菌特异性抗体分泌能力的单个b淋巴细胞，抗体源于人体的抗体分泌细胞、不需要抗体的改造，保持了抗体的天然活性，对血样中抗体滴度高的样本进行单个核细胞pbmc的分离，通过单个b细胞rt-pcr所得到的抗体的轻链、重链都来自于同一个b细胞，保持了抗体天然组合，减少了抗体重组表达中活性的丢失，制备方法方便、快速，单个b细胞rt-pcr制备全人抗体所涉及的技术均为常规的分子生物学、细胞生物学技术，要求简单、方面易行，解决了现有技术中存在的人源单抗存在制备困难、杂交瘤细胞不稳定、产量低及亲和力弱的问题。
附图说明
[0077]
图1为本发明的一种白色念珠菌人源化抗体的制备方法的流程图；
具体实施方式
[0078]
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施条例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0079]
请参阅图1，本发明提供一种技术方案：一种白色念珠菌人源化抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
[0080]
步骤1、白色念珠菌感染恢复期患者外周血采集及初筛：
[0081]
a.采集白色念珠菌感染恢复期患者外周血，对采集的外周血样本进行血清抗体滴度elisa检测：
[0082]
采用3种重组表达的白色念珠菌蛋白及活性片段作为包被抗原，通过优化包被浓度、抗体稀释倍数、缓冲体系及孵育时间参数，制备阴/阳性质控标准品，稳定建立3种白色念珠菌蛋白特异性抗体滴度间接elisa检测技术体系，elisa检测技术体系具体如下：
[0083]
一、用包被液将重组蛋白抗原稀释成2μg/ml；
[0084]
二、在对应的孔中加入100μl包被抗原，选用室温孵育2h、4℃过夜；
[0085]
三、倒空液体并拍干残留液体，用300μl洗涤液清洗两次；
[0086]
四、每个孔中加300μl封闭液，孵育1h；
[0087]
五、倒空液体并拍干残留液体，用300μl洗涤液清洗两次；
[0088]
六、每个孔中加100μl梯度稀释的血清，选用37℃孵育1h、室温孵育3h；
[0089]
七、倒空液体并拍干残留液体，每个孔中加满洗涤液洗涤3次；
[0090]
八、每个孔中加100μl二抗，室温孵育1h；
[0091]
九、用洗涤液浸泡5min，拍干残留液体；
[0092]
十、每个孔中加满洗涤液，倒空液体并拍干残留液体，重复5次；每个孔中加100μl底物，显色30min并立即在405nm读数。
[0093]
b.对采集的外周血样本进行b淋巴细胞elispot分析：
[0094]
一、包被：采用pbs-1将elispot试剂盒中的抗小鼠igg抗体稀释2000倍，50μl每孔加入elispot 96孔板，用于抗体分泌细胞的检测。将3种重组白色念珠菌抗原稀释至特定浓度后，50μl每孔加入elispot 96孔板，用于抗原特异性igg抗体分泌细胞的检测。每孔添加pbs-1至100μl后用胶带封板并在4℃孵育过夜。
[0095]
二、封闭：倒掉elispot 96孔板中的包被液，每孔加入250μlpbs-1，清洗3次，拍干96孔板后，每孔加入200μl的blocking buffer b(1
×
)，胶带封板后37℃孵育1h。
[0096]
三、加入待检测外周血样本：倒掉elispot 96孔板中的封闭液，每孔加入100μl待检外周血样本，每个条件重复3孔，加样结束后于细胞培养箱培养5～7h。其中，用于抗体分泌细胞检测的细胞浓度调整为0.5
×
105个/ml，用于抗原特异性igg抗体分泌细胞检测的细胞浓度调整为3
×
105个/ml。
[0097]
四、加入生物素标记的羊抗鼠igg二抗：倒掉elispot 96孔板中的细胞，采用pbs-1(200μl/孔)清洗两次，然后采用wash buffer(250μl/孔)清洗6次。拍干96孔板后，每孔加入100μl生物素标记的二抗(按说明书方法进行稀释)，胶带封板后37℃孵育1h。
[0098]
五、加入亲和素标记的底物(gaba)：倒掉elispot 96孔板中的二抗，采用wash buffer(250μl/孔)清洗6次。拍干96孔板后，每孔加入50μl稀释后的gaba，胶带封板后37℃孵育1h。
[0099]
六、银染：倒掉elispot 96孔板中的底物，采用wash buffer(250μl/孔)清洗6次。拍干96孔板后，每孔加入35μl的染色液(activator
‑ⅰ
和ⅱ按1:1比例配置)，胶带封板后室温显色20—45min。待出现明显的斑点后，采用无菌水清洗96孔板4次，拍干后自然干燥。
[0100]
七、计数：于显微镜下对每孔的斑点计数，斑点在镜下为黑色。每一个斑点代表一个抗体分泌细胞。
[0101]
八、统计：采用3个复孔的平均数代表每个样品中抗体分泌细胞的数量。组间比较采用t检验。
[0102]
c.对血清抗体滴度高的外周血样本进行单个核细胞(pbmc)的分离：
[0103]
一、取新鲜抗凝全血，用等体积生理盐水稀释全血。
[0104]
二、在50ml离心管中加入16ml分离液，将稀释后的血样平铺到分离液面上方，保持两液界面清晰。分离液、抗凝未经稀释全血、生理盐水体积为1：1：1。
[0105]
三、室温，水平转子750-1170g(2000-2500rpm)离心20分钟，加速度和减速度均调
为1。
[0106]
四、离心结束后，管底是红细胞，中间层是分离液，最上层是血浆，血浆层与分离液层之间是一层薄较致密的白膜，即：单个核细胞(包括淋巴细胞和单核细胞)层。小心吸取白膜层到50ml无菌离形管中。
[0107]
五、用生理盐水稀释到一定体积，混悬均匀。
[0108]
六、室温，水平转子423g(1500rpm)离心10分钟，弃上清。
[0109]
七、用生理盐水稀释到一定体积，混悬均匀备用。
[0110]
步骤2、全人源抗白色念珠菌单克隆抗体的分离筛选及构建表达：
[0111]
一、采用流式细胞分选技术，将特异性人b淋巴细胞表面标志物及白色念珠菌种保护性抗原蛋白标记荧光，分选分离好的pbmc中具有白色念珠菌特异性抗体分泌能力的单个b淋巴细胞；
[0112]
二、裂解分选的单个b淋巴细胞，以细胞中的mrna为模板，利用特异性引物进行rt-pcr，逆转录获得抗体可变区基因cdna，并进行扩增；
[0113]
三、利用特异性引物，以获得的cdna为模板进行pcr，分别扩增抗体重链、轻链可变区基因；
[0114]
四、将扩增得到的重链、轻链可变区基因进行深度测序，并将基因序列与imgt数据库中的抗体可变区基因序列进行比对，获得基因信息；
[0115]
五、将比对成功的抗体可变区基因与cmv启动子及恒定区基因(含poly a尾)片段进行overlapping pcr，连接组成能够表达抗体的重链、轻链线性表达载体；
[0116]
六、将单克隆抗体重链与轻链基因线性表达载体按照0.7:1的质量比转染入293t细胞中进行表达；
[0117]
七、elisa板包被白色念珠菌重组抗原，筛选293t细胞培养上清使上清中具有相应抗体；
[0118]
八、将重链、轻链线性表达载体克隆连接到pcdna3.3质粒载体上，作为稳定的质粒表达载体；
[0119]
九、将重链、轻链质粒表达载体按0.8:1的质量比转染入293t细胞中进行表达；
[0120]
十、收集293t细胞培养上清进行抗体浓缩、纯化。
[0121]
步骤3、全人源抗白色念珠菌单克隆抗体的改构优化及活性鉴定：
[0122]
一、elisa检测抗体结合活性：将5种重组抗原按0.75ug/ml浓度每孔95ul包被elisa板，5℃过夜，以对应的单克隆抗体为一抗梯度稀释后孵育1h—1.5h，再加入酶标二抗，孵育30min—40min后加入底物，在36.5℃下避光显色4—10min，测定550nm/750nm波长下的吸光度值，用spss 13.0计算单克隆抗体的ec50值；
[0123]
二、wester-blot对抗体表达进行鉴定：将表达的抗体培养上清进行sds电泳，并用半干转移法转到pvdf膜上，浸于4％—6％脱脂奶粉中，5℃过夜以封闭抗体，用pbst洗脱后加入ap(alkaline phosphatase，碱性磷酸酶)标记的羊抗人igg平稳摇动脱色，室温2小时，加入ap底物，利用化学发光法进行显色；
[0124]
三、抗白色念珠菌人源单克隆抗体的结构分析与改构优化：通过计算机模拟，对单克隆抗体与相应抗原形成的抗原－抗体复合物进行结构预测，初步确定重链可变区与轻链可变区的突变氨基酸的位点与种类；通过fab与抗原表位的互作(复合物大小、fc段的方向
和几何特征)，分析抗体亚型及fcγ受体(fcγr)介导的效应功能；根据结构预测、位点与种类、互作以及效应功能对分析后的单克隆抗体进行结构改造及优化，具体的：通过选择igg亚型、fc糖基化及氨基酸序列改造，对于计算机模拟，选用x射线晶体学、核磁共振确定抗体和白色念珠菌抗原结构；选用rosetta和 suite分子建模软件将抗体和抗原的结构转化为pdb格式的分子结构文件；根据抗体和抗原的分子结构特征，确定分子对接的搜索空间；搜索空间是指抗体和抗原之间可能发生结合的区域，选用zdock、patchdock、autodock分子对接算法在搜索空间中寻找最佳的抗体和抗原结合方式；最终通过评估抗体－抗原复合物的能量得分，确定最优的结合构型；能量评估可以使用分子力学力场和分子力学/动力学模拟，根据分子对接模拟的结果，分析抗体和抗原之间的相互作用，包括氢键、离子相互作用和疏水效应。根据这些信息，评估抗体结构的稳定性和结合强度，并提出改构优化的建议。采用分子对接模拟进行抗体－抗原结构分析和改构优化可以快速筛选大量的抗体－抗原结构，以找到最有可能的相互作用模式，分子对接模拟可以针对不同的抗体和抗原进行定制化设计，通过分子对接模拟，可以预测抗体－抗原相互作用的亲和力和结合模式根据治疗性抗体发挥临床效果的(mechanism of action)moa，增强与抑制性fcγr的互作，获得亲和力更强、免疫抑制性更弱的改构抗体。
[0125]
四、利用电化学发光免疫分析(eclia)对单克隆抗体与相应抗原的结合活性及亲和力进行评价：
[0126]
a.直接固载法电化学发光检测抗体结合活性：选用三联吡啶钌([ru(bpy)3]2+)、鲁米诺(luminol)作为标记物，通过化学反应将其修饰到贵金属纳米粒子表面，再通过共价交联标记在抗原上，形成标记有发光剂的抗原，选用石墨烯、碳纳米管纳米材料修饰电极表面，形成基底电极，将标记有发光剂的抗原固定在电极表面，并确定抗原的附着量，在修饰后的电极系统中，加入待测抗体，充分结合孕育后，移除多余的抗体后再次加入标记有发光剂的抗原，二次孕育后，移除多余的发光剂的抗原，最后进行电化学发光检测；通过电流大小获得电极表面特异性结合的抗体数目，从而确定其与抗原的结合力。研究在各种干扰因素存在下，抗原与抗体的结合活性。
[0127]
b.流动磁性分离法电化学发光检测抗体结合活性：合成标记有发光剂的抗原，设计2-3种选用磁性、碳复合的纳米材料，以纳米材料为固定化基材，将标记有发光剂的抗原固定在纳米材料上，将标记有发光剂的抗原与抗体结合后，再加入固载在磁性材料上的抗原，形成双抗原夹心结构流动相在磁场作用下，磁性分离后的双抗原夹心结构在磁性电极表面进行电化学发光检测，根据电流大小获得电极表面特异性结合的抗体数目，从而确定其与抗原的结合力，同时实现抗体的在线电化学发光检测，为抗体的规模化检测提供可能。研究在各种干扰因素存在下，抗原与抗体的结合活性
[0128]
五、利用表面等离子共振技术(spr)对单克隆抗体与相应抗原的结合活性及亲和力进行评价：
[0129]
a.基于biacore技术建立测定单克隆抗体与细菌毒素保护性抗原结合的动力学和热力学常数的方法：直接无标记spr免疫法检测抗体结合活性，通入不同浓度的单克隆检测抗体，记录抗原－抗体结合的spr信号曲线，注入缓冲液，对抗原－抗体复合物进行解离反应，记录spr信号曲线。通过结合曲线和解离曲线，可以反映出抗原抗体亲和力，利用分析软件计算出两者结合动力常数和亲和力等数据。
[0130]
b.纳米信号放大spr夹心免疫法检测抗体结合活性：将protein a共价固定于处理后的spr金片表面，通过protein a将单克隆抗体固定于传感界面，通入不同浓度的检测抗原，记录抗原－抗体结合的spr信号曲线，将二抗固定于纳米粒子表面，制得spr纳米信号放大探针，随后注入spr传感芯片，记录抗原－抗体结合的spr信号放大曲线注入缓冲液，对抗原－抗体复合物进行解离反应，记录spr信号曲线。通过结合曲线和解离曲线，反映抗原抗体之间的亲和力，利用分析软件计算出反映动力常数和亲和力等数据。重复上述步骤，注入类似的干扰抗原，记录spr信号曲线，通过抗原－抗体结合曲线，评估单克隆抗体的特异性
[0131]
六、采用bli(生物膜干涉)技术对单克隆抗体与相应抗原的亲和力进行检测分析：分离得到的单克隆抗体以120nm、60nm、30nm、15nm及7.5nm的不同浓度在bli传感器中分别与20nm的相应重组毒素蛋白溶液反应，分析传染图，计算平衡常数(kds，kd/ka ratio)。
[0132]
步骤4、全人源抗白色念珠菌单克隆抗体体外中和作用、效应功能及活性表位的鉴定：
[0133]
一、根据相应白色念珠菌的结构特点及生物学活性，评价人源单克隆抗体对相应野生型白色念珠菌的结合及中和作用；
[0134]
二、cdc活性检测：
[0135]
开启冻干工作种子gx-16株1支，溶解于5ml tsb液体培养基中，37℃、180rpm/min培养3—4小时；画线接种下层固体培养基平皿，37℃倒置培养过夜；挑取平皿中20—30个单克隆接种于100ml液体培养基37℃、180rpm/min培养1—2小时，控制od600nm在0.5-0.6之间。单克隆抗体于56℃恒温水浴30分钟。取细菌甘油冻存液一支，待溶化后12000rpm离心2min，小心吸去上清，用0.5ml 1
╳
hbss缓冲液重悬菌体，12000rpm离心2min，小心吸去上清，用0.5ml hbss缓冲液重悬菌体，按工作浓度稀释后待用。分别对96孔u形板h行1、2列两孔加入30μl hbss缓冲液，其余h行各孔依次加入30μl稀释好的单克隆抗体，u形板其余每孔加入20μl hbss缓冲液。并从h行开始自下而上做两倍系列稀释，直至a行。以上各孔均加入10μl经震荡混匀的稀释gx-16株细菌菌液。第1列每孔加入10μl灭活乳兔补体(对照)，其余各孔加10μl活性乳兔补体。96孔u形板经轻轻震荡混匀后置37℃孵育30分钟。每孔取10μl反应混合液点样于含下层固体培养基的方形平皿中，使其形成条状。待反应液完全被吸收后铺上层胶，每板10ml。方形平皿置37℃孵箱培养过夜，于第二天进行细菌克隆计数；
[0136]
三、adcc活性检测：
[0137]
单克隆抗体在56℃水浴中灭活30分钟。将96孔板的第1、2列分别设置为control a组(无血清灭活补体组)和control b组(无血清活补体组)，每孔加入20μl obb(调理吞噬缓冲液：含9.5％的10xhbss、9.5％的0.1％明胶以及5％灭活胎牛血清)。将40μl单克隆抗体分别加入第一行的3～12列，设置复孔；其余每孔加入20μl obb；从3～12列进行2倍系列稀释。按照计算好的稀释倍数对工作菌种进行稀释并加入96孔板中，10μl/孔。在微型振荡器上，700rpm，室温下孵育30、45、60分钟。将hl-60细胞分别经无ca2+、mg2+hbss缓冲液和含ca2+、mg2+hbss缓冲液清洗，最后用obb调整细胞浓度为107个/ml。将细胞和补体(control a组使用灭活补体)以4:1的比例混合，加入96孔板中，50μl/孔。37℃，5％co2，700rpm孵育45、60、90分钟。将96孔板置于冰上20分钟，终止噬菌反应。从每个反应混合物的孔中取10μl分别点在mha平板上。将平板倒置，37℃孵育18～20小时。使用菌落计数仪计数菌落，以血清稀释度和菌落数分别作为横纵坐标绘制曲线，以杀灭control b组50％细菌量所对应的抗体最大
稀释度作为样品的调理吞噬指数(opsonnophagocytic index，oi)。
[0138]
四、合成肽步移技术活性表位分析：
[0139]
利用多肽步移技术设计3种重组白色念珠菌蛋白的合成肽，每条多肽包含18个氨基酸，相邻多肽之间有6个氨基酸的重叠，其中每条多肽的n端连有生物素(biotin)。将亲和素(sa)以200ng/孔4℃包被过夜，洗板，多肽稀释为2μg/ml，100μl/孔37℃孵育1h，洗板，单克隆抗体稀释为2μg/ml，100μl/孔37℃孵育1h，洗板后将1：5000酶标二抗以100μl/孔加入，37℃孵育1h，洗板，加入反应底物后有显色的即为与抗体结合的多肽片段。将阳性多肽上的氨基酸位点逐个点突变，得到22条多肽，再用上述elisa检测方法用单克隆抗体筛选多肽，结果为阴性的说明突变的位点为关键结合位点；
[0140]
五、通过分子模拟及x－衍射蛋白质晶体结构解析，对单克隆抗体与相应抗原复合物进行结构分析：
[0141]
大量表达人源单克隆抗体约50mg，用木瓜蛋白酶对单克隆抗体的fab段与fc段进行酶切，纯化fab并将其与相应的重组白色念珠菌蛋白晶体生长培养及结构解析：采用悬滴式蒸气扩散法培养重组白色念珠菌抗原抗体复合物晶体。将高纯度的重组白色念珠菌蛋白抗原与经亲和层析纯化的抗体fab按1：1摩尔比例混合形成抗原抗体复合物，将该复合物浓缩至一定浓度以后，使用hampton公司的晶体培养试剂盒index，saltrx等，通过悬滴法进行晶体生长条件的初步摸索。在初步探究的条件下进行晶体生长条件的优化，培养出能够用于收集数据的晶体。将培养出可用于分析的蛋白晶体进行x线衍射，衍射数据首先以分子置换法进行结构解析。
[0142]
步骤5、全人源抗白色念珠菌单克隆抗体的免疫保护效果评价及配伍优化：
[0143]
一、采用来源于中国不同地区和医院的临床分离菌株及相应野生型白色念珠菌，通过已稳定建立的侵袭性感染或致死动物模型以及b细胞缺陷小鼠(mumt-/-)模型，对获得的全人源抗白色念珠菌单克隆抗体进行免疫保护效果评价；
[0144]
二、ivis活体成像示踪荧光标记抗体分布：将小鼠分为2组，每组10只，两组小鼠以6-9x106cfu/只尾静脉攻毒建立相应细菌感染模型，6h后实验组将gfp荧光蛋白标记的人源性单克隆抗体分别尾静脉注射不同模型的小鼠，对照组将gfp荧光蛋白标记的无关对照抗体尾静脉注射不同模型的小鼠，24h后利用小动物活体成像系统检测小鼠体内绿色荧光分布情况，分析抗体高度聚集区域与感染部位及细菌定植区域是否重合，对比两组小鼠体内荧光分布的异同；
[0145]
三、对分别针对白色念珠菌抗原的特异性单克隆抗体进行配伍优化，确定最佳的免疫程序、免疫剂量及配伍组合。
[0146]
尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种白色念珠菌人源化抗体的制备方法，其特征在于，该方法包括：外周血采集及初筛步骤，采集患者的外周血样本，并对采集的血样进行血清抗体滴度elisa检测和b淋巴细胞elispot分析，对血样中抗体滴度高的样本进行单个核细胞pbmc的分离；单克隆抗体的分离筛选及构建表达步骤，通过流式细胞分选筛选具有白色念珠菌特异性抗体分泌能力的单个b淋巴细胞，提取其mrna并进行rt-pcr扩增，再通过深度测序获得抗体可变区基因信息，将基因信息与启动子和恒定区基因连接构建表达载体，转染至293t细胞中表达并通过elisa筛选，最后收集上清进行抗体浓缩和纯化；单克隆抗体的改构优化及活性鉴定步骤，通过elisa检测抗体结合活性并计算ec50值，使用westernblot验证抗体表达，并进行抗体结构分析与改构优化，利用电化学发光免疫分析和表面等离子共振技术评价抗体结合活性和亲和力，使用bli技术检测抗原－抗体亲和力；单克隆抗体体外中和作用、效应功能及活性表位鉴定步骤，根据白色念珠菌的结构特点及生物学活性，评价人源单克隆抗体对相应野生型白色念珠菌的结合及中和作用，使用cdc和adcc活性检测方法评估单克隆抗体的细胞毒性活性和吞噬作用，通过合成肽步移技术鉴定抗体的活性表位，并利用分子模拟和x－衍射蛋白质晶体结构解析分析单克隆抗体与抗原复合物的结构。单克隆抗体的免疫保护效果评价及配伍优化步骤，采用来自中国不同地区和医院的临床分离菌株和相应的野生型白色念珠菌，评估获得的全人源抗白色念珠菌单克隆抗体的免疫保护效果，通过ivis活体成像技术追踪荧光标记抗体在小鼠体内的分布情况，并对白色念珠菌抗原的特异性单克隆抗体进行配伍优化。2.根据权利要求1所述的一种白色念珠菌人源化抗体的制备方法，其特征在于：所述外周血采集及初筛步骤中的采集患者为白色念珠菌感染恢复期患者；所述外周血采集及初筛步骤中血清抗体滴度elisa检测方式具体为，采用3种重组表达的白色念珠菌蛋白及活性片段作为包被抗原，制备阴、阳性质控标准品，建立3种白色念珠菌蛋白特异性抗体滴度间接elisa检测技术体系，以p/n比值是否大于1.8，获得血清特异性抗体的最高稀释度；所述外周血采集及初筛步骤中对采集的外周血样本进行b淋巴细胞elispot分析方式具体包括：包被、封闭、加入待检测外周血样本、加入生物素标记的羊抗鼠igg二抗、加入亲和素标记的底物(gaba)、银染、计数、统计；所述外周血采集及初筛步骤中对血清抗体滴度高的外周血样本进行单个核细胞(pbmc)的分离方式具体包括：抗凝全血取样稀释等体积离心分离、稀释混悬。3.根据权利要求1所述的一种白色念珠菌人源化抗体的制备方法，其特征在于，所述单克隆抗体的分离筛选及构建表达步骤具体为：一、采用流式细胞分选技术，将特异性人b淋巴细胞表面标志物及白色念珠菌种保护性抗原蛋白标记荧光，分选分离好的pbmc中具有白色念珠菌特异性抗体分泌能力的单个b淋巴细胞；二、裂解分选的单个b淋巴细胞，以细胞中的mrna为模板，利用特异性引物进行rt-pcr，逆转录获得抗体可变区基因cdna，并进行扩增；
三、利用特异性引物，以获得的cdna为模板进行pcr，分别扩增抗体重链、轻链可变区基因；四、将扩增得到的重链、轻链可变区基因进行深度测序，并将基因序列与imgt数据库中的抗体可变区基因序列进行比对，获得基因信息；五、将比对成功的抗体可变区基因与cmv启动子及恒定区基因(含polya尾)片段进行overlappingpcr；六、将单克隆抗体重链与轻链基因线性表达载体按照0.7:1的质量比转染入293t细胞中进行表达；七、elisa板包被白色念珠菌重组抗原，筛选293t细胞培养上清使上清中具有相应抗体；八、将重链、轻链线性表达载体克隆连接到pcdna3.3质粒载体上，作为稳定的质粒表达载体；九、将重链、轻链质粒表达载体按0.8:1的质量比转染入293t细胞中进行表达；十、收集293t细胞培养上清进行抗体浓缩、纯化。4.根据权利要求1所述的一种白色念珠菌人源化抗体的制备方法，其特征在于，所述单克隆抗体的改构优化及活性鉴定步骤具体包括：一、elisa检测抗体结合活性：将5种重组抗原按0.75ug/ml浓度每孔95ul包被elisa板，5℃过夜，以对应的单克隆抗体为一抗梯度稀释后孵育1h—1.5h，再加入酶标二抗，孵育30min—40min后加入底物，在36.5℃下避光显色4—10min，测定550nm/750nm波长下的吸光度值，用spss13.0计算单克隆抗体的ec50值；二、wester-blot对抗体表达进行鉴定：将表达的抗体培养上清进行sds电泳，并用半干转移法转到pvdf膜上，浸于4％—6％脱脂奶粉中，5℃过夜以封闭抗体，用pbst洗脱后加入ap(alkalinephosphatase，碱性磷酸酶)标记的羊抗人igg平稳摇动脱色，室温1.5小时—3小时，加入ap底物，利用化学发光法进行显色；三、抗白色念珠菌人源单克隆抗体的结构分析与改构优化：通过计算机模拟，对单克隆抗体与相应抗原形成的抗原－抗体复合物进行结构预测，初步确定重链可变区与轻链可变区的突变氨基酸的位点与种类；通过fab与抗原表位的互作(复合物大小、fc段的方向和几何特征)，分析抗体亚型及fcγ受体(fcγr)介导的效应功能；根据结构预测、位点与种类、互作以及效应功能对分析后的单克隆抗体进行结构改造及优化，具体的：通过选择igg亚型、fc糖基化及氨基酸序列改造；四、利用电化学发光免疫分析(eclia)对单克隆抗体与相应抗原的结合活性及亲和力进行评价；五、利用表面等离子共振技术(spr)对单克隆抗体与相应抗原的结合活性及亲和力进行评价；六、采用bli(生物膜干涉)技术对单克隆抗体与相应抗原的亲和力进行检测分析：分离得到的单克隆抗体以120nm、60nm、30nm、15nm及7.5nm的不同浓度在bli传感器中分别与20nm的相应重组毒素蛋白溶液反应，分析传染图，计算平衡常数(kds，kd/karatio)。5.根据权利要求4所述的一种白色念珠菌人源化抗体的制备方法，其特征在于，所述利用电化学发光免疫分析(eclia)对单克隆抗体与相应抗原的结合活性及亲和力进行评价具
体包括：一、直接固载法电化学发光检测抗体结合活性：选用三联吡啶钌([ru(bpy)3]2+)、鲁米诺(luminol)作为标记物，通过化学反应将其修饰到贵金属纳米粒子表面，再通过共价交联标记在抗原上，选用石墨烯、碳纳米管纳米材料修饰电极表面，形成基底电极，将标记有发光剂的抗原固定在电极表面，并确定抗原的附着量，在修饰后的电极系统中，加入待测抗体，充分结合孕育后，移除多余的抗体后再次加入标记有发光剂的抗原，二次孕育后，移除多余的发光剂的抗原，最后进行电化学发光检测；二、流动磁性分离法电化学发光检测抗体结合活性：合成标记有发光剂的抗原，设计2-3种选用磁性、碳复合的纳米材料，以纳米材料为固定化基材，将标记有发光剂的抗原固定在纳米材料上，将标记有发光剂的抗原与抗体结合后，再加入固载在磁性材料上的抗原，分离后的双抗原夹心结构在磁性电极表面进行电化学发光检测，根据电流大小获得电极表面特异性结合的抗体数目。6.根据权利要求4所述的一种白色念珠菌人源化抗体的制备方法，其特征在于，所述利用表面等离子共振技术(spr)对单克隆抗体与相应抗原的结合活性及亲和力进行评价具体包括：一、基于biacore技术建立测定单克隆抗体与细菌毒素保护性抗原结合的动力学和热力学常数的方法：直接无标记spr免疫法检测抗体结合活性，通入不同浓度的单克隆检测抗体，记录抗原－抗体结合的spr信号曲线，注入缓冲液，对抗原－抗体复合物进行解离反应，记录spr信号曲线。二、纳米信号放大spr夹心免疫法检测抗体结合活性：将proteina共价固定于处理后的spr金片表面，通过proteina将单克隆抗体固定于传感界面，通入不同浓度的检测抗原，记录抗原－抗体结合的spr信号曲线，将二抗固定于纳米粒子表面，制得spr纳米信号放大探针，随后注入spr传感芯片，记录抗原－抗体结合的spr信号放大曲线注入缓冲液，对抗原－抗体复合物进行解离反应，记录spr信号曲线。7.根据权利要求1所述的一种白色念珠菌人源化抗体的制备方法，其特征在于，所述单克隆抗体体外中和作用、效应功能及活性表位鉴定步骤中的cdc活性检测步骤具体如下：一、将1支gx-16株冻干工作种子溶解于10mltsb液体培养基中，36.5℃、200rpm/min培养5小时；二、将溶解后的菌液画线接种于下层固体培养基平皿上，38℃倒置培养过夜；三、从培养好的下层固体平皿中挑取35个单克隆，接种于150ml液体培养基中，36.5℃、180rpm/min培养1—2小时，控制od600nm在0.5-0.6之间；四、将单克隆抗体置于56℃恒温水浴中加热30分钟；五、取一支细菌甘油冻存液，溶化后进行离心，去除上清液，用0.5mlhbss缓冲液重悬菌体，再次离心，去除上清液，用0.5mlhbss缓冲液重悬菌体，按工作浓度稀释后备用；六、对96孔u形板的h行1、2列两孔加入30μlhbss缓冲液，其余h行各孔依次加入30μl稀释好的单克隆抗体，u形板其余每孔加入20μlhbss缓冲液，然后从h行开始自下而上进行两倍系列稀释，直至a行；七、将稀释后的gx-16株细菌菌液加入每孔10μl，并添加10μl灭活乳兔补体(对照)于第1列每孔，其余各孔加入10μl活性乳兔补体；
八、轻轻震荡混匀后，将96孔u形板置于37℃孵育箱中孵育30分钟；九、从每孔取10μl反应混合液点样于含下层固体培养基的方形平皿中，使其形成条状，待反应液完全被吸收后，铺上层胶(10ml/板)，将方形平皿置于37℃孵箱中培养过夜，第二天进行细菌克隆计数。8.根据权利要求1所述的一种白色念珠菌人源化抗体的制备方法，其特征在于，所述单克隆抗体体外中和作用、效应功能及活性表位鉴定步骤中的adcc活性检测方式具体如下：一、在56℃水浴中灭活单克隆抗体30分钟；二、将96孔板的第1、2列分别设置为controla组(无血清灭活补体组)和controlb组(无血清活补体组)，每孔加入20μlobb(调理吞噬缓冲液：含9.5％的10xhbss、9.5％的0.1％明胶以及5％灭活胎牛血清)；三、将40μl单克隆抗体分别加入第一行的3～12列，设置复孔；其余每孔加入20μlobb；从3～12列进行2倍系列稀释；四、按照计算好的稀释倍数对工作菌种进行稀释并加入96孔板中，每孔加入10μl；五、在微型振荡器上，700rpm，室温下孵育30、45、60分钟，将hl-60细胞清洗并调整浓度为107个/ml，将细胞和补体以4:1的比例混合，加入96孔板中，每孔加入50μl；六、在37℃、5％co2、700rpm条件下孵育45、60、90分钟；七、将96孔板置于冰上20分钟，终止噬菌反应；八、从每个反应混合物的孔中取10μl分别点在mha平板上，倒置孵育18～20小时；九、使用菌落计数仪计数菌落，以血清稀释度和菌落数分别作为横纵坐标绘制曲线；十、以杀灭controlb组50％细菌量所对应的抗体最大稀释度作为样品的调理吞噬指数(opsonnophagocyticindex，oi)。9.根据权利要求1所述的一种白色念珠菌人源化抗体的制备方法，其特征在于，所述单克隆抗体体外中和作用、效应功能及活性表位鉴定步骤中合成肽步移技术活性表位分析以及通过分子模拟及x－衍射蛋白质晶体结构解析对单克隆抗体与相应抗原复合物进行结构分析方式具体如下：一、合成肽步移技术活性表位分析：设计3种重组白色念珠菌蛋白的合成肽，每条多肽包含18个氨基酸，相邻多肽之间有6个氨基酸的重叠，每条多肽的n端连有生物素(biotin)，使用亲和素(sa)包被板，将合成的多肽稀释为2μg/ml，加入板中，37℃孵育1小时，洗板后，稀释单克隆抗体为2μg/ml，加入板中，37℃孵育1小时，洗板后，加入酶标二抗，37℃孵育1小时，洗板后，加入反应底物，观察显色反应，与抗体结合的多肽片段会出现显色反应，对阳性多肽的氨基酸位点进行逐个点突变，生成22条多肽；二、通过分子模拟及x－衍射蛋白质晶体结构解析对单克隆抗体与相应抗原复合物进行结构分析：选用表达人源单克隆抗体并对其进行酶切，分离纯化fab段，将纯化的fab段与相应的重组白色念珠菌蛋白抗原混合，形成抗原抗体复合物，进行晶体生长条件的优化，培养出可用于收集数据的蛋白晶体，对培养出的晶体进行x射线衍射，采集衍射数据，利用分子置换法进行结构解析，分析单克隆抗体与相应抗原复合物的结构。10.根据权利要求4所述的一种白色念珠菌人源化抗体的制备方法，其特征在于，所述抗白色念珠菌人源单克隆抗体的结构分析与改构优化步骤中的计算机模拟具体方式如下：一、选用x射线晶体学、核磁共振确定抗体和白色念珠菌抗原结构；
二、选用rosetta和分子建模软件将抗体和抗原的结构转化为pdb格式的分子结构文件；三、根据抗体和抗原的分子结构特征，确定分子对接的搜索空间；四、选用zdock、patchdock、autodock分子对接算法在搜索空间中寻找最佳的抗体和抗原结合方式；五、通过评估抗体－抗原复合物的能量得分，确定最优的结合构型；六、根据分子对接模拟的结果，分析抗体和抗原之间的相互作用，包括氢键、离子相互作用和疏水效应。

技术总结
本发明公开了一种白色念珠菌人源化抗体的制备方法，涉及白色念珠菌人源化抗体制备技术领域，本发明流式细胞分选筛选具有白色念珠菌特异性抗体分泌能力的单个B淋巴细胞，抗体源于人体的抗体分泌细胞、不需要抗体的改造，保持了抗体的天然活性，对血样中抗体滴度高的样本进行单个核细胞PBMC的分离，通过单个B细胞RT-PCR所得到的抗体的轻链、重链都来自于同一个B细胞，保持了抗体天然组合，减少了抗体重组表达中活性的丢失，制备方法方便、快速，单个B细胞RT-PCR制备全人抗体所涉及的技术均为常规的分子生物学、细胞生物学技术，要求简单、方面易行，解决了现有技术中存在的人源单抗存在制备困难、杂交瘤细胞不稳定、产量低及亲和力弱的问题。弱的问题。弱的问题。


技术研发人员：王缚鲲 贾克然 雷达鑫 王佳 蒋梦雨 张佳佳
受保护的技术使用者：中国人民解放军联勤保障部队第九八〇医院
技术研发日：2023.07.06
技术公布日：2023/10/5