检测季节性发情母羊成熟卵泡、诱导排卵配种的方法与流程

1.本发明涉及一种检测季节性发情母羊成熟卵泡、诱导排卵配种的方法，属于动物繁育技术领域。


背景技术：

2.季节性发情母羊，虽然在一个情期内均能形成三至四次卵泡波峰，且每次卵泡波峰的出现都有成熟卵泡生成，通常只有在周期内的最后一个卵泡波当中的卵泡成熟，并与此同时黄体溶解，才会形成排卵。由于在规模化生产过程中，受现有繁殖方法如：自然排卵交配、药物诱发排卵交配、同期发情定时输精、胚胎移植等方法的局限，普遍采用单一的同期发情定时输精的方案，用于对同期发情的多只母羊进行输精、配种，这种方式因忽略了羊与羊存在生理差别，也就是个体差异这一特性，导致母羊的空怀数量多、产羔间隔长，以及成本高、繁殖率低下等问题，最终使养殖场亏损严重。因此有必要对现有技术加以改进。


技术实现要素：

3.本发明旨在提供一种检测季节性发情母羊成熟卵泡、诱导排卵配种的方法，避免母羊的空怀数量多、产羔间隔长，提高母羊群体繁殖率，降低养殖成本，增加养殖效益。
4.本发明通过下列技术方案实现：一种检测季节性发情母羊成熟卵泡、诱导排卵配种的方法，其特征在于包括下列步骤：
5.1)在母羊配种前的72小时、48小时、24小时或当日，采集1
‑‑
10ml母羊血，于阴凉处静置1-2小时，分离出血清；
6.2)将羊的促黄体生成素lh及卵泡刺激素fsh检测试纸，插入步骤1)的血清中5
‑‑
10秒，取出，于15-18分钟后，观察该检测试纸中的质控线c与检测线t1、t2是否显色：
7.3)试纸显色结果如下：
8.羊的促黄体生成素lh及卵泡刺激素fsh检测试纸质控线c未显色、检测线t1或t2显色，表明检测结果无效，需要重新检测；
9.羊的促黄体生成素lh及卵泡刺激素fsh检测试纸质控线c显色，检测线t1与t2未显色，表明母羊的lh及fsh水平低下，需要隔日进行检测；
10.羊的促黄体生成素lh及卵泡刺激素fsh检测试纸质控线c及检测线t1与t2都显色，用该显色与lh及fsh比色卡进行下列对比；
11.31)lh≥30-100miu/ml,fsh≥30-65miu/ml，表明母羊卵泡≥5毫米，肌注促性腺激素释放激素1毫升，12小时后配种；
12.32)lh≥5-30miu/ml,fsh≥65-100miu/ml，表明母羊卵泡≥3
‑‑
4毫米，肌注孕马血清150iu,24小时后配种；
13.33)lh《5miu/ml,fsh《65miu/ml，表明母羊黄体期，于5日后重复步骤1)-3)，羊的促黄体生成素lh及卵泡刺激素fsh检测试纸质控线c及检测线t1与t2都显色，用该显色与lh及fsh比色卡进行对比后，按31)、32)处理；
14.34)步骤33)对比后依旧lh《5miu/ml,fsh《65miu/ml，肌注氯前列烯醇0.2毫克，于48小时后，再重复步骤1)-3)，羊的促黄体生成素lh及卵泡刺激素fsh检测试纸质控线c及检测线t1与t2都显色，用该显色与lh及fsh比色卡进行对比后，按31)或32)处理；
15.35)步骤34)对比后依旧lh《5miu/ml,fsh《5miu/ml，埋置孕酮栓9-12天，撤栓时注射孕马血清促性腺激素(pmsg)250iu,氯前列烯醇(pg)0.2mg，于撤栓53小时检测，lh≥30-100miu/ml,fsh《65miu/ml，输精配种；依旧lh《5miu/ml,fsh《5miu/ml，表明卵巢静止不育，该母羊不能作为种羊，另行处理。
16.所述步骤2)羊的促黄体生成素lh及卵泡刺激素fsh检测试纸经过下列方法制备：
17.21)按下列制备各组分：
18.金溶液：将质量浓度为2％的氯金酸溶液20ml、质量浓度为1％的柠檬酸钠加入纯化水至100ml，加热至溶液呈现紫红色后，冷却至室温，得金溶液；
19.封闭液：将0.005g牛血清白蛋白溶解在300ul纯化水中，加入30ul碳酸钾溶液，混合均匀，得330ul封闭液；
20.样本垫处理液：将0.605g三羧甲氨基甲烷、1.5g氯化钠完全溶解在100ml纯化水中，得样本垫处理液；
21.胶体金结合物稀释液：将0.605g三羧甲氨基甲烷，0.2g聚乙烯吡咯烷酮，5g蔗糖，0.9g氯化钠，0.5g牛血清白蛋白，3ml羊血清，0.15ml吐温20，与100ml纯化水混合均匀，得胶体金结合物稀释液；
22.lh包被液：将100-200mg羊的黄体生成素单克隆α亚级抗体lhmabcoating、质量浓度为1％的海藻糖溶液1ml溶解在0.01m pbs缓冲液100ml中，混合均匀，得lh包被液；
23.fsh包被液：将100-200mg羊的fsh单克隆α亚级抗体fshmabcoating、质量浓度为1％的海藻糖溶液1ml溶解在0.01m pbs缓冲液100ml中，混合均匀，得fsh包被液；
24.igg包被液：将羊抗鼠igg抗体100mg、质量浓度为1％的海藻糖溶液1ml溶解在0.01m pbs缓冲液100ml中，混合均匀，得igg包被液；
25.22)在底板上划膜
26.22a)将nc膜贴在pvc板上表面的中部，得底板；
27.22b)用xyz3010喷金划膜仪，并按0.8μl/cm的量，以500mm/s的速度，将igg包被液均匀地划在步骤22a)底板上的nc膜的上端作为质控线c，将lh包被液均匀地划在nc膜的下端作为检测线t1，质控线c与检测线t1相距3mm
±
1mm；将fsh包被液均匀地划在nc膜的下端作为检测线t2，检测线t1与检测线t2相距3mm
±
1mm；质控线c距离nc膜上端8mm
±
1mm，检测线t2距离nc膜下端7mm
±
1mm，然后放入干燥箱内，于温度为25℃
±
2℃、湿度≤30％下干燥18h
±
2h，得划膜板；
28.23)金垫制备
29.23a)在100ml步骤21)的金溶液中加入1.2ml碳酸钾溶液、1.5-2mglhmb2与fshmb4搅拌40min，滴加330ul封闭液，搅拌10min，于4℃、12000r/min的条件下离心40min，直至上清液变为水，弃上清液，取余液5.3ml，加入40ml胶体金结合物稀释液混匀，形成lhmb2及fshmb4复合胶体金结合物稀释溶液；
30.23b)将40ml lhmb2及fshmb4复合胶体金结合物稀释液均匀铺在1080cm2玻璃纤维素膜rb65上，然后放入干燥箱内，于温度为25℃
±
2℃、湿度≤30％下干燥18h
±
2h，得金垫；
31.24)样本垫制备
32.24a)按30ml/张的量，将步骤21)的样本垫处理液均匀铺在玻璃纤维素膜sb06上，然后放入干燥箱内，于温度为25℃
±
2℃、湿度≤30％下干燥18h
±
2h，得样本垫；
33.25)贴板
34.25a)将步骤23)的金垫贴于步骤22b)划膜板的nc膜下端，并使1-2mm的金垫后端搭在nc膜上；
35.25b)将步骤24)的样本垫贴于步骤25a)的金垫前端上面，并使样本垫后端完全搭在金垫上，样本垫前端贴于pvc板前端；
36.25c)将吸水垫贴于25b)的pvc板后端，并使1-2mm的吸水垫前端搭在nc膜后端；
37.26)将步骤25c)贴板切割成3.0
±
0.5mm的试纸条，得羊的促黄体生成素lh及卵泡刺激素fsh检测试纸。
38.本发明具有下列优点和效果：采用上述方案，可方便、简单、快速、准确地检测出母羊的卵泡大小，进而根据不同大小的卵泡诱导排卵、配种，有效避免母羊空怀期，缩短母羊群体产羔间隔，提高母羊群体繁殖率，降低养殖成本，优选高繁殖力的母羊群体，高质量提升母羊产羔效率，纯化后代母羊群体基因，从而为增加养殖效益提供可靠的技术支持。
附图说明
39.图1为羊的促黄体生成素lh及卵泡刺激素fsh检测试纸条的结构示意图；
40.图2为fsh比色卡图。
41.图3为lh比色卡图。
具体实施方式
42.下面结合实施例对本发明做进一步描述。
43.实施例1
44.羊的促黄体生成素lh及卵泡刺激素fsh检测试纸经过下列方法制备：
45.21)按下列制备各组分：
46.金溶液：将质量浓度为2％的氯金酸溶液20ml、质量浓度为1％的柠檬酸钠加入纯化水至100ml，加热至溶液呈现紫红色后，冷却至室温，得金溶液；
47.封闭液：将0.005g牛血清白蛋白溶解在300ul纯化水中，加入30ul碳酸钾溶液，混合均匀，得330ul封闭液；
48.样本垫处理液：将0.605g三羧甲氨基甲烷、1.5g氯化钠完全溶解在100ml纯化水中，得样本垫处理液；
49.胶体金结合物稀释液：将0.605g三羧甲氨基甲烷，0.2g聚乙烯吡咯烷酮，5g蔗糖，0.9g氯化钠，0.5g牛血清白蛋白，3ml羊血清，0.15ml吐温20，与100ml纯化水混合均匀，得胶体金结合物稀释液；
50.lh包被液：将100-200mg羊的黄体生成素单克隆α亚级抗体lhmabcoating、质量浓度为1％的海藻糖溶液1ml溶解在0.01m pbs缓冲液100ml中，混合均匀，得lh包被液；
51.fsh包被液：将100-200mg羊的fsh单克隆α亚级抗体fshmabcoating、质量浓度为1％的海藻糖溶液1ml溶解在0.01m pbs缓冲液100ml中，混合均匀，得fsh包被液；
52.igg包被液：将羊抗鼠igg抗体100mg、质量浓度为1％的海藻糖溶液1ml溶解在0.01m pbs缓冲液100ml中，混合均匀，得igg包被液；
53.22)在底板上划膜
54.22a)将nc膜贴在pvc板上表面的中部，得底板；
55.22b)用xyz3010喷金划膜仪，并按0.8μl/cm的量，以500mm/s的速度，将igg包被液均匀地划在步骤22a)底板上的nc膜的上端作为质控线c，将lh包被液均匀地划在nc膜的下端作为检测线t1，质控线c与检测线t1相距3mm
±
1mm；将fsh包被液均匀地划在nc膜的下端作为检测线t2，检测线t1与检测线t2相距3mm
±
1mm；质控线c距离nc膜上端8mm
±
1mm，检测线t2距离nc膜下端7mm
±
1mm，然后放入干燥箱内，于温度为25℃
±
2℃、湿度≤30％下干燥18h
±
2h，得划膜板；
56.23)金垫制备
57.23a)在100ml步骤21)的金溶液中加入1.2ml碳酸钾溶液、1.5-2mglhmb2与fshmb4搅拌40min，滴加330ul封闭液，搅拌10min，于4℃、12000r/min的条件下离心40min，直至上清液变为水，弃上清液，取余液5.3ml，加入40ml胶体金结合物稀释液混匀，形成lhmb2及fshmb4复合胶体金结合物稀释溶液；
58.23b)将40ml lhmb2及fshmb4复合胶体金结合物稀释液均匀铺在1080cm2玻璃纤维素膜rb65上，然后放入干燥箱内，于温度为25℃
±
2℃、湿度≤30％下干燥18h
±
2h，得金垫；
59.24)样本垫制备
60.24a)按30ml/张的量，将步骤21)的样本垫处理液均匀铺在玻璃纤维素膜sb06上，然后放入干燥箱内，于温度为25℃
±
2℃、湿度≤30％下干燥18h
±
2h，得样本垫；
61.25)贴板
62.25a)将步骤23)的金垫贴于步骤22b)划膜板的nc膜下端，并使1-2mm的金垫后端搭在nc膜上；
63.25b)将步骤24)的样本垫贴于步骤25a)的金垫前端上面，并使样本垫后端完全搭在金垫上，样本垫前端贴于pvc板前端；
64.25c)将吸水垫贴于25b)的pvc板后端，并使1-2mm的吸水垫前端搭在nc膜后端；
65.26)将步骤25c)贴板切割成3.0
±
0.5mm的试纸条，得羊的促黄体生成素lh及卵泡刺激素fsh检测试纸。
66.实施例2
67.一种检测季节性发情母羊成熟卵泡、诱导排卵配种的方法，其特征在于包括下列步骤：
68.1)在母羊配种前的72小时，采集2ml母羊血，于阴凉处静置1小时，分离出血清；
69.2)将羊的促黄体生成素lh及卵泡刺激素fsh检测试纸，插入步骤1)的血清中5秒，取出，于15分钟后，观察该检测试纸中的质控线c与检测线t1、t2是否显色：
70.3)试纸显色结果如下：
71.羊的促黄体生成素lh及卵泡刺激素fsh检测试纸质控线c未显色、检测线t1或t2显色，表明检测结果无效，需要重新检测。
72.实施例3
73.一种检测季节性发情母羊成熟卵泡、诱导排卵配种的方法，其特征在于包括下列
步骤：
74.1)在母羊配种前的48小时，采集10ml母羊血，于阴凉处静置2小时，分离出血清；
75.2)将羊的促黄体生成素lh及卵泡刺激素fsh检测试纸，插入步骤1)的血清中10秒，取出，于18分钟后，观察该检测试纸中的质控线c与检测线t1、t2是否显色：
76.3)试纸显色结果如下：
77.羊的促黄体生成素lh及卵泡刺激素fsh检测试纸质控线c显色，检测线t1与t2未显色，表明母羊的lh及fsh水平低下，需要隔日进行检测。
78.实施例4
79.一种检测季节性发情母羊成熟卵泡、诱导排卵配种的方法，其特征在于包括下列步骤：
80.1)在母羊配种前的24小时，采集5ml母羊血，于阴凉处静置1.5小时，分离出血清；
81.2)将羊的促黄体生成素lh及卵泡刺激素fsh检测试纸，插入步骤1)的血清中8秒，取出，于17分钟后，观察该检测试纸中的质控线c与检测线t1、t2是否显色：
82.3)试纸显色结果如下：
83.羊的促黄体生成素lh及卵泡刺激素fsh检测试纸质控线c及检测线t1与t2都显色，用该显色与lh及fsh比色卡进行下列对比；
84.lh为50miu/ml,fsh为45miu/ml，表明母羊卵泡≥5毫米，肌注促性腺激素释放激素1毫升，12小时后配种，之后该母羊怀孕。
85.实施例5
86.一种检测季节性发情母羊成熟卵泡、诱导排卵配种的方法，其特征在于包括下列步骤：
87.1)在母羊配种的当日，采集8ml母羊血，于阴凉处静置1小时，分离出血清；
88.2)将羊的促黄体生成素lh及卵泡刺激素fsh检测试纸，插入步骤1)的血清中6秒，取出，于16分钟后，观察该检测试纸中的质控线c与检测线t1、t2是否显色：
89.3)试纸显色结果如下：
90.羊的促黄体生成素lh及卵泡刺激素fsh检测试纸质控线c及检测线t1与t2都显色，用该显色与lh及fsh比色卡进行下列对比；
91.lh为20miu/ml,fsh为75miu/ml，表明母羊卵泡≥3
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4毫米，肌注孕马血清150iu,24小时后配种，之后该母羊怀孕。
92.实施例6
93.一种检测季节性发情母羊成熟卵泡、诱导排卵配种的方法，其特征在于包括下列步骤：
94.1)在母羊配种前的72小时，采集6ml母羊血，于阴凉处静置2小时，分离出血清；
95.2)将羊的促黄体生成素lh及卵泡刺激素fsh检测试纸，插入步骤1)的血清中8秒，取出，于15分钟后，观察该检测试纸中的质控线c与检测线t1、t2是否显色：
96.3)试纸显色结果如下：
97.羊的促黄体生成素lh及卵泡刺激素fsh检测试纸质控线c及检测线t1与t2都显色，用该显色与lh及fsh比色卡进行下列对比：
98.lh为《5miu/ml,fsh为65miu/ml，表明母羊黄体期，于5日后重复步骤1)-3)，羊的促
黄体生成素lh及卵泡刺激素fsh检测试纸质控线c及检测线t1与t2都显色，用该显色与lh及fsh比色卡进行对比后，lh为80miu/ml,fsh为65miu/ml，表明母羊卵泡≥5毫米，肌注促性腺激素释放激素1毫升，12小时后配种，之后该母羊怀孕。
99.实施例7
100.一种检测季节性发情母羊成熟卵泡、诱导排卵配种的方法，其特征在于包括下列步骤：
101.1)在母羊配种前的48小时，采集4ml母羊血，于阴凉处静置1小时，分离出血清；
102.2)将羊的促黄体生成素lh及卵泡刺激素fsh检测试纸，插入步骤1)的血清中6秒，取出，于15分钟后，观察该检测试纸中的质控线c与检测线t1、t2是否显色：
103.3)试纸显色结果如下：
104.羊的促黄体生成素lh及卵泡刺激素fsh检测试纸质控线c及检测线t1与t2都显色，用该显色与lh及fsh比色卡进行对比后；
105.lh《5miu/ml,fsh《65miu/ml，表明母羊黄体期，于5日后重复步骤1)-3)，羊的促黄体生成素lh及卵泡刺激素fsh检测试纸质控线c及检测线t1与t2都显色，用该显色与lh及fsh比色卡进行对比后，依旧lh《5miu/ml,fsh《65miu/ml，肌注氯前列烯醇0.2毫克，于48小时后，再重复步骤1)-3)，羊的促黄体生成素lh及卵泡刺激素fsh检测试纸质控线c及检测线t1与t2都显色，用该显色与lh及fsh比色卡进行对比后，lh为30miu/ml,fsh为90miu/ml，表明母羊卵泡≥3
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4毫米，肌注孕马血清150iu,24小时后配种，之后该母羊怀孕。
106.实施例8
107.一种检测季节性发情母羊成熟卵泡、诱导排卵配种的方法，其特征在于包括下列步骤：
108.1)在母羊配种前的24小时，采集6ml母羊血，于阴凉处静置2小时，分离出血清；
109.2)将羊的促黄体生成素lh及卵泡刺激素fsh检测试纸，插入步骤1)的血清中7秒，取出，于18分钟后，观察该检测试纸中的质控线c与检测线t1、t2是否显色：
110.3)试纸显色结果如下：
111.羊的促黄体生成素lh及卵泡刺激素fsh检测试纸质控线c及检测线t1与t2都显色，用该显色与lh及fsh比色卡进行对比后，lh《5miu/ml,fsh《65miu/ml，表明母羊黄体期，于5日后重复步骤1)-3)，羊的促黄体生成素lh及卵泡刺激素fsh检测试纸质控线c及检测线t1与t2都显色，用该显色与lh及fsh比色卡进行对比后，依旧lh《5miu/ml,fsh《65miu/ml，肌注氯前列烯醇0.2毫克，于48小时后，再重复步骤1)-3)，羊的促黄体生成素lh及卵泡刺激素fsh检测试纸质控线c及检测线t1与t2都显色，用该显色与lh及fsh比色卡进行对比后，依旧lh《5miu/ml,fsh《5miu/ml，埋置孕酮栓9-12天，撤栓时注射孕马血清促性腺激素(pmsg)250iu,氯前列烯醇(pg)0.2mg，于撤栓53小时检测lh为30-100miu/ml,fsh《65miu/ml，输精配种，之后该母羊怀孕。
112.实施例9
113.一种检测季节性发情母羊成熟卵泡、诱导排卵配种的方法，其特征在于包括下列步骤：
114.1)在母羊配种前的24小时，采集6ml母羊血，于阴凉处静置2小时，分离出血清；
115.2)将羊的促黄体生成素lh及卵泡刺激素fsh检测试纸，插入步骤1)的血清中7秒，
取出，于18分钟后，观察该检测试纸中的质控线c与检测线t1、t2是否显色：
116.3)试纸显色结果如下：
117.羊的促黄体生成素lh及卵泡刺激素fsh检测试纸质控线c及检测线t1与t2都显色，用该显色与lh及fsh比色卡进行对比后，lh《5miu/ml,fsh《65miu/ml，表明母羊黄体期，于5日后重复步骤1)-3)，羊的促黄体生成素lh及卵泡刺激素fsh检测试纸质控线c及检测线t1与t2都显色，用该显色与lh及fsh比色卡进行对比后，依旧lh《5miu/ml,fsh《65miu/ml，肌注氯前列烯醇0.2毫克，于48小时后，再重复步骤1)-3)，羊的促黄体生成素lh及卵泡刺激素fsh检测试纸质控线c及检测线t1与t2都显色，用该显色与lh及fsh比色卡进行对比后，依旧lh《5miu/ml,fsh《5miu/ml，埋置孕酮栓9-12天，撤栓时注射孕马血清促性腺激素(pmsg)250iu,氯前列烯醇(pg)0.2mg，于撤栓53小时检测lh《5miu/ml,fsh《5miu/ml，经内窥镜检查后是因为炎症引起生殖道梗阻，该母羊不能作为种羊，另行处理。
118.下面通过对比实验证明本发明的效果：
119.采用本发明实施例的方法分别对40只母羊进行检测，检测结果如下：
120.有29只母羊按时配种后，均怀孕；有5只母羊重复检测后，按时配种并怀孕；有4只母羊没有结果，分栏后仍没有检测结果，原因是激素水平低于配种水平，经超声探测结果为卵巢发育不全，垂体分泌的激素水平低于试纸检测的灵敏度，分栏后仍没有检测结果，另行处理；有2只母羊按时配种后，没有怀孕，经内窥镜检查后是因为炎症引起生殖道梗阻，另行处理。

技术特征：
1.一种检测季节性发情母羊成熟卵泡、诱导排卵配种的方法，其特征在于包括下列步骤：1)在母羊配种前的72小时、48小时、24小时或当日，采集1
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10ml母羊血，于阴凉处静置1-2小时，分离出血清；2)将羊的促黄体生成素lh及卵泡刺激素fsh检测试纸，插入步骤1)的血清中5
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10秒，取出，于15-18分钟后，观察该检测试纸中的质控线c与检测线t1、t2是否显色；3)试纸显色结果如下：羊的促黄体生成素lh及卵泡刺激素fsh检测试纸质控线c未显色、检测线t1或t2显色，表明检测结果无效，需要重新检测；羊的促黄体生成素lh及卵泡刺激素fsh检测试纸质控线c显色，检测线t1与t2未显色，表明母羊的lh及fsh水平低下，需要隔日进行检测；羊的促黄体生成素lh及卵泡刺激素fsh检测试纸质控线c及检测线t1与t2都显色，用该显色与lh及fsh比色卡进行下列对比；31)lh≥30-100miu/ml,fsh≥30-65miu/ml，表明母羊卵泡≥5毫米，肌注促性腺激素释放激素1毫升，12小时后配种；32)lh≥5-30miu/ml,fsh≥65-100miu/ml，表明母羊卵泡≥3
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4毫米，肌注孕马血清150iu,24小时后配种；33)lh<10miu/ml,fsh<65miu/ml，表明母羊黄体期，于5日后重复步骤1)-3)，羊的促黄体生成素lh及卵泡刺激素fsh检测试纸质控线c及检测线t1与t2都显色，用该显色与lh及fsh比色卡进行对比后，按31)、32)处理；34)步骤33)对比后依旧lh<5miu/ml,fsh<65miu/ml，肌注氯前列烯醇(pg)0.2毫克，于48小时后，再重复步骤1)-3)，羊的促黄体生成素lh及卵泡刺激素fsh检测试纸质控线c及检测线t1与t2都显色，用该显色与lh及fsh比色卡进行对比后，按31)或32)处理；35)步骤34)对比后依旧lh<5miu/ml,fsh<5miu/ml，母羊处于卵巢静止，埋置孕酮栓9-12天，撤栓时注射孕马血清促性腺激素(pmsg)250iu,氯前列烯醇(pg)0.2mg，于撤栓53小时检测lh≥30-100miu/ml,fsh<65miu/ml，输精配种；当依旧lh<5miu/ml,fsh<5miu/ml，表明卵巢静止不育，该母羊不能作为种羊，另行处理。2.根据权利要求1所述的检测季节性发情母羊成熟卵泡、诱导排卵配种的方法，其特征在于所述步骤2)羊的促黄体生成素lh及卵泡刺激素fsh检测试纸经过下列方法制备：21)按下列制备各组分：金溶液：将质量浓度为2％的氯金酸溶液20ml、质量浓度为1％的柠檬酸钠加入纯化水至100ml，加热至溶液呈现紫红色后，冷却至室温，得金溶液；封闭液：将0.005g牛血清白蛋白溶解在300ul纯化水中，加入30ul碳酸钾溶液，混合均匀，得330ul封闭液；样本垫处理液：将0.605g三羧甲氨基甲烷、1.5g氯化钠完全溶解在100ml纯化水中，得样本垫处理液；胶体金结合物稀释液：将0.605g三羧甲氨基甲烷，0.2g聚乙烯吡咯烷酮，5g蔗糖，0.9g氯化钠，0.5g牛血清白蛋白，3ml羊血清，0.15ml吐温20，与100ml纯化水混合均匀，得胶体金结合物稀释液；
lh包被液：将100-200mg羊的黄体生成素单克隆α亚级抗体lhmabcoating、质量浓度为1％的海藻糖溶液1ml溶解在0.01m pbs缓冲液100ml中，混合均匀，得lh包被液；fsh包被液：将100-200mg羊的fsh单克隆α亚级抗体fshmabcoating、质量浓度为1％的海藻糖溶液1ml溶解在0.01m pbs缓冲液100ml中，混合均匀，得fsh包被液；igg包被液：将羊抗鼠igg抗体100mg、质量浓度为1％的海藻糖溶液1ml溶解在0.01m pbs缓冲液100ml中，混合均匀，得igg包被液；22)在底板上划膜22a)将nc膜贴在pvc板上表面的中部，得底板；22b)用xyz3010喷金划膜仪，并按0.8μl/cm的量，以500mm/s的速度，将igg包被液均匀地划在步骤22a)底板上的nc膜的上端作为质控线c，将lh包被液均匀地划在nc膜的下端作为检测线t1，质控线c与检测线t1相距3mm
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1mm；将fsh包被液均匀地划在nc膜的下端作为检测线t2，检测线t1与检测线t2相距3mm
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1mm；质控线c距离nc膜上端8mm
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1mm，检测线t2距离nc膜下端7mm
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1mm，然后放入干燥箱内，于温度为25℃
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2℃、湿度≤30％下干燥18h
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2h，得划膜板；23)金垫制备23a)在100ml步骤21)的金溶液中加入1.2ml碳酸钾溶液、1.5-2mglhmb2与fshmb4搅拌40min，滴加330ul封闭液，搅拌10min，于4℃、12000r/min的条件下离心40min，直至上清液变为水，弃上清液，取余液5.3ml，加入40ml胶体金结合物稀释液混匀，形成lhmb2及fshmb4复合胶体金结合物稀释溶液；23b)将40ml lhmb2及fshmb4复合胶体金结合物稀释液均匀铺在1080cm2玻璃纤维素膜rb65上，然后放入干燥箱内，于温度为25℃
±
2℃、湿度≤30％下干燥18h
±
2h，得金垫；24)样本垫制备24a)按30ml/张的量，将步骤21)的样本垫处理液均匀铺在玻璃纤维素膜sb06上，然后放入干燥箱内，于温度为25℃
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2℃、湿度≤30％下干燥18h
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2h，得样本垫；25)贴板25a)将步骤23)的金垫贴于步骤22b)划膜板的nc膜下端，并使1-2mm的金垫后端搭在nc膜上；25b)将步骤24)的样本垫贴于步骤25a)的金垫前端上面，并使样本垫后端完全搭在金垫上，样本垫前端贴于pvc板前端；25c)将吸水垫贴于25b)的pvc板后端，并使1-2mm的吸水垫前端搭在nc膜后端；26)将步骤25c)贴板切割成3.0
±
0.5mm的试纸条，得羊的促黄体生成素lh及卵泡刺激素fsh检测试纸。

技术总结
本发明涉及一种检测季节性发情母羊成熟卵泡、诱导排卵配种的方法，包括：在母羊配种前72小时、48小时、24小时或当日，采集羊血、分离出血清；将羊的促黄体生成素LH及卵泡刺激素FSH检测试纸，插入血清中后，试纸质控线C未显色、检测线T1、T2显色，检测无效；质控线C显色，检测线T1、T2未显色，要隔日检测；质控线C及检测线T1、T2都显色，表时母羊有卵泡，适时肌注促性腺激素释放激素或孕马血清后，配种，有效避免母羊空怀期，缩短产羔间隔，提高繁殖率，降低养殖成本，优选高繁殖力的母羊群体，纯化后代母羊基因，快速淘汰繁殖障碍母羊群，为增加养殖效益提供可靠的技术支持。殖效益提供可靠的技术支持。


技术研发人员：金义达 马海鹏
受保护的技术使用者：昆明天沃生物科技有限公司
技术研发日：2023.07.08
技术公布日：2023/10/5