一种高纯度胶原蛋白及其制备方法和应用与流程

1.本发明属于蛋白质加工技术领域，具体涉及一种高纯度胶原蛋白及其制备方法和应用。


背景技术：

2.胶原蛋白是一种天然的生物高分子材料，是由3条肽链组成的具有三维螺旋结构的纤维状蛋白质，其广泛存在于哺乳动物体内，是细胞外基质中最重要的组成成分，在生物医药、化妆品、食品中均有广泛应用。胶原蛋白一般是从动物真皮、肌腱、基底膜等富含胶原蛋白的动物组织中提取，提取法包括酸法、碱法和酶解法，酸法或碱法提取存在环境污染重且得率低的问题，而酶解法反应条件温和且提取效率高，成为目前主要的制备方法。
3.cn102131403a公开了一种高纯度胶原蛋白的制备方法，通过先制造胶原蛋白基质，然后再由基质萃取出胶原蛋白，其先将动物的结缔组织用酸浸泡膨胀后再清洗去除非胶原蛋白物质，但是在洗涤的过程中会连同酸溶性胶原蛋白共同去除而造成损失，且利用溶液溶出胶原蛋白再进行萃取的方法效率和产率比较低。
4.cn105063148a公开了一种以牛皮为主要原料来制备胶原蛋白的制备方法。首先匀浆消化、吸附过滤、超滤浓缩换缓冲液、离子交换层析、超滤浓缩换保存液、过滤除菌制备胶原蛋白原液，再通过蛋白沉淀、离心、匀浆纤维后获得胶原蛋白。但是其酶解温度过低使酶解周期过长(7-10天)，并且利用离子层析来提高纯度的方法生产成本较高，过程复杂。
5.cn109207545公开了公开一种胶原蛋白提取方法，包括：
①
牛跟腱解冻，去血水、表面异物和筋膜，用溶液进行一次预处理；
②
步骤一处理的牛跟腱去脂肪膜，用溶液进行二次预处理；
③
步骤二处理完的牛跟腱冷冻后切片，用溶液进行前处理；
④
将前处理完的牛跟腱切片持续酶解，离心取上清制备胶原粗提液；
⑤
调节胶原粗提液ph，加入中性盐盐析，离心获得胶原蛋白沉淀；
⑥
加入磷酸盐缓冲液溶解上述沉淀，获得特定浓度的胶原蛋白。但是，该方法由于原料本身结构致密且处理时间较短，非胶原物质不易去除完全，同时酶解温度过低，酶解效率和胶原蛋白产率偏低。
6.现有技术中制备胶原蛋白的主要步骤包括：原料前处理、酶解、纯化、冷冻干燥等，由于提取技术工艺参数的不同，目前胶原蛋白纯度大多在95％以下。总体来讲，现有提取技术工艺复杂，生产成本高，纯度有待提高。并且，从动物组织中提取的胶原蛋白存在动物源免疫原性物质，该免疫原性物质能否充分去除是值得关注的问题，因此，开发一种高纯度、低免疫原性、低生产成本的胶原蛋白制备方法，是本领域的研究重点。


技术实现要素：

7.针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种高纯度胶原蛋白及其制备方法和应用，制备得到的胶原蛋白具有纯度高、免疫原性低的特点。
8.为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
9.第一方面，本发明提供一种高纯度胶原蛋白的制备方法，所述制备方法包括如下
步骤：
10.(1)取动物身上的结缔组织进行病毒灭活处理，得到病毒灭活组织；
11.(2)将所述病毒灭活组织进行脱细胞处理，得到胶原蛋白基质；
12.(3)将所述胶原蛋白基质裁切后浸泡于酸溶液中，并加入胃蛋白酶进行酶解，得到酶解液，将酶解液进行离心，收集上清液；
13.(4)将所述上清液调节ph至中性，进行一次盐析，收集沉淀a，将所述沉淀a溶于酸性溶液，进行二次盐析，收集沉淀b，将沉淀b进行透析、冷冻干燥、灭菌后，得到所述高纯度胶原蛋白。
14.本发明采用动物身上的结缔组织包括真皮组织、皮下组织、韧带、筋腱、腱膜、腹膜、软骨以及骨头组织等，将结缔组织做削薄处理，洗涤液渗入的较为彻底可以使非胶原蛋白物质去除完全，保障了胶原蛋白的纯度；采用酸性条件进行酶解，目的是得到无端肽胶原蛋白溶液；再经过对盐析时的条件、顺序、盐浓度等因素进行筛选，本发明采用两步盐析法，先中性再酸性的条件对胶原蛋白溶液进行盐析纯化，得到高纯度、低免疫原的胶原蛋白。
15.优选地，所述结缔组织的厚度≤5mm，例如可以为4.5mm、4mm、3.5mm、3mm、2.5mm、2mm、1.5mm、1mm、0.5mm等。
16.优选地，所述病毒灭活处理采用的试剂为过氧化物溶液。
17.所述过氧化物溶液中的过氧化物包括过氧乙酸和/或过氧化氢。
18.优选地，所述过氧化物溶液中过氧化物的质量百分含量为0.2-0.6％，例如可以为0.3％、0.4％、0.5％等。
19.优选地，所述结缔组织与过氧化物溶液的质量体积比为1:(20-30)，例如可以为1:22、1:24、1:26、1:28等，以结缔组织为1g计，过氧化物溶液的体积为20-30ml。
20.优选地，所述病毒灭活处理的时间为1-3h，例如可以为1.2h、1.4h、1.6h、1.8h等。
21.优选地，所述脱细胞处理的时间为6-30h，例如可以为7h、9h、11h、13h、15h、17h、19h、21h、23h、25h、27h、29h等。
22.优选地，所述脱细胞处理采用的试剂包括无机碱溶液、蛋白酶溶液、有机溶剂溶液或表面活性剂溶液中的任意一种或至少两种的组合。
23.优选地，所述脱细胞处理采用的试剂为无机碱溶液、蛋白酶溶液和有机溶剂溶液的组合。
24.优选地，所述脱细胞处理采用的试剂为无机碱溶液、表面活性剂溶液和有机溶剂溶液的组合。
25.优选地，所述无机碱溶液的处理时间为4-7h，例如可以为4.5h、5h、5.5h、6h、6.5h等。
26.优选地，所述蛋白酶溶液的处理时间为1.5-5h，例如可以为2h、2.5h、3h、3.5h、4h、4.5h等。
27.优选地，所述有机溶剂溶液的处理时间为6-10h，例如可以为7h、8h、9h等。
28.优选地，所述表面活性剂溶液的处理时间为1.5-5h，例如可以为2h、2.5h、3h、3.5h、4h、4.5h等。
29.所述脱细胞处理的程度较为彻底，更有利于后续胶原蛋白的提纯，其中，无机碱溶液作用是去杂蛋白；蛋白酶溶液或表面活性剂的作用是脱细胞中的dna残片，有机溶剂溶液
的作用是脱脂。
30.优选地，所述碱溶液中的碱包括碳酸钠、碳酸氢钠或氢氧化钠中的任意一种或至少两种的组合。
31.优选地，所述碱溶液中的碱的质量百分含量为0.2-0.8％，例如可以为0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％等。
32.优选地，所述蛋白酶溶液中的蛋白酶包括碱性蛋白酶、中性蛋白酶、分散酶、胰蛋白酶或无花果蛋白酶中的任意一种或至少两种的组合。
33.优选地，所述蛋白酶溶液中的蛋白酶的质量百分含量为2-6％，例如可以为3％、4％、5％等。
34.优选地，所以有机溶剂溶液中有机溶剂包括乙醇、乙醚、异丙醇或氯仿中的任意一种或至少两种的组合。
35.优选地，所以有机溶剂溶液中有机溶剂的质量百分含量为15-20％，例如可以为16％、17％、18％、19％等。
36.优选地，所述表面活性剂溶液中的表面活性剂包括sds(十二烷基磺酸钠)、tritonx-100(聚乙二醇辛基苯基醚)、脱氧胆酸盐、chaps(丙磺酸内盐)中的任意一种或至少两种的组合。
37.优选地，所述表面活性剂溶液中的表面活性剂的质量百分含量为0.5-2％，例如可以为0.6％、0.8％、1％、1.2％、1.4％等。
38.优选地，所述脱细胞处理时采用辅助震荡处理。
39.优选地，步骤(3)中所述酸溶液中酸的质量百分含量为5-20％，例如可以为6％、8％、10％、12％、14％、16％、18％等。
40.优选地，步骤(3)中所述酸溶液中的酸包括乙酸、草酸、柠檬酸、醋酸、磷酸或乳酸中的任意一种或至少两种的组合。
41.优选地，所述胃蛋白酶的添加量为0.5-3.0g/l，例如可以为0.6g/l、0.8g/l、1g/l、1.2g/l、1.4g/l、1.6g/l、1.8g/l、2g/l、2.2g/l、2.4g/l、2.6g/l、2.8g/l等，以酸溶液体积为1l计，胃蛋白酶的添加量为0.5-3g。
42.优选地，所述酶解的温度为15-30℃(例如可以为16℃、18℃、20℃、22℃、24℃、26℃、28℃等)，时间为10-30h(例如可以为12h、14h、16h、18h、20h、22h、24h、26h、28h等)。
43.优选地，所述一次盐析时氯化钠的添加量为2-5mol/l，例如可以为2.2mol/l、2.4mol/l、2.6mol/l、2.8mol/l、3mol/l、3.2mol/l、3.4mol/l、3.6mol/l、3.8mol/l、4mol/l、4.2mol/l、4.4mol/l、4.6mol/l、4.8mol/l等。
44.优选地，所述一次盐析时氯化钠的添加量为2.2-2.8mol/l，例如可以为2.3mol/l、2.4mol/l、2.5mol/l、2.6mol/l、2.7mol/l等。
45.优选地，所述二次盐析时氯化钠的添加量为0.5-2mol/l，例如可以为0.6mol/l、0.8mol/l、1mol/l、1.2mol/l、1.4mol/l、1.6mol/l、1.8mol/l等。
46.优选地，所述二次盐析时氯化钠的添加量为0.6-1.2mol/l，例如可以为0.7mol/l、0.8mol/l、0.9mol/l、1mol/l、0.1mol/l等。
47.优选地，所述二次盐析时体系的ph值为4.2-5.8，例如可以为4.4、4.6、4.8、5、5.2、5.4、5.6等。
48.本发明采用的盐析浓度可以在中性和酸性条件下达到胶原蛋白的等电点，利于胶原蛋白的析出和提纯，若氯化钠浓度过低或过高，会析出一些杂质蛋白，从而影响纯度，同时因无法最大限度析出胶原蛋白而影响产率。
49.优选地，所述灭菌采用co60辐照。
50.上述各项数值范围中的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
51.优选地，所述制备方法包括如下步骤：
52.(1)取动物身上的结缔组织与过氧化物溶液按照质量体积比为1:(20-30)混合，进行病毒灭活处理1-3h，得到病毒灭活组织；
53.(2)将所述病毒灭活组织进行脱细胞处理6-30h，得到胶原蛋白基质；
54.所述脱细胞处理采用的试剂为无机碱溶液、蛋白酶溶液和有机溶剂溶液的组合；
55.所述脱细胞处理采用的试剂为无机碱溶液、表面活性剂溶液和有机溶剂溶液的组合；
56.(3)将所述胶原蛋白基质裁切后浸泡于酸溶液中，并加入胃蛋白酶于15-30℃进行酶解10-30h，得到酶解液，将酶解液进行离心，收集上清液；
57.所述酸溶液中酸的质量百分含量为5-20％；所述胃蛋白酶的添加量为0.5-3.0g/l；
58.(4)将所述上清液调节ph至中性，添加氯化钠至2-5mol/l，进一步地添加氯化钠至2.2-2.8mol/l进行一次盐析，收集沉淀a，将所述沉淀a溶于酸性溶液，调节ph值为4.2-5.8时再添加氯化钠至0.5-2mol/l，进一步地添加氯化钠至0.6-1.2mol/l进行二次盐析，收集沉淀b，将沉淀b进行透析、冷冻干燥、采用co60辐照灭菌，得到所述高纯度胶原蛋白。
59.第二方面，本发明提供一种高纯度胶原蛋白，所述高纯度胶原蛋白采用如第一方面所述的制备方法制备得到。
60.优选地，所述高纯度胶原蛋白的纯度≥99.3％，例如可以为99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％等。
61.上述各项数值范围中的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
62.第三方面，本发明提供一种如第二方面所述的高纯度胶原蛋白在生物医疗器械产品中的应用。
63.相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
64.本发明采用的动物身上的结缔组织并作削薄处理，洗涤液渗入的较为彻底可以使非胶原蛋白物质去除完全，保障了胶原蛋白的低免疫原性以及后续胶原蛋白的提纯；针对酶解液的纯化本发明采用两步盐析法，先中性再酸性的条件采用不同浓度的氯化钠对胶原蛋白溶液进行盐析纯化，得到高纯度、低免疫原性的胶原蛋白，并且该制备方法成本低、易于操作。
具体实施方式
65.下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
66.本文所用术语“包含”、“包括”、“具有”、“含有”或其任何其它变形，意在覆盖非排它性的包括。例如，包含所列要素的组合物、步骤、方法、制品或装置不必仅限于那些要素，
还可包括未明确列出的其它要素或此种组合物、步骤、方法、制品或装置所固有的要素。
[0067]“任选的”或者“任意一种”是指其后描述的事项或事件可以发生或不发生，而且该描述包括事件发生的情形和事件不发生的情形。
[0068]
本发明要素或组分前的不定冠词“一种”和“一个”对要素或组分的数量要求(即出现次数)无限制性。因此“一个”或“一种”应被解读为包括一个或至少一个，并且单数形式的要素或组分也包括复数形式，除非所述数量明显只指单数形式。
[0069]
本发明所描述的术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例性地”、“具体示例”或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本文中，对上述术语的示意性表述不是必须针对相同的实施例或示例。
[0070]
以下实施例中试剂或仪器来源如下：
[0071]
胰蛋白酶、胃蛋白酶、分散酶：均购于北京索莱宝科技有限公司；
[0072]
其余试剂均为常规市售产品。
[0073]
实施例1
[0074]
本实施例提供一种高纯度胶原蛋白，所述高纯度胶原蛋白的制备方法包括如下步骤：
[0075]
(1)取新鲜的猪小肠，沿中间剪开，刮除小肠黏膜层、肌层、浆膜得到猪小肠粘膜下层，清洗后将猪小肠粘膜下层原料浸泡于25倍量的0.1％的过氧乙酸溶液浸泡2h进行病毒灭活处理；
[0076]
(2)病毒灭活后的组织分别于20％的乙醇溶液浸泡7h，再2％的胰蛋白酶溶液浸泡3h，然后0.2％的氢氧化钠溶液浸泡5h，浸泡的同时辅助振荡处理，充分清洗去除非胶原蛋白物质，得到胶原蛋白基质；
[0077]
(3)将胶原蛋白基质裁切得到1cm2的膜状片材后，先浸泡在10％的乙酸溶液中溶胀，然后再加入胃蛋白酶至0.5g/l，在20℃的温度下搅拌反应24h进行酶解，酶解反应结束后，将酶解液离心，收集酶解上清液；
[0078]
(4)将酶解上清液用氢氧化钠溶液调节ph至7.0，加入nacl颗粒使其浓度为2.5mol/l，离心收集沉淀，将沉淀用乙酸溶液溶解后，调ph至4.2，再次加入nacl颗粒使其浓度为0.8mol/l，离心收集沉淀；
[0079]
(5)将步骤(4)得到的沉淀装入50kda透析袋中透析，收集胶原蛋白溶液，将胶原蛋白溶液冷冻干燥48h，再用co60辐照灭菌，即得高纯度胶原蛋白。
[0080]
实施例2
[0081]
本实施例提供一种高纯度胶原蛋白，所述高纯度胶原蛋白的制备方法包括如下步骤：
[0082]
(1)取猪身上皮肤组织，除去脂质后，以盐水清洗皮数次，以植皮刀除去皮的表皮层以获得厚度为0.3mm的真皮组织，清洗后将真皮组织浸泡于20倍量的0.3％的过氧乙酸溶液浸泡1h进行病毒灭活处理；
[0083]
(2)病毒灭活后的组织分别于15％的异丙醇溶液浸泡8h，再5％的分散酶溶液浸泡2h，然后0.3％的碳酸钠溶液浸泡6h，浸泡的同时辅助超声处理，充分清洗去除非胶原蛋白物质，得到胶原蛋白基质；
[0084]
(3)将胶原蛋白基质裁切得到2cm2左右的膜状片材后，浸泡在15％的柠檬酸酸溶液中，10h后加入胃蛋白酶至1.0g/l，在24℃的温度下搅拌反应12h，酶解反应结束后，将酶解液离心，收集酶解上清液；
[0085]
(4)将酶解上清液用碱溶液调节ph至7.0，加入nacl颗粒使其浓度为2.8mol/l，离心收集沉淀。将沉淀溶于柠檬酸溶液，调ph至5，再次加入nacl颗粒使其浓度为0.6mol/l，离心收集沉淀；
[0086]
(5)将以上得到的沉淀装入50kda透析袋中透析，收集胶原蛋白溶液，将胶原蛋白溶液冷冻干燥48h，再用co60辐照灭菌，即得高纯度胶原蛋白。
[0087]
实施例3
[0088]
本实施例提供一种高纯度胶原蛋白，所述高纯度胶原蛋白的制备方法包括如下步骤：
[0089]
(1)自牛身上取得牛蹄筋组织，除去筋膜后，以盐水清洗数次，将牛跟腱削薄后浸泡于25倍量的0.3％的过氧化氢溶液浸泡1h进行病毒灭活处理；
[0090]
(2)病毒灭活后的组织分别于1％的sds溶液浸泡6h，再6％的胰蛋白酶溶液浸泡4h，然后0.5％的氢氧化钠溶液浸泡5h，浸泡的同时辅助振荡处理，充分清洗去除非胶原蛋白物质，得到胶原蛋白基质；
[0091]
(3)将胶原蛋白基质裁切得到6cm2左右的膜状片材后，浸泡在20％的乙酸溶液中，8h后加入胃蛋白酶至1.5g/l，在25℃的温度下搅拌反应10h，酶解反应结束后，将酶解液离心，收集酶解上清液；
[0092]
(4)将酶解上清液用碱溶液调节ph至7.2，加入nacl颗粒使其浓度为2.2mol/l，离心收集沉淀，将沉淀用乙酸溶液溶解后，调ph至5.8，再次加入nacl颗粒使其浓度为1.2mol/l，离心收集沉淀；
[0093]
(5)将以上得到的沉淀装入50kda透析袋中透析，收集胶原蛋白溶液，将胶原蛋白溶液冷冻干燥48h，再用co60辐照灭菌，即得高纯度胶原蛋白。
[0094]
实施例4
[0095]
本实施例提供一种高纯度胶原蛋白，其与实施例1的区别仅在于将步骤(2)中的2％胰蛋白酶溶液替换为等量的1％sds溶液；其他原料、用量和制备方法均与实施例1相同。
[0096]
实施例5
[0097]
本实施例提供一种高纯度胶原蛋白，所述高纯度胶原蛋白的制备方法包括如下步骤：
[0098]
其与实施例1的区别仅在于步骤(2)不同，本实施例步骤(2)为：
[0099]
病毒灭活后的组织分别于20％的乙醇溶液浸泡7h，再2％的胰蛋白酶溶液浸泡3h，浸泡的同时辅助振荡处理，充分清洗去除非胶原蛋白物质，得到胶原蛋白基质；其他原料、用量和制备方法均与实施例1相同。
[0100]
实施例6
[0101]
本实施例提供一种高纯度胶原蛋白，其与实施例1的区别仅在于步骤(2)不同，本实施例步骤(2)为：
[0102]
病毒灭活后的组织分别于2％的胰蛋白酶溶液浸泡3h，再0.2％的氢氧化钠溶液浸泡5h，浸泡的同时辅助振荡处理，充分清洗去除非胶原蛋白物质，得到胶原蛋白基质；其他
原料、用量和制备方法均与实施例1相同。
[0103]
实施例7
[0104]
本实施例提供一种高纯度胶原蛋白，其与实施例1的区别仅在于步骤(2)不同，本实施例步骤(2)为：
[0105]
病毒灭活后的组织分别于20％的乙醇溶液7h，再0.2％的氢氧化钠溶液浸泡5h，浸泡的同时辅助振荡处理，充分清洗去除非胶原蛋白物质，得到胶原蛋白基质；其他原料、用量和制备方法均与实施例1相同。
[0106]
实施例8
[0107]
本实施例提供一种高纯度胶原蛋白，其与实施例1的区别仅在于步骤(4)不同，本对比例的步骤(4)为：
[0108]
将酶解上清液用氢氧化钠溶液调节ph至7.0，加入nacl颗粒使其浓度为2mol/l，离心收集沉淀，将沉淀用乙酸溶液溶解后，调ph至4.2，再次加入nacl颗粒使其浓度为0.8mol/l，离心收集沉淀；其他原料、用量和制备方法均与实施例1相同。
[0109]
实施例9
[0110]
本实施例提供一种高纯度胶原蛋白，其与实施例1的区别仅在于步骤(4)不同，本对比例的步骤(4)为：
[0111]
将酶解上清液用氢氧化钠溶液调节ph至7.0，加入nacl颗粒使其浓度为5mol/l，离心收集沉淀，将沉淀用乙酸溶液溶解后，调ph至4.2，再次加入nacl颗粒使其浓度为0.8mol/l，离心收集沉淀；其他原料、用量和制备方法均与实施例1相同。
[0112]
实施例10
[0113]
本实施例提供一种高纯度胶原蛋白，其与实施例1的区别仅在于步骤(4)不同，本对比例的步骤(4)为：
[0114]
将酶解上清液用氢氧化钠溶液调节ph至7.0，加入nacl颗粒使其浓度为2.5mol/l，离心收集沉淀，将沉淀用乙酸溶液溶解后，调ph至4.2，再次加入nacl颗粒使其浓度为0.5mol/l，离心收集沉淀；其他原料、用量和制备方法均与实施例1相同。
[0115]
实施例11
[0116]
本实施例提供一种高纯度胶原蛋白，其与实施例1的区别仅在于步骤(4)不同，本对比例的步骤(4)为：
[0117]
将酶解上清液用氢氧化钠溶液调节ph至7.0，加入nacl颗粒使其浓度为2.5mol/l，离心收集沉淀，将沉淀用乙酸溶液溶解后，调ph至4.2，再次加入nacl颗粒使其浓度为2mol/l，离心收集沉淀；其他原料、用量和制备方法均与实施例1相同。
[0118]
对比例1
[0119]
本对比例提供一种高纯度胶原蛋白，其与实施例1的区别仅在于将胃蛋白酶替换为等量的木瓜蛋白酶；其他原料、用量和制备方法均与实施例1相同。
[0120]
对比例2
[0121]
本对比例提供一种高纯度胶原蛋白，其与实施例1的区别仅在于步骤(4)不同，本对比例的步骤(4)为：
[0122]
将酶解上清液用氢氧化钠溶液调节ph至7.0，加入nacl颗粒使其浓度为2.5mol/l，离心收集沉淀；其他原料、用量和制备方法均与实施例1相同。
[0123]
对比例3
[0124]
本对比例提供一种高纯度胶原蛋白，其与实施例1的区别仅在于步骤(4)不同，本对比例的步骤(4)为：
[0125]
将酶解上清液调ph至4.2，加入nacl颗粒使其浓度为0.8mol/l，离心收集沉淀；其他原料、用量和制备方法均与实施例1相同。
[0126]
测试例1
[0127]
纯度测试
[0128]
样品：实施例、对比例制备的胶原蛋白；
[0129]
测试方法：根据sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)银染法及凝胶成像系统进行纯度的检测计算；
[0130]
检测得到的纯度结果如表1所示。
[0131]
测试例2
[0132]
免疫原性测试
[0133]
按照医疗器械免疫原性评价方法yy/t1465.2-2016《医疗器械免疫原性评价方法第2部分：血清免疫球蛋白和补体成分测定》的方法，设阳性对照组(bsa)、阴性对照组和试验样品组，试验样品组为本发明实施例、对比例制备的高纯度胶原蛋白，每组10只小鼠。阳性对照组采用bas作为阳性对照物，取3mg bsa与9ml pbs(ph7.4)混匀，再与cfa按1:1体积混匀成乳液，每只小鼠背部皮下注射0.12ml，每周注射一次。试验样品组，取定量高纯度胶原蛋白，植入小鼠背部皮下组织。阴性对照组进行假手术处理，不使用试样样品。2周后，取小鼠血清，分别使用小鼠免疫球蛋白g(igg)elisa试剂盒和小鼠补体成分c3a(c3a)elisa检测试剂盒进行血清免疫球蛋白和血清补体成分的含量测定。igg和c3a含量越高，表明免疫反应越强。测试结果取均值，结果如表1所示。
[0134]
表1
[0135]
[0136][0137]
根据表格数据可知，采用本发明提供的制备方法，实施例1-4得到的胶原蛋白纯度可以达到99.3％以上；脱细胞处理时，采用无机碱溶液、蛋白酶溶液和有机溶剂组合使用，或者采用无机碱溶液、有机溶剂和表面活性剂组合使用得到的胶原蛋白纯度最高，并且免疫原性较低，当采用其中某两种物质组合进行脱细胞处理，胶原蛋白纯度下降，并且免疫原性升高；采用两步盐析法得到的胶原蛋白纯度高，并且免疫原性较低，当改为一次盐析后，纯度下降并且免疫原性增加。
[0138]
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的工艺方法，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

技术特征：
1.一种高纯度胶原蛋白的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：(1)取动物身上的结缔组织进行病毒灭活处理，得到病毒灭活组织；(2)将所述病毒灭活组织进行脱细胞处理，得到胶原蛋白基质；(3)将所述胶原蛋白基质裁切后浸泡于酸性溶液中，并加入胃蛋白酶进行酶解，得到酶解液，将酶解液进行离心，收集上清液；(4)将所述上清液调节ph至中性，进行一次盐析，收集沉淀a，将所述沉淀a溶于酸性溶液，进行二次盐析，收集沉淀b，将沉淀b进行透析、冷冻干燥、灭菌后，得到所述高纯度胶原蛋白。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述病毒灭活处理采用的试剂为过氧化物溶液；优选地，所述结缔组织与过氧化物溶液的质量体积比为1:(20-30)；优选地，所述病毒灭活处理的时间为1-3h。3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述脱细胞处理的时间为6-30h；优选地，所述脱细胞处理采用的试剂包括无机碱溶液、蛋白酶溶液、有机溶剂溶液或表面活性剂溶液中的任意一种或至少两种的组合；优选地，所述脱细胞处理采用的试剂为无机碱溶液、蛋白酶溶液和有机溶剂溶液的组合；优选地，所述脱细胞处理采用的试剂为无机碱溶液、表面活性剂溶液和有机溶剂溶液的组合。4.根据权利要求1-3任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述酸溶液中酸的质量百分含量为5-20％；优选地，所述胃蛋白酶的添加量为0.5-3.0g/l；优选地，所述酶解的温度为15-30℃，时间为10-30h。5.根据权利要求1-4任一项所述的制备方法，其特征在于，所述一次盐析时氯化钠的添加量为2-5mol/l；优选地，所述一次盐析时氯化钠的添加量为2.2-2.8mol/l。6.根据权利要求1-5任一项所述的制备方法，其特征在于，所述二次盐析时氯化钠的添加量为0.5-2mol/l；优选地，所述二次盐析时氯化钠的添加量为0.6-1.2mol/l；优选地，所述二次盐析时体系的ph值为4.2-5.8。7.根据权利要求1-6任一项所述的制备方法，其特征在于，所述灭菌采用co60辐照。8.根据权利要求1-7任一项所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：(1)取动物身上的结缔组织与过氧化物溶液按照质量体积比为1:(20-30)混合，进行病毒灭活处理1-3h，得到病毒灭活组织；(2)将所述病毒灭活组织进行脱细胞处理6-30h，得到胶原蛋白基质；所述脱细胞处理采用的试剂为无机碱溶液、蛋白酶溶液和有机溶剂溶液的组合；所述脱细胞处理采用的试剂为无机碱溶液、表面活性剂溶液和有机溶剂溶液的组合；(3)将所述胶原蛋白基质裁切后浸泡于酸溶液中，并加入胃蛋白酶于15-30℃进行酶解
10-30h，得到酶解液，将酶解液进行离心，收集上清液；所述酸溶液中酸的质量百分含量为5-20％；所述胃蛋白酶的添加量为0.5-3.0g/l；(4)将所述上清液调节ph至中性，添加氯化钠至2-5mol/l，进一步地添加氯化钠至2.2-2.8mol/l进行一次盐析，收集沉淀a，将所述沉淀a溶于酸性溶液，调节ph值为4.2-5.8时再添加氯化钠至0.5-2mol/l，进一步地添加氯化钠至0.6-1.2mol/l进行二次盐析，收集沉淀b，将沉淀b进行透析、冷冻干燥、采用co60辐照灭菌，得到所述高纯度胶原蛋白。9.一种高纯度胶原蛋白，其特征在于，所述高纯度胶原蛋白采用如权利要求1-8任一项所述的制备方法制备得到。10.一种如权利要求9所述的高纯度胶原蛋白在生物医疗器械产品中的应用。

技术总结
本发明提供一种高纯度胶原蛋白及其制备方法和应用，所述制备方法包括如下步骤：(1)将动物身上的结缔组织进行病毒灭活处理，得到病毒灭活组织；(2)将所述病毒灭活组织进行脱细胞处理，得到胶原蛋白基质；(3)将所述胶原蛋白基质浸泡于酸溶液中，并加入胃蛋白酶进行酶解，得到酶解液，将酶解液进行离心，收集上清液；(4)将所述上清液进行二次盐析，收集沉淀，将沉淀进行透析、冷冻干燥、灭菌后，得到所述高纯度胶原蛋白。本发明采用质地较薄的结缔组织，洗涤液渗入的较为彻底可以使非胶原蛋白物质去除完全，保障了胶原蛋白的纯度；本发明采用两步盐析法，得到高纯度、低免疫原的胶原蛋白。白。


技术研发人员：吴卫东 赵海丽 张菁 李春明 李晓萌 殷敬华
受保护的技术使用者：上海珀原医用材料有限公司
技术研发日：2023.07.14
技术公布日：2023/10/5