一种白粉藤根黄酮和多糖综合提取工艺及其优化方法

1.本发明涉及天然活性物的提物技术领域，尤其涉及一种白粉藤根黄酮和多糖综合提取工艺及其优化方法。


背景技术：

2.白粉藤，为葡萄科白粉藤属植物白粉藤(cissus repens)的全株，分布于广东、云南等地，植物全株皆可入药，可以用于治疗颈淋巴结结核、毒蛇咬伤和小儿湿疹。民间常用其藤茎捣敷或煎水洗，可用于治疗蛇咬伤、毒疮、痢疾并用于缓解风湿性关节疼、摔倒损伤、功能性腰痛、慢性下腰损伤、腰臀肌筋膜炎等，具有抗菌消炎、疏散风邪、活血通络、化瘀、清热解毒等功效。姚瑰玮等研究发现翅茎白粉藤(cissus hexangularis)的热水提取液中含“糖类”、“苷类”、“皂苷”等活性物质，乙醇提取液中含“黄酮类”、“酚类”、“蒽醌类”、“香豆素”等活性物质。
3.有多种常用于黄酮和多糖类化合物的提取方法，其中包括热水浸提法、醇提取法、微波提取法、超声波提取法、超临界萃取技术、酶解法、膜分离提取法，而通常情况下一般会将两种及以上提取方法相结合即使用超声辅助提取法、微波处理辅助提取法、生物酶辅助提取法、超声酶解辅助提取法等从提取方法上进行优化。
4.当然也可以从提取条件上对提取工艺进行优化，而常用的提取工艺优化方法，普遍是基于单因素试验的基础上，再进行正交试验进行分析或是进行响应面分析，其中正交设计是一种基于正交表的多级多因素设计方法，具有少量实验、简单操作和科学合理实验组合的优点。然而，获得的最佳方案是仅从某一因素水平点上去找寻最优解；响应面分析方法使用合理的实验设计和多元二次回归方程来调整因素和响应值之间的函数关系。通过统计方法，我们可以从连续范围内精确找到最佳解决方案，并清楚地显示每个影响因素及其相互作用。
5.在以往的研究中发现，大多数研究人员多倾向于探究白粉藤提取物中活性成分的分析以及对该成分进行药理学研究为主，但关于活性成分提取工艺优化的探究较少，且目前白粉藤尚未得到充分开和利用，因此寻找快速、方便、安全、稳定的综合提取方法对白粉藤的深度开发有很大的促进作用。


技术实现要素：

6.针对上述存在的问题，本发明提供了一种白粉藤根黄酮和多糖综合提取工艺的优化方法，植物体中常见且含量较高的活性成分主要是黄酮和多糖，黄酮具有抗氧化，改善内分泌，抗菌消炎等功效，多糖具有免疫调节、抗炎、抗氧化等多种功效，猜测其与白粉藤药效相关。由于白粉藤多数用于民间家庭，因此本发明采用浸提法来提取白粉藤主要活性成分黄酮和多糖。用亚硝酸钠-硝酸铝法对黄酮，苯酚-硫酸法对多糖进行显色反应，用紫外分光光度法测定黄酮和多糖的含量，在单因素试验基础上，通过响应面分析法对白粉藤根黄酮和多糖综合提取工艺进行优化并通过结果分析推测出最优提取工艺条件；本发明的目的是
通过下述方案得以实现的：
7.一种白粉藤根黄酮和多糖综合提取工艺的优化方法，其特征在于，包括以下步骤：
8.s1：分别绘制芦丁、葡萄糖标准曲线，确定白粉藤根样品中黄酮和多糖得率的测定方法；
9.s2：采用单因素试验，分别确定白粉藤根样品中黄酮和多糖两种活性成分得率最高时的提取工艺条件；
10.s3：采用响应面分析法综合两种活性成分得率最高时的提取工艺条件，进行提取工艺优化，分析得出最佳综合提取工艺条件。
11.进一步的，步骤s2中确定的黄酮得率最高时的提取工艺条件为液料比20:1、浸提时间1.5h、浸提温度70℃、乙醇浓度65％；多糖得率最高时的提取工艺条件为液料比10:1、浸提时间2h、浸提温度70℃、乙醇浓度75％。
12.进一步的，步骤s3中进行响应面数据分析后确定的最佳综合提取工艺条件为液料比15:1、浸提时间1.7h、浸提温度79.50℃、乙醇浓度65％。
13.进一步的，最佳综合提取工艺条件下得到的白粉藤根样品中黄酮得率为0.78％，多糖得率为5.90％。
14.上述的一种白粉藤根黄酮和多糖综合提取工艺，其特征在于，包括以下步骤：精确称量适量白粉藤根，按照液料比15:1加入浓度为65％乙醇溶液，于79.50℃恒温水浴中浸提1.7h，同时获得白粉藤根黄铜和多糖。
15.与现有技术相比，本发明的有益效果是：
16.本发明在温度为80℃浸提作用下，以65％的乙醇溶液为提取剂提取白粉藤主要活性成分黄酮和多糖，该提取方法可避免高温，同时获得较高得率的总黄酮和多糖。
附图说明
17.图1为芦丁和葡萄糖的标准曲线；
18.图2为浸提温度对白粉藤根黄酮和多糖得率的影响；
19.图3为浸提时间对白粉藤根黄酮和多糖得率的影响；
20.图4为浸提液料比对白粉藤根黄酮和多糖得率的影响；
21.图5为乙醇浓度对白粉藤根黄酮和多糖得率的影响；
22.图6为试验因素及其交互作用对白粉藤根黄酮得率影响的响应面曲面图和等高线图；
23.图7为试验因素的交互作用对白粉藤根多糖得率影响的响应面曲面图及等高线图。
具体实施方式
24.为了使本领域的普通技术人员能更好的理解本发明的技术方案，下面结合附图和实施例对本发明的技术方案做进一步的描述。
25.一种白粉藤根黄酮和多糖综合提取工艺的优化方法，包括以下步骤：
26.s1：分别绘制芦丁、葡萄糖标准曲线，确定白粉藤根样品中黄酮和多糖得率的测定方法；
步骤检测黄酮得率，按照“1.2”步骤检测多糖得率，进行三次重复实验。
46.2.2浸提时间的影响
47.分别称取1.001g样品各五份，均加入20ml浓度为的55％乙醇溶液，在60℃恒温水浴锅中分别浸提0.5h、1h、1.5h、2h、2.5h，提取1次，收集抽滤所得提取液，按照“1.1”步骤检测黄酮得率，按照“1.2”步骤检测多糖得率，进行三次重复实验。
48.2.3料液比的影响
49.分别称取1.001g样品各五份，分别加入10ml、15ml、20ml、25ml、30ml浓度为的55％乙醇溶液，在60℃恒温水浴锅中浸1h，提取1次，收集抽滤所得提取液，按照“1.1”步骤检测黄酮得率，按照“1.2”步骤检测多糖得率，进行三次重复实验。
50.2.4浸提溶剂中乙醇浓度的影响
51.分别称取1.001g样品各五份，分别加入浓度为0％、55％、65％、75％、85％的乙醇溶液，在60℃恒温水浴锅中浸提1h，提取1次，收集抽滤所得提取液，按照“1.1”步骤检测黄酮得率，按照“1.2”步骤检测多糖得率，进行三次重复实验。
52.s3：采用响应面分析法综合两种活性成分得率最高时的提取工艺条件，进行提取工艺优化，分析得出最佳综合提取工艺条件。
53.3.响应面分析试验
54.通过单因素试验选择其中三个因素，通过design-expert 8.0.6.1软件，采用box-behnken设计试验方法对浸提温度、浸提时间、乙醇浓度这三个因素(分别以“a、b、c”代码表示)并在单因素试验基础上分别选择三个水平范围，进行三水平三因素编码设计响应面试验方案每组试验均做三组重复实验，根据最后分析得出最佳综合提取工艺条件，最后进行验证实验证实方案的准确性和可行性。
55.4.结果与分析：
56.4.1标准曲线的绘制
57.芦丁(a)、葡萄糖(b)分别在0.02～0.1mg/ml和0.01～0.1mg/ml范围内线性关系良好，其回归方程分别y＝6.2297x+0.097(r2＝0.9992)、y＝7.8887x+0.1369(r2＝0.9991)。芦丁和葡萄糖的标准曲线见图1。
58.4.2单因素结果分析
59.(1)浸提温度的影响
60.根据表1和图2所示，可明显看出在不同的浸提温度条件下，随浸提温度的升高而黄酮和多糖的得率均是呈上升趋势，且幅度较大，但当温度达到70℃时，黄酮得率达到最高值0.53％，多糖得率达到最高值4.99％，但温度大于70℃后黄酮和多糖的得率均呈下降趋势，由于乙醇沸点为78.3℃，80～90℃乙醇挥发会导致提取率下降，以及黄酮的稳定性原因导致其得率下降，因此选70℃为最优浸提温度，综上考虑该因素响应面水平范围定为60～80℃。
61.表1浸提温度对白粉藤根黄酮和多糖得率的影响
[0062][0063]
(2)浸提时间的影响
[0064]
根据表2和图3所示，可明显看出当浸提时间越长时，黄酮及多糖的得率均呈上升趋势，在浸提1.5h时黄酮得率达到最高值0.57％，随后黄酮得率下降。在浸提2h时多糖的率达到最高值3.49％。因此黄酮最优浸提时间为1.5h，多糖最优浸提时间为2h，可图3表明浸提2.5h时黄酮和多糖的得率未低于最低点，综上考虑该因素响应面水平范围定为1.5～2.5h。
[0065]
表2浸提时间对白粉藤根黄酮和多糖得率的影响
[0066][0067]
(3)浸提液料比的影响
[0068]
根据表3和图4所示，可明显看出随着液料比的增加，多糖得率呈逐渐下降趋势，因此在液料比为10:1时多糖得率达到最高值3.16％。黄酮得率先呈上升趋势，在液料比为20:1时黄酮得率达到最高值0.35％，随后呈下降趋势。因此黄酮最优浸提液料比为20:1，多糖最优浸提液料比为10:1，综合实用效益考虑选择15:1为响应面浸提液料比。
[0069]
表3浸提液料比对白粉藤根黄酮和多糖得率的影响
[0070][0071]
(4)乙醇浓度的影响
[0072]
根据表4和图5所示，可明显看出随着乙醇浓度的增加，黄酮和多糖得率均呈上升趋势，当乙醇浓度为65％时黄酮得率达到最高值0.49％，随后得率呈下降趋势。当乙醇浓度为75％时多糖得率达到最高值3.24％，随后亦呈下降趋势。因此黄酮最优浸提乙醇浓度为65％，多糖最优浸提乙醇浓度为75％，综上考虑该因素响应面水平范围定在乙醇浓度为65～75％。
[0073]
表4乙醇浓度对白粉藤根黄酮和多糖得率的影响
[0074][0075]
4.3响应面分析
[0076]
(1)响应面分析方案与结果
[0077]
通过单因素试验选择其中三个因素，通过design-expert 8.0.6.1软件，采用box-behnken设计试验方法对浸提温度、浸提时间、乙醇浓度这三个因素(分别以“a、b、c”代码表示)并在单因素试验基础上分别选择三个水平范围，进行三水平三因素编码设计响应面试验方案，试验设计方案见表5，试验结果见表6。
[0078]
表5box-behnken试验因素水平及编码
[0079][0080]
表6box-behnken设计方案与试验结果
[0081][0082]
(2)三因素对白粉藤根黄酮得率的交互影响
[0083]
从表7方差分析中可以看出，模型p值为0.0009小于0.01，说明模型显著，具有统计学意义，失拟项均为不显著，说明试验误差小，说明分析所得多元二次回归方程可用于三个因素之间交互关系的分析，通过对回归方程的分析可对最优工艺参数进行预测。根据r
2-adj＝0.8869表明该模型对于88.69％的响应值反馈有效。由表7可以看出，对于黄酮的提取效果影响因素主次顺序为a(乙醇浓度)＞c(浸提时间)＞b(浸提温度)，其中c(浸提时间)p值＝0.0041＜0.01为极显著影响因素，b(乙醇浓度)p值＝0.0002＜0.01为极显著影响因素，交互项ab、bc达到显著水平，平方项b2、c2达到极显著水平。由数据分析得到白粉藤根黄酮得率的回归方程如下：
[0084]
黄酮得率＝0.58-0.054a-5.687
×
10-4
b+0.032c+0.028ab+0.022ac-0.030bc-0.013a
2-0.056b
2-0.044c2[0085]
当以黄酮得率为优先考虑条件时，经分析得，在a＝65.00，b＝77.10，c＝1.74时，即乙醇浓度为65.00％，提取温度为77.10℃，时间为1.74h，为白粉藤根黄酮和多糖的最优浸提工艺条件，黄酮得率预测值为0.57％，多糖得率预测值为4.76％。
[0086]
表7白粉藤根黄酮得率方差分析表
[0087][0088][0089]
注:*p＜0.05，显著水平；**p＜0.01，极显著水平
[0090]
从图6可知当浸提温度为70℃、浸提时间为2h、乙醇浓度为75％分别为固定值时，其他两因素及其交互作用对白粉藤根黄酮得率影响的响应曲面及等高线图，其中浸提时间与乙醇浓度的交互作用显著，浸提时间与乙醇浓度对白粉藤根黄酮提取得率有较大影响。
[0091]
(3)三因素对白粉藤根多糖得率的交互影响
[0092]
从表8方差分析中可以看出，模型p值＝0.0004＜0.01，说该模型显著，具有统计学意义，失拟项均为不显著，说明分析所得多元二次回归方程可用于三个因素之间交互关系的分析，通过对回归方程的分析可对最优工艺参数进行预测。根据r
2-adj＝0.9099知该模型对于90.99％的响应值反馈有效。由表10可以看出，对于多糖的提取效果影响因素主次顺序为：b(浸提温度)＞a(乙醇浓度)＞c(浸提时间)。其中b(浸提温度)p值＜0.0001为极显著影响因素，a(乙醇浓度)p值＝0.0168＜0.05为显著影响因素，交互项bc达到极显著水平，平方项b2达到极显著水平。白粉藤根多糖得率的回归方程为：
[0093]
多糖得率＝3.27-0.26a+0.7b-0.1c+0.1ab+0.078ac-0.6bc+0.07a2+0.7b2+0.04c2[0094]
当以多糖得率为优先考虑条件时，经分析得，在a＝65.00，b＝79.29，c＝1.66时，即乙醇浓度为65.00％，提取温度为79.29℃，时间为1.66h，为白粉藤根黄酮和多糖的最佳浸提工艺条件，在此条件下，多糖得率预测值为5.36％，黄酮得率预测值为0.54％。
[0095]
表8白粉藤根多糖得率方差分析表
[0096][0097]
注:*p＜0.05，显著水平；**p＜0.01，极显著水平
[0098]
从图7可分别看出三因素其中一个选取固定值时，即当浸提温度为70℃、浸提时间为2h、乙醇浓度为75％时，其他两因素及其交互作用对白粉藤根多糖得率影响的响应曲面及等高线图，其中浸提温度和时间的交互作用显著，浸提温度与乙醇浓度的交互作用显著，由此看出浸提温度对白粉藤根多糖得率有较大影响。
[0099]
5.验证实验
[0100]
实验主要研究白粉藤根黄酮和多糖综合提取工艺优化，因此由相应面分析所得到的最佳工艺条件为浸提温度79.30℃，提取时间为1.66h，乙醇浓度为65.00％，预测黄酮得率为0.54％，多糖得率为5.36％。结合模型预测的最佳工艺条件，根据实际情况调整浸提温度为79.50℃，浸提时间为1.70h，乙醇浓度为65.00％，按此工艺进行验证试验，结果黄酮得率为0.78％，多糖得率为5.90％，黄酮得率比预测值大0.24％，多糖得率比预测值大
0.54％，验证试验结果与预测值接近，进一步验证了模型与试验结果的可靠。
[0101]
结论：本实验通过紫外分光光度法与响应面分析法对白粉藤根黄酮和多糖综合提取工艺进行优化并寻找最佳提取工艺，应用响应面分析法优化的白粉藤根黄酮和多糖的综合提取工艺条件为：浸提温度79.30℃，浸提时间1.66h，乙醇浓度为65.00％。根据实际情况将提取条件调整为：浸提温度79.50℃，浸提时间1.70h，乙醇浓度为65.00％，液料比为15:1，在该条件下进行提取，结果显示，黄酮的得率达到0.78％，而多糖的得率则达到5.90％。该方法操作简便，对白粉藤根加工为产品提供一定的理论依据。
[0102]
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

技术特征：
1.一种白粉藤根黄酮和多糖综合提取工艺的优化方法，其特征在于，包括以下步骤：s1：分别绘制芦丁、葡萄糖标准曲线，确定白粉藤根样品中黄酮和多糖得率的测定方法；s2：采用单因素试验，分别确定白粉藤根样品中黄酮和多糖两种活性成分得率最高时的提取工艺条件；s3：采用响应面分析法综合两种活性成分得率最高时的提取工艺条件，进行提取工艺优化，分析得出最佳综合提取工艺条件。2.根据权利要求1所述的一种白粉藤根黄酮和多糖综合提取工艺的优化方法，其特征在于，步骤s2中确定的黄酮得率最高时的提取工艺条件为液料比20:1、浸提时间1.5h、浸提温度70℃、乙醇浓度65％；多糖得率最高时的提取工艺条件为液料比10:1、浸提时间2h、浸提温度70℃、乙醇浓度75％。3.根据权利要求2所述的一种白粉藤根黄酮和多糖综合提取工艺的优化方法，其特征在于，步骤s3中进行响应面数据分析后确定的最佳综合提取工艺条件为液料比15:1、浸提时间1.7h、浸提温度79.50℃、乙醇浓度65％。4.根据权利要求3所述的一种白粉藤根黄酮和多糖综合提取工艺的优化方法，其特征在于，最佳综合提取工艺条件下得到的白粉藤根样品中黄酮得率为0.78％，多糖得率为5.90％。5.如权利要求1-4任一项所述的一种白粉藤根黄酮和多糖综合提取工艺，其特征在于，包括以下步骤：精确称量适量白粉藤根，按照液料比15:1加入浓度为65％乙醇溶液，于79.50℃恒温水浴中浸提1.7h，同时得到白粉藤根黄铜和多糖。

技术总结
本发明公开了一种白粉藤根黄酮和多糖综合提取工艺的优化方法；采用浸提法提取白粉藤根的活性成分黄酮和多糖，在单因素试验的基础上，以黄酮得率和多糖得率为评价指标，采用响应面分析法进行提取工艺优化。单因素结果表明黄酮得率最高时浸提条件为(20:1、1.5h、70℃、65％乙醇)，多糖得率最高的浸提条件为(10:1、2h、70℃、75％乙醇)，综合两种活性成分最优提取条件进行响应面数据分析后推荐最佳为浸提时间1.7h、浸提温度为79.50℃、乙醇浓度为65％时，多糖得率为5.36％，黄酮得率为0.54％。验证实验测得多糖得率为5.90％，黄酮得率为0.78％。即白粉藤根黄酮和多糖综合提取的最佳工艺条件为：液料比为15:1、浸提时间1.7h、浸提温度79.50℃、乙醇浓度为65％，黄酮得率0.78％，多糖得率5.90％。多糖得率5.90％。多糖得率5.90％。


技术研发人员：钟瑜萍 郑作亮 刘志伟 范丽萍 梁绮琳
受保护的技术使用者：嘉应学院
技术研发日：2023.07.15
技术公布日：2023/10/5