双(吗啉硫代羰基)二硫化物在制备预防或者治疗结核病药物中的应用

1.本发明属于生物医药技术领域，尤其涉及一种双(吗啉硫代羰基)二硫化物在制备预防或者治疗结核病药物中的应用。


背景技术：

2.结核病是由结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis)经呼吸道传播而引起的全身性慢性传染病，可以侵入人体全身各种器官，主要侵犯肺脏，称为肺结核病，是世界范围内传染病死亡的最重要原因之一。据估计，2020年全球有1000万人患结核病，约132万人死亡，比2019年意外增加。
3.目前，常用的一线抗结核药品包括链霉素、异烟肼、利福平、乙胺丁醇等；二线抗结核药品包括对氨水杨酸钠、氧氟沙星、卡那霉素、克拉霉素等。但研究显示，肺结核患者痰标本中的结核分枝杆菌分离菌株对4种一线抗结核药品的任一耐药率为36.8％，耐多药率为6.8％；对7种二线抗结核药品的任一耐药率为24.6％，广泛耐药率为2.1％；对11种一线和二线抗结核药品的任一耐药率为42.1％。可见，现有技术中，对于结核病的防治面临着严重的耐药问题。
4.因此，发现一种能够有效抑制结核分枝杆菌，同时对耐药结核分枝杆菌具有显著抑制作用的活性分子及候选药物是本领域技术人员亟需解决的关键问题。


技术实现要素：

5.为解决上述技术问题，本发明提出了一种双(吗啉硫代羰基)二硫化物在制备预防或者治疗结核病药物中的应用。
6.为实现上述目的，本发明提供了一种双(吗啉硫代羰基)二硫化物在制备抑制结核分枝杆菌活性药物中的应用，其中，双(吗啉硫代羰基)二硫化物的结构式如下，双(吗啉硫代羰基)二硫化物记为jx06：
[0007][0008]
双(吗啉硫代羰基)二硫化物在制备预防或者治疗结核病药物中的应用，其中，双(吗啉硫代羰基)二硫化物的结构式如下：
[0009][0010]
进一步地，所述结核病是由结核分枝杆菌感染而引起的全身性慢性传染病。
[0011]
进一步地，所述结核病主要是由结核分枝杆菌经呼吸道传播而引起的全身性慢性
传染病。
[0012]
进一步地，所述结核病是由结核分枝杆菌感染引起的肺结核。
[0013]
进一步地，所述结核病是由结核分枝杆菌感染引起的骨结核。
[0014]
进一步地，所述结核病是由结核分枝杆菌感染引起的淋巴结核。即由结核分枝杆菌感染而引起的全身性慢性传染病包括肺结核、骨结核或淋巴结核。
[0015]
双(吗啉硫代羰基)二硫化物对结核分枝杆菌具有靶向性，而对其他组织、活细胞或微生物无毒。
[0016]
进一步地，在双(吗啉硫代羰基)二硫化物预防或者治疗结核病过程中，双(吗啉硫代羰基)二硫化物通过抑制结核分枝杆菌甲硫氨酸氨基肽酶发挥抗结核作用。
[0017]
进一步地，预防或者治疗结核病药物的剂型包括片剂、胶囊剂、颗粒剂或注射剂。
[0018]
与现有技术相比，本发明具有如下优点和技术效果：
[0019]
本发明提供了双(吗啉硫代羰基)二硫化物的新用途，其可以用于制备预防或者治疗结核病药物，双(吗啉硫代羰基)二硫化物通过抑制结核分枝杆菌甲硫氨酸氨基肽酶发挥抗结核作用，且对结核分枝杆菌具有靶向性，而对其他组织、活细胞或微生物无毒。
附图说明
[0020]
构成本发明的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
[0021]
图1为双(吗啉硫代羰基)二硫化物jx06的1h nmr图谱；
[0022]
图2为双(吗啉硫代羰基)二硫化物jx06的
13
c nmr图谱；
[0023]
图3为双(吗啉硫代羰基)二硫化物jx06抗结核分枝杆菌h37ra的效果；
[0024]
图4为双(吗啉硫代羰基)二硫化物jx06对革兰氏阴性菌及革兰氏阳性菌的抑制效果，(a)为jx06对革兰氏阴性菌的抑制效果图，(b)为jx06对革兰氏阳性菌的抑制效果图；
[0025]
图5为双(吗啉硫代羰基)二硫化物jx06对活细胞的影响，(a)为对a549的影响图，(b)为对rko的影响图，(c)为对mcf-7的影响图；
[0026]
图6为双(吗啉硫代羰基)二硫化物jx06对结核分枝杆菌菌体的影响，(a)为jx06对结核分枝杆菌菌体影响的扫描电镜图，(a)中左图为空白对照组，(a)中右图为jx06对结核分枝杆菌菌体的影响；(b)为jx06对结核分枝杆菌菌体影响的透射电镜图，(b)中左图为空白对照组，(b)中右图为jx06对结核分枝杆菌菌体的影响；
[0027]
图7为双(吗啉硫代羰基)二硫化物jx06对结核分枝杆菌来源甲硫氨酸氨基肽酶的影响。
具体实施方式
[0028]
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
[0029]
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包
括或排除在范围内。
[0030]
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
[0031]
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
[0032]
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
[0033]
本发明实施例中双(吗啉硫代羰基)二硫化物按照文献sun w,xie z,liu y,et al.jx06 selectively inhibits pyruvate dehydrogenase kinase pdk1 by a covalent cysteine modification[j].cancer research,2015:4923-4936.记载的方法合成。
[0034]
实施例1
[0035]
双(吗啉硫代羰基)二硫化物jx06，结构如下：
[0036][0037]
如图1-2所示，其波谱数据如下：
[0038]1h nmr(600mhz,dmso-d6)δ4.22(8h,t,j＝4.8hz)，3.73(8h,t,j＝4.8hz)。
[0039]
13
c nmr(150mhz,dmso-d6)δ192.46,66.26,54.38。
[0040]
实施例2
[0041]
双(吗啉硫代羰基)二硫化物jx06抗结核分枝杆菌h37ra的效果：
[0042]
基于微孔板的alamarblue实验，检测双(吗啉硫代羰基)二硫化物jx06对结核分枝杆菌的最小抑菌浓度，具体实验步骤如下：
[0043]
(1)准备浓度为106cfu/ml的病原菌悬液，以500μl/孔加入至48孔板；
[0044]
(2)将双(吗啉硫代羰基)二硫化物jx06按照二倍稀释法加入到步骤(1)所得含菌液的48孔板，浓度梯度设置为10μm、5μm、2.5μm、1.25μm、1μm、0.5μm、0.25μm、0.125μm；同时设置添加抗结核药物异烟肼(inh浓度为0.4μm)处理孔为阳性对照组，只含有菌液的处理孔为空白对照组；
[0045]
(3)将步骤(2)所得48孔板用封口膜密封，放至37℃恒温培养箱，培养7天后，每个孔分别取出100μl放入到96孔板中，再加入50μl刃天青显色液进行显色；
[0046]
(4)显色期间，实时观察96孔板中每个孔液体的颜色变化，直到空白对照组颜色由蓝色变为粉色，取出96孔板，观察，拍照。
[0047]
结果如图3所示，观察双(吗啉硫代羰基)二硫化物jx06对敏感菌株h37ra抑制效果。可以发现，双(吗啉硫代羰基)二硫化物jx06对上述结核分枝杆菌具有显著的抑制活性，且当双(吗啉硫代羰基)二硫化物jx06浓度为0.5μm以上时，其抑制活性与inh对照组相似。
[0048]
实施例3
[0049]
双(吗啉硫代羰基)二硫化物jx06对革兰氏阴性菌及革兰氏阳性菌的抑制效果：
[0050]
基于微孔板的alamarblue实验，检测双(吗啉硫代羰基)二硫化物jx06对革兰氏阴性菌(大肠杆菌)及革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌)最小抑菌浓度，具体实验步骤如下：
[0051]
(1)准备浓度为105cfu/ml的病原菌悬液，以100μl/孔加入至96孔板；
[0052]
(2)将双(吗啉硫代羰基)二硫化物jx06加入到步骤(1)所得含菌液的96孔板，浓度梯度设置为100μm、50μm、20μm、10μm、1μm；同时设置添加氨苄霉素(amp浓度为50μg/ml)处理孔为阳性对照组，只含有菌液的处理孔为空白对照组；
[0053]
(3)将步骤(2)所得96孔板用封口膜密封，放至37℃恒温培养箱，培养1天后，加入50μl刃天青显色液进行显色；
[0054]
(4)显色期间，实时观察96孔板中每个孔液体的颜色变化，直到空白对照组颜色由蓝色变为呈黄色(受培养基颜色影响)，取出96孔板，观察，拍照。
[0055]
结果如图4所示，观察双(吗啉硫代羰基)二硫化物jx06对革兰氏阴性菌(大肠杆菌)及革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌)都无毒，在抗菌活性上具有一定的选择性。
[0056]
将实施例2和实施例3结果进行整理，结果如表1所示。
[0057]
表1
[0058][0059][0060]
实施例4
[0061]
双(吗啉硫代羰基)二硫化物jx06对活细胞的影响：
[0062]
基于微孔板的cck-8实验，检测双(吗啉硫代羰基)二硫化物jx06对细胞的毒性，验证药物的安全性，具体实验步骤如下：
[0063]
(1)选择a549(人肺癌细胞)、rko(人结肠癌细胞)、mcf-7(人乳腺癌细胞)三种细胞(均购自美国atcc细胞库)进行实验，将细胞分别进行消化、计数后，调整细胞浓度为5
×
104个/ml，作为铺板的细胞悬液，以100μl/孔的添加量加入到96孔板中，然后放置37℃co2恒温培养箱培养12h；
[0064]
(2)将双(吗啉硫代羰基)二硫化物jx06加入到步骤(1)中所得的96孔板中，浓度梯度设置为100μm、50μm、20μm、10μm、1μm；同时设置添加紫杉醇(浓度为10μm)处理孔为阳性对照组，只含有细胞的处理孔为对照组，只含有培养基的孔为空白组(blank)，然后放置回37℃co2恒温培养箱培养48h；
[0065]
(3)将步骤(2)中的96孔板从恒温培养箱中取出，弃除上清，避光，加入100μl cck-8(10％)，然后放置回37℃co2恒温培养箱孵育，每隔30min，用荧光酶标仪检测96孔板中每个孔的液体在450nm发射波长下的吸收值，去除培养基和cck-8的背景后，计算活性存活率；其中，活性存活率＝(实验组od值-空白组od值)/(对照组od值-空白组od值)
×
100％。
[0066]
结果如图5所示，jx06对三种细胞的ic
50
》20μm，大于抗结核浓度，因此，作为临床药物的开发具有一定的安全性。
[0067]
实施例5
[0068]
双(吗啉硫代羰基)二硫化物jx06对结核分枝杆菌菌体的影响：
[0069]
基于电镜实验，观察双(吗啉硫代羰基)二硫化物jx06对结核分枝杆菌菌体的影响，具体实验步骤如下：
[0070]
(1)将m.tb h37ra培养两瓶，每瓶20ml，待菌液od
595
值为0.3左右时，其中一瓶菌液加入终浓度为2
×
mic的双(吗啉硫代羰基)二硫化物jx06，作为实验组；另一瓶菌液加入与实验组化合物等体积的dmso，作为空白对照组将2瓶菌液放置于37℃摇床振荡培养24h；
[0071]
(2)将步骤(1)中的菌液各平分为两份，转移至50ml无菌离心管中，4℃，3000
×
g离心10min，收集菌体沉淀；
[0072]
(3)向步骤(2)中得到的两份沉淀(实验组和空白对照组)中加入5ml pbs(0.1m，ph 7.4)洗涤菌体沉淀，洗涤3次，最后加入适量体积(500μl左右)的2.5％戊二醛，4℃固定过夜，待测扫描电镜。
[0073]
(4)向步骤(2)中得到的两份沉淀(实验组和空白对照组)中适量体积(500μl左右)的2.5％戊二醛，4℃固定过夜，待测透射电镜；
[0074]
(5)将步骤(3)、(4)所得的菌体进行电镜检测，观察双(吗啉硫代羰基)二硫化物jx06对结核分枝杆菌菌体的影响。
[0075]
结果如图6中(a)所示，与空白对照组比较，实验组菌体长度明显缩短，表面起皱扭曲，甚至部分断裂，可见碎片；此外，如图6中(b)所示，实验组菌体菌壁完整性被破坏，轮廓变得模糊。这些结果表明jx06通过破坏细菌细胞壁表现出抗结核作用。
[0076]
实施例6
[0077]
双(吗啉硫代羰基)二硫化物jx06对结核分枝杆菌来源甲硫氨酸氨基肽酶的影响：
[0078]
基于体外代谢实验，研究双(吗啉硫代羰基)二硫化物jx06对结核分枝杆菌来源甲硫氨酸氨基肽酶的影响，具体实验步骤如下：
[0079]
(1)基于结核分枝杆菌h37ra蛋白信息rv0734，设计结核分枝杆菌来源甲硫氨酸氨基肽酶mtmet-ap1，选择bl21(de3)感受态细胞，通过itpg(1mm，16℃低温诱导24h)，镍柱纯化获得纯化蛋白；
[0080]
(2)利用步骤(1)中获得的蛋白验证双(吗啉硫代羰基)二硫化物jx06的抑制作用，反应体系(200μl)包括:hepes(100mm)，nacl(50mm)，cocl2(200μm)，mtmet-ap1(11μg/ml)以及用于检测结核分枝杆菌来源甲硫氨酸氨基肽酶mtmet-ap1的荧光探针ddan-mt(2.5μm)，设抑制剂终浓度(μm)：0.2、0.5、1、1.5、2、3、5、8、10，控制dmso体积《1％，37℃下反应30min；
[0081]
(3)向步骤(2)中加入100μl乙腈终止实验，于20000g，20min离心，去除蛋白。吸取200μl上清液通过酶标仪分析其荧光响应值(激发/发射波长：λex 600/λem 668nm)。
[0082]
结果如图7所示，通过结果可知jx06的ic
50
为1.88μm,其通过抑制结核分枝杆菌中甲硫氨酸氨基肽酶活性表现出抗结核作用。
[0083]
以上，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求的保护范围为准。

技术特征：
1.双(吗啉硫代羰基)二硫化物在制备抑制结核分枝杆菌活性药物中的应用，其特征在于，双(吗啉硫代羰基)二硫化物的结构式如下：2.双(吗啉硫代羰基)二硫化物在制备预防或者治疗结核病药物中的应用，其特征在于，双(吗啉硫代羰基)二硫化物的结构式如下：3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述结核病是由结核分枝杆菌感染而引起的全身性慢性传染病。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述结核病是由结核分枝杆菌感染引起的肺结核。5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述结核病是由结核分枝杆菌感染引起的骨结核。6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述结核病是由结核分枝杆菌感染引起的淋巴结核。7.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，通过抑制结核分枝杆菌甲硫氨酸氨基肽酶发挥抗结核作用。8.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，药物的剂型包括片剂、胶囊剂、颗粒剂或注射剂。

技术总结
本发明提供了双(吗啉硫代羰基)二硫化物在制备预防或者治疗结核病药物中的应用，属于生物医药领域，本发明提供了双(吗啉硫代羰基)二硫化物的新用途，其可以用于制备预防或者治疗结核病药物，双(吗啉硫代羰基)二硫化物通过抑制结核分枝杆菌甲硫氨酸氨基肽酶发挥抗结核作用，且对结核分枝杆菌具有靶向性，而对其他组织、活细胞或微生物无毒。活细胞或微生物无毒。活细胞或微生物无毒。


技术研发人员：王超 马骁驰 冯磊 张铭 孙妍
受保护的技术使用者：大连医科大学
技术研发日：2023.07.06
技术公布日：2023/10/5