外源性给予巨噬细胞ALDH2在制备预防或治疗溃疡性结肠炎药物或保健品中的应用的制作方法

外源性给予巨噬细胞aldh2在制备预防或治疗溃疡性结肠炎药物或保健品中的应用
技术领域
1.本发明涉及医药技术领域，具体地，涉及外源性给予巨噬细胞aldh2在制备预防或治疗溃疡性结肠炎药物或保健品中的应用。


背景技术：

2.溃疡性结肠炎是一种结肠和直肠慢性非特异性炎症性疾病。与细菌性肠炎等特异性肠炎不同，溃疡性结肠炎的病因尚不十分清楚，目前普遍认为，溃疡性结肠炎是一种自身免疫性疾病，其发生发展可能与基因、免疫和环境因素等有关。研究表明，外源物质入侵引起宿主反应或者易感基因导致的自身防御系统对正常菌群产生过度的炎症免疫反应，都可能引起肠道的损伤，促进溃疡性结肠炎的发生发展。巨噬细胞的活化在其中发挥了重要的作用。在致炎因素作用下，肠道中的细菌及坏死的肠道组织均能够产生脂多糖(lipopolysaccharides，lps)等内源性毒素，引起肠道组织及外周固有免疫细胞特别是巨噬细胞的募集，并通过其表面的toll样受体(toll-like receptor，tlr)等相关信号通路引起巨噬细胞活化，通过释放多种促炎因子进而促进溃疡性结肠炎的发生发展。因此，抑制巨噬细胞活化引起的肠道损伤是溃疡性结肠炎防治的有效手段和关键环节，有望成为优化溃疡性结肠炎治疗的重要突破。基于此，目前多以体外应用lps刺激巨噬细胞模拟溃疡性结肠炎环境，以此研究巨噬细胞在溃疡性结肠炎中的作用及机制。
3.与细菌性肠炎、病毒性肠炎和真菌性肠炎等具有明确病因的特异性肠炎不同，对于溃疡性结肠炎尚缺乏理想的治疗药物。目前的治疗药物虽然可以在一定程度上缓解溃疡性结肠炎的进展，但临床症状缓解效果欠佳，远期治疗效果仍不理想。因此，目前亟需寻找新的靶点，开发新的有效的溃疡性结肠炎治疗药物。
4.乙醛脱氢酶2(aldehyde dehydrogenase 2,aldh2)是乙醇代谢的重要酶类。目前研究表明，aldh2主要存在于线粒体，普遍认为，aldh2对乙醇的代谢过程主要通过促进毒性中间产物乙醛(乙醇经过脱氢酶催化产生)转化为乙酸，从而发挥对酒精的解毒作用。除了乙醛，aldh2对机体产生的其他有毒醛类物质都具有强大的代谢作用，包括4-羟基-2-壬烯醛(4-hydroxy-2-nonenal,4-hne)等，进而发挥解毒作用。对于aldh2的抗炎作用的确切机制目前尚未明确，但目前研究指出，aldh2可以通过上调自噬水平参与细胞的代谢过程。在高脂环境中，巨噬细胞aldh2通过上调ampk相关的自噬水平从而发挥抑制巨噬来源泡沫细胞的形成和炎症反应的作用，从而表明了aldh2在动脉粥样硬化等炎症免疫相关疾病中的保护作用。在溃疡性结肠炎中，目前仅有报道，发生溃疡性结肠炎时，肠道组织中aldh2水平显著增加。然而，机体内的aldh2，尤其是巨噬细胞中的aldh2，在溃疡性结肠炎中的作用尚无报道。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供外源性给予巨噬细胞源性aldh2的新用途，用途为在制备
预防或治疗溃疡性结肠炎药物或保健品中的应用。
6.本发明的技术方案为：
7.本发明的外源性给予巨噬细胞aldh2在制备预防或治疗溃疡性结肠炎药物或保健品中的应用，外源性给予巨噬细胞aldh2包括以下的至少一种：a)外源性给予巨噬细胞的aldh2蛋白；b)外源性给予巨噬细胞的aldh2的编码基因；c)外源性给予巨噬细胞的含有aldh2编码基因的重组载体；d)外源性给予巨噬细胞的含有aldh2编码基因的重组病毒。
8.可选地，在上述外源性给予巨噬细胞aldh2在制备预防或治疗溃疡性结肠炎药物或保健品中的应用中，应用是用于制备溃疡性结肠炎的保护药物。
9.可选地，在上述外源性给予巨噬细胞aldh2在制备预防或治疗溃疡性结肠炎药物或保健品中的应用中，给药方式采取直接裸dna注射法、脂质体包裹dna直接注射法、金包被dna基因枪轰击法、繁殖缺陷细菌携带质粒dna法、复制缺陷腺病毒携带目的dna法、peg修饰蛋白药物注射法、脂质体包裹蛋白静脉注射法或蛋白微球制剂皮下注射法中的一种。
10.本发明的有益效果为：
11.本发明提供了外源性给予巨噬细胞aldh2在制备预防或治疗溃疡性结肠炎药物或保健品中的应用，实验表明巨噬细胞aldh2蛋白对溃疡性结肠的严重程度及预后都起着保护作用，由于巨噬细胞aldh2是机体内源性蛋白质，因此作为药物的安全性很高。
附图说明
12.为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
13.图1是根据本发明的巨噬细胞系raw264.7细胞的str基因型检测报告；
14.图2是在lps刺激条件下，抑制巨噬细胞aldh2表达后，其促炎因子水平显著升高、抑炎因子水平显著降低；
15.图3是在lps刺激条件下，抑制巨噬细胞aldh2表达后，其自噬小体数量显著降低的投射电镜图和数量统计图。
具体实施方式
16.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述。
17.下列实验实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
18.根据本发明，术语“溃疡性结肠炎”是一种以慢性复发性炎症为特征的肠道病变。在全世界范围内，溃疡性结肠炎的发病率呈逐年上升趋势，严重影响了人类健康和生活质量。溃疡性结肠炎主要起病于直肠或左半结肠远端，向近端结肠组织侵袭，病变一般局限于黏膜层及黏膜下层，病人主要表现为肠道出血、粘液便伴有里急后重感以及下腹疼痛。溃疡性结肠炎的病因复杂，至今仍未阐明，目前普遍认为，溃疡性结肠炎是一种自身免疫性疾病，其发生发展可能与自身基因、免疫和环境因素等有关。研究表明，外源物质入侵引起宿主反应或者易感基因导致的自身防御系统对正常菌群产生过度的炎症免疫反应，都可能引起肠道的损伤，促进溃疡性结肠炎的发生发展。目前应用于临床一线的治疗溃疡性结肠炎
的药物包括氨基水杨酸盐、糖皮质激素、免疫调节剂、生物制剂、抗生素等，虽然可以在一定程度上缓解溃疡性结肠炎的进展，但临床症状缓解效果欠佳，远期治疗效果仍不理想。因此，对于溃疡性结肠炎仍需大量的深入研究。
19.本发明的外源性给予巨噬细胞aldh2在制备预防或治疗溃疡性结肠炎药物或保健品中的应用，外源性给予巨噬细胞aldh2包括以下的至少一种：
20.a)外源性给予巨噬细胞的aldh2蛋白；
21.b)外源性给予巨噬细胞的aldh2的编码基因；
22.c)外源性给予巨噬细胞的含有aldh2编码基因的重组载体；
23.d)外源性给予巨噬细胞的含有aldh2编码基因的重组病毒。
24.其中，b)、c)、d)均可提高巨噬细胞aldh2表达量，外源性给予巨噬细胞的aldh2的编码基因在对象体内经转录翻译为aldh2蛋白产物，重组aldh2可以从biovision公司或abcam公司购得。由于巨噬细胞aldh2是机体内源性蛋白质，因此作为药物的安全性很高。
25.药物的给药方式采取直接裸dna注射法、脂质体包裹dna直接注射法、金包被dna基因枪轰击法、繁殖缺陷细菌携带质粒dna法、复制缺陷腺病毒携带目的dna法、peg修饰蛋白药物注射法、脂质体包裹蛋白静脉注射法或蛋白微球制剂皮下注射法中的一种。
26.本发明选取小鼠巨噬细胞系raw264.7细胞，该细胞购自合肥万物生物科技有限公司，上海翼和应用生物技术有限公司进行str基因型检测，通过sirna转染的方法抑制小鼠巨噬细胞aldh2表达后，给予lps刺激12h后检测细胞上清液的炎症因子水平，发现在lps刺激条件下，与对照组相比，转染aldh2 sirna的巨噬细胞上清液中促炎因子il-1β、il-6、il-12、il-18和tnf-α水平显著升高、抑炎因子il-10水平显著降低；此外，在lps刺激条件下，转染aldh2 sirna的巨噬细胞中具有抗炎作用的自噬水平显著降低。这些结果说明巨噬细胞aldh2蛋白对溃疡性结肠的严重程度及预后都起着保护作用。
27.本发明中，应用于小鼠巨噬细胞的aldh2 sirna及其对照sirna是通过化学合成方法构建，购自苏州金唯智生物科技有限公司，aldh2 sirna序列为：sense:5
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ccgauuggcggaucucauutt-3’，antisense:5
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aaugagauccgccaaucggta-3’。根据以往研究报道，本发明以体外应用lps刺激巨噬细胞模拟溃疡性结肠炎环境，以此研究巨噬细胞在溃疡性结肠炎中的作用及机制。
28.实验1.获得巨噬细胞系raw264.7细胞的str基因型检测报告
29.实验过程：该项目由上海翼和应用生物技术有限公司进行检测，具体实施方法为通过axygen的基因组抽提试剂盒提取dna，采用10-str扩增方案扩增，在abi 3730xl型遗传分析仪上对str位点和性别基因amelogenin进行检测。
30.实验结果：本次检测细胞与对比细胞匹配度ev值为0.96，匹配度好，符合实验要求(如图1所示)。
31.实验2.在lps刺激条件下，抑制巨噬细胞aldh2表达后，其促炎因子水平显著升高、抑炎因子水平显著降低
32.实验过程：
33.1.sirna转染细胞和细胞刺激：1)将种于6孔板中，每孔细胞量为4
×
105个，4组，分别为对照组(vehicle组)、aldh2 sirna组(sirna组)、vehicle+lps组和aldh2 sirna+lps组(sirna+lps组)，每组5个复孔；2)转染开始前每个6孔板更换培养基为1500μl无血清1640培
养基使细胞饥饿；3)每孔分别使用250μl invitrogen的opti-medium低血清培养基稀释8μl转染试剂lipo rna max和4μl sirna，sirna序列为：sense:5
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ccgauuggcggaucucauutt-3’，antisense:5
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aaugagauccgccaaucggta-3’，轻轻吹吸3-5次混匀,静置5分钟；4)将分别稀释了转染试剂和sirna稀释液混合为500μl体系的复合物，轻轻吹吸3-5次混匀，室温下静置20min；5)将500μl体系的转染复合物缓慢滴入6孔板，轻轻晃动6孔板以混匀，将六孔板放回37℃、5％ co2细胞培养箱；6)6小时后更换6孔板培养基为新鲜含血清1640培养基；7)36-48h后收集细胞；8)vehicle+lps组和sirna+lps组细胞培养基中分别加入1000μl lps刺激细胞12h，进行后续检测。
34.2.elisa技术检测上清液炎症因子水平：收集细胞上清液，应用相应elisa检测试剂盒(购自公司)分别检测il-1β、il-6、il-12、il-18、tnf-α和il-10水平。
35.实验结果：在lps刺激条件下，通过sirna抑制巨噬细胞aldh2表达后，促炎因子il-1β、il-6、il-12、il-18和tnf-α水平显著升高、抑炎因子il-10水平显著降低(如图2所示)。
36.这一结果说明，在溃疡性结肠炎细胞模型中，巨噬细胞aldh2具有抑制炎症水平的作用。
37.实验3.lps刺激条件下，抑制巨噬细胞aldh2表达后，其自噬小体数量显著降低
38.实验过程：
39.1.sirna转染细胞和细胞刺激：步骤同实验2(每组为4个复孔)。
40.2.透射电镜技术检测自噬小体：如上刺激后，收集细胞，以2.5％戊二醛溶液置于4℃中固定2h后，应用透射电镜仪器进行拍摄。
41.实验结果：在lps刺激条件下，通过sirna抑制巨噬细胞aldh2表达后，自噬小体数量显著下降(如图3所示，自噬小体已用箭头标注)。
42.这一结果说明，在溃疡性结肠炎细胞模型中，巨噬细胞aldh2与自噬水平呈正相关。
43.以上实施例，仅为本发明的具体实施方式，用以说明本发明的技术方案，而非对其限制，本发明的保护范围并不局限于此，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改或改进，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改、变化或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明实施例技术方案的精神和范围，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以权利要求的保护范围为准。

技术特征：
1.外源性给予巨噬细胞aldh2在制备预防或治疗溃疡性结肠炎药物或保健品中的应用，其特征在于，所述外源性给予巨噬细胞aldh2包括以下的至少一种：a)外源性给予巨噬细胞的aldh2蛋白；b)外源性给予巨噬细胞的aldh2的编码基因；c)外源性给予巨噬细胞的含有aldh2编码基因的重组载体；d)外源性给予巨噬细胞的含有aldh2编码基因的重组病毒。2.根据权利要求1所述的外源性给予巨噬细胞aldh2在制备预防或治疗溃疡性结肠炎药物或保健品中的应用，其特征在于，所述应用是用于制备溃疡性结肠炎的保护药物。3.根据权利要求1或2所述的外源性给予巨噬细胞aldh2在制备预防或治疗溃疡性结肠炎药物或保健品中的应用，其特征在于，所述给药方式采取直接裸dna注射法、脂质体包裹dna直接注射法、金包被dna基因枪轰击法、繁殖缺陷细菌携带质粒dna法、复制缺陷腺病毒携带目的dna法、peg修饰蛋白药物注射法、脂质体包裹蛋白静脉注射法或蛋白微球制剂皮下注射法中的一种。

技术总结
本发明提供了外源性给予巨噬细胞ALDH2在制备预防或治疗溃疡性结肠炎药物或保健品中的应用。本发明经实验证明，在溃疡性结肠炎的巨噬细胞模型上，抑制巨噬细胞ALDH2表达后，促炎因子IL-1β、IL-6、IL-12、IL-18和TNF-α水平显著升高、抑炎因子IL-10水平显著降低；此外，在溃疡性结肠炎的巨噬细胞模型上，抑制巨噬细胞ALDH2表达后，在巨噬细胞中具有抗炎作用的自噬水平显著降低。这些结果说明巨噬细胞ALDH2蛋白对溃疡性结肠的严重程度及预后都起着保护作用。着保护作用。着保护作用。


技术研发人员：邵柏棕 令狐恩强 柴宁莉 李海洋 姚怡
受保护的技术使用者：中国人民解放军总医院第一医学中心
技术研发日：2023.07.07
技术公布日：2023/10/5