金莲花苷A及其制备方法和应用

金莲花苷a及其制备方法和应用
技术领域
1.本发明涉及一种具有体外抗炎的新物质及其方法和应用。


背景技术：

2.金莲花(trollius chinensis bunge)是毛茛科(ranunculaceae)金莲花属(trollius l.)植物金莲花的干燥花。其作药用最早记载于《本草纲目拾遗》，性寒，味苦，具有明目、清热解毒的功效。现代临床主要用于治疗上呼吸道感染、扁桃体炎、咽炎、中耳炎等。
3.现代药学研究表明，金莲花的主要活性成分为黄酮类等，多具有消炎、抗病毒、抗氧化等作用，毒副作用小，是很有价值的植物抗炎药来源。
4.目前，金莲花在市场上已有许多制剂，但其在1977年版《中国药典》后各版药典再无收载，在个别省市的地方标准中的记载也较为简单。金莲花作为应用已久的药食同源的药用植物，为提高其质量标准及发现更多具有抗炎活性的指标性成分，对其进行系统的化学分离具有重要意义。
5.炎症(inflammation)就是平时所说的“发炎”，是生物组织受到某种刺激如外伤、感染等损伤因子的刺激所发生的一种以防御反应为主的基本病理过程。炎症的局部表现为红、肿、热、痛和功能障碍，也伴有发热、末梢血白细胞计数改变等全身反应。通常情况下，炎症是有益的，是人体的自动的防御反应。但是有的时候，炎症也是有害的，例如对人体自身组织的攻击、发生在透明组织的炎症等等。因此，可抑制炎症反应的物质对保障人民身体健康、提高人民生活质量具有重要意义。


技术实现要素：

6.本发明的目的是提供一种具有体外抗炎活性的新化合物及其制备方法和应用。
7.金莲花苷a，所述金莲花苷a的分子式为c
15h22
o8，分子结构式为：
[0008][0009]
所述金莲花苷a的制备方法如下：
[0010]
一、将金莲花置于索氏动态提取浓缩机组的提取罐中，用体积浓度为70％的乙醇进行提取，得到提取液；
[0011]
二、将步骤一得到的提取液浓缩至无醇味并上d101大孔树脂柱，然后依次用水、体积浓度30％乙醇水进行洗脱；
[0012]
三、将步骤二体积浓度30％的洗脱馏分进行硅胶柱色谱分离，用体积比为100:3、
100:4、100:5、100:10的二氯甲烷和甲醇的混合溶剂依次洗脱，取二氯甲烷与甲醇体积比为100:10的洗脱物进行再次硅胶柱色谱分离，用体积比为100:3、100:5、100:10、100:20、100:50的石油醚和乙酸乙酯混合溶剂依次洗脱，取石油醚与乙酸乙酯体积比为100:50的洗脱物上羟丙基葡聚糖凝胶柱色谱，采用甲醇为洗脱剂，以30滴/min的速度进行洗脱，每50ml为一个洗脱馏分，合并第20-25个馏分的样品上硅胶柱色谱，用体积比为100:2、100:5、100:10、100:20、100:50的二氯甲烷和甲醇的混合溶剂依次洗脱，将二氯甲烷与甲醇体积比为100:50的洗脱物上羟丙基葡聚糖凝胶柱色谱，采用甲醇为洗脱剂，以10滴/min的速度进行洗脱，每10ml为一个洗脱馏分，合并第11-16个馏分的样品进行高效液相色谱制备，收集洗脱时间为第24min出现的吸收峰，即得到金莲花苷a。
[0013]
步骤一所述索氏动态提取浓缩机组压力设定为常压提取，-0.05mpa～-0.08mpa负压浓缩，提取温度设定90℃。
[0014]
步骤三所述制备高效液相色谱采用waters2535半制备型高效液相，检测器为waters2414型示差检测器，色谱柱的填料为c
18
反相硅胶。
[0015]
所述金莲花苷a用于制备抗炎药物。
[0016]
所述抗炎药物的剂型包括注射剂、冻干粉针剂、口服制剂。
[0017]
所述口服制剂包括片剂、颗粒剂、软胶囊剂、硬胶囊剂、口服液、缓控释制剂。
[0018]
所述金莲花苷a作为抗炎药物的活性成分，用于抑制lps诱导的巨噬细胞tnf-α和il-1β释放量。
[0019]
本发明金莲花苷a化学名为5-(2-hydroxyethyl)-2-methoxyphenyl-β-d-glucopyranoside，分子式为c
15h22
o8。
[0020]
本发明所述化合物可以加入药学上可接受的辅料制成药学上可接受的固体制剂或液体制剂。
[0021]
本发明所述的辅料没有限制，药学上能接受即可。
[0022]
有益效果：与现有技术相比，本发明具备以下优点：
[0023]
本发明提供来源于金莲花的新化合物及一种针对本发明新化合物的提取分离纯化方法，采用醇提取、大孔吸附树脂、硅胶柱层析、制备液相等方法进行分离纯化，成功获得新的化合物，操作方法简便及快速，且经该方法分离得到的化合物纯度较高，此外经研究表明以上化合物具有抗炎活性。
[0024]
该新化合物能够抑制由lps诱导小鼠巨噬细胞raw264.7细胞引起的tnf-α和il-1β的含量的增加。化合物在浓度为60μm、30μm、15μm、7.5μm、3.75μm时，对tnf-α产生的抑制率分别为58.6％、55.9％、44.7％、33.8％、24.5％，对il-1β产生的抑制率分别为79.5％、66.9％、40.3％、37.5％、17.6％。本发明金莲花苷a对lps刺激的小鼠巨噬细胞(raw264.7)释放的促炎因子tnf-α和il-iβ抑制率的ic
50
分别为23.8μm、16.3μm，说明其具有较好的体外抗炎活性。可将本发明的金莲花苷a制成注射剂、冻干粉针、输液剂或口服制剂(包括片剂、颗粒剂、软胶囊剂、硬胶囊剂、口服液和缓控释制剂)等抗炎药物。
具体实施方式
[0025]
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。
[0026]
具体实施方式一：本实施方式金莲花苷a，所述金莲花苷a的分子式为c
15h22
o8，分子结构式为：
[0027]
具体实施方式二：具体实施方式一所述金莲花苷a的制备方法如下：
[0028]
一、将金莲花置于索氏动态提取浓缩机组的提取罐中，用体积浓度为70％的乙醇进行提取，得到提取液；
[0029]
二、将步骤一得到的提取液浓缩至无醇味并上d101大孔树脂柱，然后依次用水、体积浓度30％乙醇水进行洗脱；
[0030]
三、将步骤二体积浓度30％的洗脱馏分进行硅胶柱色谱分离，用体积比为100:3、100:4、100:5、100:10的二氯甲烷和甲醇的混合溶剂依次洗脱，取二氯甲烷与甲醇体积比为100:10的洗脱物进行再次硅胶柱色谱分离，用体积比为100:3、100:5、100:10、100:20、100:50的石油醚和乙酸乙酯混合溶剂依次洗脱，取石油醚与乙酸乙酯体积比为100:50的洗脱物上羟丙基葡聚糖凝胶柱色谱，采用甲醇为洗脱剂，以30滴/min的速度进行洗脱，每50ml为一个洗脱馏分，合并第20-25个馏分的样品上硅胶柱色谱，用体积比为100:2、100:5、100:10、100:20、100:50的二氯甲烷和甲醇的混合溶剂依次洗脱，将二氯甲烷与甲醇体积比为100:50的洗脱物上羟丙基葡聚糖凝胶柱色谱，采用甲醇为洗脱剂，以10滴/min的速度进行洗脱，每10ml为一个洗脱馏分，合并第11-16个馏分的样品进行高效液相色谱制备，收集洗脱时间为第24min出现的吸收峰，即得到金莲花苷a。
[0031]
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式二不同的是步骤一所述索氏动态提取浓缩机组压力设定为常压提取，-0.05mpa～-0.08mpa负压浓缩，提取温度设定90℃。其他与具体实施方式二相同。
[0032]
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式二或三不同的是步骤三所述制备高效液相色谱采用waters2535半制备型高效液相，检测器为waters2414型示差检测器，色谱柱的填料为c
18
反相硅胶。其他与具体实施方式二或三相同。
[0033]
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至四所述金莲花苷a用于制备抗炎药物。
[0034]
具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式五不同的是所述抗炎药物的剂型包括注射剂、冻干粉针剂、口服制剂。其他与具体实施方式五相同。
[0035]
具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式六不同的是所述口服制剂包括片剂、颗粒剂、软胶囊剂、硬胶囊剂、口服液、缓控释制剂。其他与具体实施方式六相同。
[0036]
具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式一至七之一不同的是所述金莲花苷a作为抗炎药物的活性成分，用于抑制lps诱导的巨噬细胞tnf-α和il-1β释放量。其他与具体实施方式一至七之一相同。
[0037]
采用下述实验验证本发明效果：
[0038]
实验一：
[0039]
金莲花苷a，所述金莲花苷a的分子式为c
15h22
o8，分子结构式为：
[0040][0041]
所述金莲花苷a的制备方法如下：
[0042]
一、将金莲花置于索氏动态提取浓缩机组的提取罐中，用体积浓度为70％的乙醇进行提取，得到提取液；
[0043]
二、将步骤一得到的提取液浓缩至无醇味并上d101大孔树脂柱，然后依次用水、体积浓度30％乙醇水进行洗脱；
[0044]
三、将步骤二体积浓度30％的洗脱馏分进行硅胶柱色谱分离，用体积比为100:3、100:4、100:5、100:10的二氯甲烷和甲醇的混合溶剂依次洗脱，取二氯甲烷与甲醇体积比为100:10的洗脱物进行再次硅胶柱色谱分离，用体积比为100:3、100:5、100:10、100:20、100:50的石油醚和乙酸乙酯混合溶剂依次洗脱，取石油醚与乙酸乙酯体积比为100:50的洗脱物上羟丙基葡聚糖凝胶柱色谱，采用甲醇为洗脱剂，以30滴/min的速度进行洗脱，每50ml为一个洗脱馏分，合并第20-25个馏分的样品上硅胶柱色谱，用体积比为100:2、100:5、100:10、100:20、100:50的二氯甲烷和甲醇的混合溶剂依次洗脱，将二氯甲烷与甲醇体积比为100:50的洗脱物上羟丙基葡聚糖凝胶柱色谱，采用甲醇为洗脱剂，以10滴/min的速度进行洗脱，每10ml为一个洗脱馏分，合并第11-16个馏分的样品进行高效液相色谱制备，收集洗脱时间为第24min出现的吸收峰，即得到金莲花苷a。
[0045]
步骤一所述索氏动态提取浓缩机组压力设定为常压提取，-0.05mpa～-0.08mpa负压浓缩，提取温度设定90℃。
[0046]
步骤三所述制备高效液相色谱采用waters2535半制备型高效液相，检测器为waters2414型示差检测器，色谱柱的填料为c
18
反相硅胶。
[0047]
本实验采用6.5kg干燥的金莲花，最终获得金莲花苷a4.47mg，所述新化合物根据结构命名为5-(2-hydroxyethyl)-2-methoxyphenylβ-d-glucopyranoside，表1为新化合物的核磁数据：1h-nmr与
13
c-nmr在dmso中。
[0048]
表1：本发明新化合物的核磁数据
[0049][0050][0051]
实验二：
[0052]
将实验一制备的金莲花苷a对tnf-α和il-1β生成的抑制活性进行实验，步骤如下：
[0053]
1、药物配制金莲花苷a用dmso溶解，配成600μmol/l的母液。用pbs稀释，测试浓度为60μmol/l，30μmol/l，15μmol/l，7.5μmol/l，3.75μmol/l。
[0054]
2、细胞培养
[0055]
小鼠巨噬细胞raw264.7生长于含有10％胎牛血清的dmem培养液中，并在5％co2、饱和湿度和37℃的培养箱中悬浮培养，取对数生长期细胞用于实验。
[0056]
3、cck-8测试药物对细胞增殖的影响
[0057]
raw264.7细胞以2
×
105个/ml的密度接种于96孔板，贴壁后用不同浓度的金莲花苷a和地塞米松(阳性对照药)处理24h后，取出，弃上清，每孔加入10μl cck-8溶液和90μl完全培养基，将培养板在培养箱内孵育45min后，用酶标仪测定在450nm处的吸光度(od值)。只有cck-8溶液和完全培养基的孔记为完全空白组，所有组别均至少有三个复孔。以此确定金莲花苷a的安全作用浓度。结果显示金莲花苷a在测试浓度下对细胞没有杀伤能力。4、对tnf-α生成的抑制活性
[0058]
raw 264.7细胞以2
×
105个/ml的密度接种于96孔板，贴壁后先用不同浓度的金莲花苷a和地塞米松(阳性对照药)预作用2h后再加入100ng/ml lps与药物共同作用24h，取出实验所需的预包被板条数，放置在96孔框架内，取上述细胞培养液上清100μl加入相应孔中，用封板膜封住反应孔，室温孵育120min。洗板5次，且最后一次置于厚吸水纸上拍干。加入生物素化抗体100μl/孔。用封板膜(透明)封住反应孔，室温孵育60min。洗板5次，且最后
一次置于厚吸水纸上拍干。加入辣根过氧化物酶标记streptavidin 100μl/孔。用封板膜(白色)封住反应孔，室温避光孵育20min。洗板5次，且最后一次置于厚吸水纸上拍干。加入显色剂tmb溶液100μl/孔，用封板膜(白色)封住反应孔，室温避光孵育20min。加入终止液(浓度为2mol/l的h2so4溶液)50μl/孔，混匀后立即测量a450值。连续重复上述实验3次，结果显示浓度为60μmol/l，30μmol/l，15μmol/l，7.5μmol/l，3.75μmol/l时，其抑制率为58.6％、55.9％、44.7％、33.8％、24.5％。采用spss软件计算ic
50
值为23.8μm，说明其具有较好的体外抗炎活性。
[0059]
5、对il-1β生成的抑制活性
[0060]
raw 264.7细胞以2
×
105个/ml的密度接种于96孔板，贴壁后先用不同浓度的金莲花苷a和地塞米松(阳性对照药)预作用2h后再加入100ng/ml lps与药物共同作用24h，取出实验所需的预包被板条数，放置在96孔框架内，将样品或不同浓度标准品按照100μl/孔加入相应孔中，用封板膜(透明)封住反应孔，室温孵育120分钟。洗板5次，且最后一次置于厚吸水纸上拍干。加入生物素化抗体100μl/孔。用封板膜(透明)封住反应孔，室温孵育60min。洗板5次，且最后一次置于厚吸水纸上拍干。加入辣根过氧化物酶标记streptavidin100μl/孔。用封板膜(白色)封住反应孔，室温避光孵育20min。洗板5次，且最后一次置于厚吸水纸上拍干。加入显色剂tmb溶液100μl/孔，用封板膜(白色)封住反应孔，室温避光孵育20min。加入终止液(浓度为2mol/l的h2so4溶液)50μl/孔，混匀后立即测量a450值。连续重复上述实验3次，结果显示浓度为60μmol/l，30μmol/l，15μmol/l，7.5μmol/l，3.75μmol/l时，其抑制率为79.5％、66.9％、40.3％、37.5％、17.6％。采用spss软件计算ic
50
值为16.3μm，说明其具有较好的体外抗炎活性。

技术特征：
1.金莲花苷a，其特征在于所述金莲花苷a的分子式为c
15
h
22
o8，分子结构式为：2.权利要求1所述金莲花苷a的制备方法，其特征在于所述金莲花苷a的制备方法如下：一、将金莲花置于索氏动态提取浓缩机组的提取罐中，用体积浓度为70％的乙醇进行提取，得到提取液；二、将步骤一得到的提取液浓缩至无醇味并上d101大孔树脂柱，然后依次用水、体积浓度30％乙醇水进行洗脱；三、将步骤二体积浓度30％的洗脱馏分进行硅胶柱色谱分离，用体积比为100:3、100:4、100:5、100:10的二氯甲烷和甲醇的混合溶剂依次洗脱，取二氯甲烷与甲醇体积比为100:10的洗脱物进行再次硅胶柱色谱分离，用体积比为100:3、100:5、100:10、100:20、100:50的石油醚和乙酸乙酯混合溶剂依次洗脱，取石油醚与乙酸乙酯体积比为100:50的洗脱物上羟丙基葡聚糖凝胶柱色谱，采用甲醇为洗脱剂，以30滴/min的速度进行洗脱，每50ml为一个洗脱馏分，合并第20-25个馏分的样品上硅胶柱色谱，用体积比为100:2、100:5、100:10、100:20、100:50的二氯甲烷和甲醇的混合溶剂依次洗脱，将二氯甲烷与甲醇体积比为100:50的洗脱物上羟丙基葡聚糖凝胶柱色谱，采用甲醇为洗脱剂，以10滴/min的速度进行洗脱，每10ml为一个洗脱馏分，合并第11-16个馏分的样品进行高效液相色谱制备，收集洗脱时间为第24min出现的吸收峰，即得到金莲花苷a。3.根据权利要求2所述金莲花苷a的制备方法，其特征在于步骤一所述索氏动态提取浓缩机组压力设定为常压提取，-0.05mpa～-0.08mpa负压浓缩，提取温度设定90℃。4.根据权利要求2所述金莲花苷a的制备方法，其特征在于步骤三所述制备高效液相色谱采用waters2535半制备型高效液相，检测器为waters2414型示差检测器，色谱柱的填料为c
18
反相硅胶。5.权利要求2所述金莲花苷a的应用，其特征在于所述金莲花苷a用于制备抗炎药物。6.根据权利要求5所述金莲花苷a的应用，其特征在于所述抗炎药物的剂型包括注射剂、冻干粉针剂、口服制剂。7.根据权利要求6所述金莲花苷a的应用，其特征在于所述口服制剂包括片剂、颗粒剂、软胶囊剂、硬胶囊剂、口服液、缓控释制剂。8.根据权利要求5所述金莲花苷a的应用，其特征在于所述金莲花苷a作为抗炎药物的活性成分，用于抑制lps诱导的巨噬细胞tnf-α和il-1β释放量。

技术总结
金莲花苷A及其制备方法和应用，涉及一种具有体外抗炎的物质及其方法和应用。本发明提供一种具有体外抗炎活性的新物质及其制备方法和应用。金莲花苷A化学名为5-(2-hydroxyethyl)-2-methoxyphenyl-β-D-glucopyranoside，分子式为C


技术研发人员：刘吉成 孙宇 梁雅杰 马玉坤 张金玲
受保护的技术使用者：齐齐哈尔医学院
技术研发日：2023.07.17
技术公布日：2023/10/5