一种玉米须多糖在制备用于促凝血药物中的用途

1.本发明涉及止血药物技术领域，尤其是免疫调节和止血剂方面的应用。


背景技术：

2.玉米(zea mays l.)是一种禾本科植物，已成为世界上三大谷类之一，广泛分布于吉林、黑龙江等省份。然而，其副产品玉米须的利用度相对较低。目前，玉米须已被证实含有多糖、黄酮、皂苷、生物碱等化学成分。研究表明，玉米须具降血糖、降血脂、抗肿瘤、保护肝肾、抗氧化、抗菌消炎等功效。研究还发现，玉米须水提取液可降低血液粘稠度，增加血液凝血酶原，加速血液凝固。也有研究发现，高含量的玉米须多糖和黄酮类化合物对血液凝固有抑制作用。玉米须来源丰富，价格低廉，易于采集，是一种有待充分开发和利用的药用资源。因此，若能将其与凝血机理相结合，进一步确定玉米须发挥凝血作用的活性部位，将大大提升其药用价值，同时也为之后的研究及在功能食品和药品等方面的应用奠定基础。
3.目前已从玉米须中分离出的有效成分有153种，其中黄酮类和多糖类成分的研究较为深入。现有技术表明，玉米须中含有极少的萜类化合物，如倍半萜、二萜类、单萜和三萜类化合物。
4.国内外对玉米须多糖、黄酮、皂苷类物质的研究比较多，多糖为玉米须水提取物的主要成分，玉米须多糖是玉米须成分中含量最高的功能因子，分子质量大，结构复杂，近年来玉米须多糖因其丰富的药理活性成为研究热点，如抑菌、抗肿瘤、降血糖、利尿以及免疫调节等多种药理作用。还可以抑制血小板凝集，从而防止出血，玉米须的凝血作用可以帮助治疗外伤和内伤，如肝病、肾病和肠病等，因为它可以改善血液循环，从而促进血液凝固。玉米须多糖的含量和结构也可能会对其活性产生影响。含量高和分子量大的多糖可能会导致黏稠度增加，降低流变性能，使得多糖难以溶解和吸收，在应用时可能会受到限制。另外，玉米须多糖作为一种天然提取物，其多糖的含量和结构也可能受到环境因素的影响，如土壤肥力、气候、生长季节等因素都会影响含量和结构，进而影响其生物活性。
5.李亚平(玉米须多糖结构表征及其生物活性的研究[d].吉林化工学院,2019.)以玉米须为原料，采用热水回流法提取玉米须粗多糖，多糖得率为7.44％。粗多糖纯度为18.82％，糖醛酸含量为7.43％，蛋白质含量为7.59％。采用棉状deae对玉米须粗多糖进行纯化，纯化后多糖纯度为60.06％，糖醛酸含量为20.38％，蛋白质含量为4.67％。纯化后玉米须多糖经纤维素deae-52和sephadex g-150分离纯化，获得5个组分的玉米须多糖即csp-1、csp-2、csp-3、csp-4和csp-5。通对5个组分的玉米须多糖的结构进行鉴定，csp-1呈现不规则的几何外形，有凹凸不平的表面，csp-2、csp-3、csp-4和csp-5的外貌形态是相互交织的条带状。紫外结果分析，csp-1、csp-2和csp-3不含核酸和蛋白质，csp-4和csp-5中含有核酸和蛋白质。红外结果分析，csp-1、csp-2、csp-3、csp-4及csp-5是多聚吡喃糖。csp-2的红外图谱在1731、1644和1428cm-1
附近的典型吸收表明该多糖中存在糖醛酸。csp-3的红外色谱在964和862cm-1
处有岩藻糖和甘露糖的吸收峰。csp-5的红外色谱中在872cm-1
处有甘露糖的特征吸收峰。csp-1、csp-2、csp-3、csp-4和csp-5的分子量分别为5.86
×
105da、1.58
×
106da、8.13
×
105da、1.04
×
106da、8.62
×
105da。csp-1、csp-2、csp-3、csp-4和csp-5的单糖组成极为相似，但摩尔比有一定的差异，构成玉米须多糖的成分是甘露糖、葡萄糖和半乳糖，还含有少量的鼠李糖、阿拉伯糖、糖醛酸、木糖、核糖和岩藻糖。5种csp的骨架主要由1
→
4，1
→
6，1
→
3,6及
→
1连接而成，糖苷键链接类型相似，但比例不同。1h-nrm谱和
13
c-nrm谱证明csp-1、csp-2、csp-3、csp-4和csp-5有α糖苷键和β糖苷键，α糖苷键比较多，csp-2中存在(1
→
4)和(1
→
6)。csp-1不存在三螺旋构象，而csp-2、csp-3、csp-4和csp-5在溶液中存在三重螺旋构象。
[0006]
《中药大辞典》中记载，玉米须有止血作用。杜娟等(玉米须多糖的止血作用研究[j].河南医学研究,2011,20(04):398-400+403.)分别采用断尾法、玻片法、复钙法观察玉米须多糖对小鼠出血时间(bt)、凝血时间(ct)、血浆复钙时间(rt)的影响，玉米须多糖可缩短小鼠bt、ct、rt，使血小板数增多，缩短大鼠aptt，提高大鼠血小板聚集性，对pt、fib、优球蛋白溶解时间影响不大证实了玉米须多糖是止血的有效成分；zead helmi abudayeh等(optimizing extractability,phytochemistry,acute toxicity,and hemostatic action of corn silk liquid extract[j].journal of chemistry,2022.)人研究了玉米须提取物的止血作用，与对照组相比，给予玉米须提取物后，大白鼠的凝血率缩短了35.9％，凝血酶原时间缩短了40％。
[0007]
综上所述，玉米须多糖作为一种生物活性物质，在应用过程中，需要选择合适的提取方法，考虑多糖的含量和结构等因素，以充分发挥其生物活性。
[0008]
本发明通过预实验发现玉米须水提物有较好的活性。将通过凝血实验进一步验证玉米须水提物的止血活血，为之后止血研究的应用提供参考依据。


技术实现要素：

[0009]
鉴于现有技术所存在的问题主要提供一种制备简单、结构新颖、疗效高，在医药市场有一定竞争力的多糖制备方法及其应用。
[0010]
根据本发明的第一个方面，本发明提供了一种玉米须多糖在制备促凝血药物中的用途，所述玉米须多糖采用水提醇沉的方法制备玉米须粗多糖，然后利用棉状deae纤维素对粗多糖进行纯化得到玉米须多糖。
[0011]
优选地，所述促凝血药物为能够缩短活化局部凝血时间(aptt)、凝血酶原时间(pt)、凝血酶时间(tt)中的任意一种，和/或增加纤维蛋白原(fib)的值。
[0012]
优选地，所述玉米须多糖的浓度为31.25μg/ml-500μg/ml；进一步优选为用于制备用于缩短pt时的促凝血药物的使用量为125μg/ml；用于制备缩短tt时的促凝血药物的使用量为500μg/ml；用于制备缩短aptt时的促凝血药物的使用量为125μg/ml；用于制备增加fib值时的促凝血药物的使用量为62.5μg/ml。本技术以活化局部凝血时间(aptt)、凝血酶原时间(pt)、凝血酶时间(tt)、纤维蛋白原(fib)为评判指标，氨甲环酸作阳性对照组，0.9％生理盐水作空白对照组，肝素钠作阴性对照组筛选凝血活性部位。与空白对照组生理盐水组(13.6
±
0.3s)相比，玉米须多糖在125μg/ml时就可以极显著地缩短pt(10
±
0.2s)的作用时间(p≤0.001)；与空白对照组生理盐水组(10.3
±
0.2s)相比，玉米须多糖在500μg/ml时显著缩短tt(8.55
±
0.3s)的作用时间(p≤0.01)。与空白对照组生理盐水组(41
±
2s)相比，玉米须多糖125μg/ml时就可以极显著地缩短aptt(37
±
2s)的作用时间(p≤0.001)。与空白对
照组生理盐水组(2.5
±
0.1s)相比，玉米须多糖在62.5μg/ml时极显著增加fib(2.59
±
0.1s)的值(p≤0.001)。结果显示：玉米须多糖的凝血活性随着剂量的增加呈依赖关系，与空白对照组相比，凝血时间aptt、pt、tt均显著缩短，fib含量显著升高，且500μg/ml时接近阳性对照组氨甲环酸。
[0013]
优选地，所述玉米须多糖采用水提醇沉的方法制备玉米须粗多糖，然后利用棉状deae纤维素对粗多糖进行纯化得到玉米须多糖的具体步骤为：将玉米须洗净，在水里浸泡24个小时，按照1：30料液比，在90℃热水中回流提取1h，重复操作3次，过滤，合并滤液，用旋转蒸发仪浓缩到1/5的滤液体积；将其冷却至室温，连续搅拌，再加入95％乙醇使乙醇浓度达到80％；然后，将其置于4℃低温下放置过夜，再利用离心机以4000r/min的转速离心10min，冷冻干燥，得到玉米须的粗多糖粉末，纯度为14.52％；玉米须纯化多糖：称取1g玉米须粗多糖，制成5mg/ml的溶液，称取经处理过的棉状deae去气泡湿法上柱，按粗多糖：抽干的棉状deae＝1：70(g/g)的比例上样，1mg/ml的流速，用1000ml的nacl溶液(0.5mol/l)进行洗脱。收集洗脱液，用旋转式蒸发仪进行浓缩，24h后用流动的蒸馏水进行分离，去除小分子的氯化钠，然后进行浓缩，冷冻并干燥，得到纯化后的玉米须多糖粉末，纯度为61.27％。
[0014]
优选地，所述玉米须多糖为分离出的单体多糖csp-1、csp-2、csp-3、csp-4或csp-5中任意一种(即论文玉米须多糖结构表征及其生物活性的研究[d].吉林化工学院,2019.中的csp-1、csp-2、csp-3、csp-4、csp-5)；所述单体多糖的浓度为31.25μg/ml-500μg/ml。
[0015]
优选地，所述玉米须多糖为分离出的单体多糖csp-1或csp-2。
[0016]
优选地，所述玉米须多糖为分离出的单体多糖csp-1，用于制备缩短pt值的促凝血药物中的用途。
[0017]
优选地，所述玉米须多糖为分离出的单体多糖csp-2，用于制备缩短aptt值的促凝血药物中的用途。本技术对现有技术(即论文玉米须多糖结构表征及其生物活性的研究[d].吉林化工学院,2019.中的csp-1、csp-2、csp-3、csp-4、csp-5)分离纯化后的五个组分的凝血指标进行测定，进一步验证多糖的凝血活性，与空白对照组相比玉米须分离出的单体多糖csp-1、csp-2、csp-3、csp-4、csp-5能够缩短pt、tt和aptt的作用时间，表现出良好的促凝血活性，与其他三个组分相比在低浓度时csp-2和csp-1就表现出较好的促凝血活性。
[0018]
另外，本技术对不同产地玉米须多糖凝血活性进行测定，提取和纯化安徽、河南、云南、四川、吉林、黑龙江、河北、广西、山东、甘肃不同产地的玉米须多糖，对其凝血活性进行测定，与空白对照组相比不同产地玉米须多糖在pt、tt凝血途径上都显示出显著的促凝血活性，在aptt凝血途径上都显示出微弱的促凝血活性。
[0019]
本发明通过可初步探索玉米须的药效物质，为之后的止血研究的应用提供参考依据。
[0020]
根据本发明的第二个方面，本发明提供了一种玉米须黄酮在制备用于抗凝血药物中的用途。
[0021]
优选地，所述玉米须黄酮由下述制备方法制备而成：采用乙醇溶液玉米须粗黄酮，提取条件为：按照乙醇浓度70％，料液比1：70(g/ml)，在80℃热水中回流提取2.5h，后于旋转蒸发仪中45℃进行浓缩，待浓缩液出现挂壁现象后立即停止浓缩，转移至蒸发皿中继续使用45℃水浴加热的方式呈浸膏状态，冷冻干燥，得到玉米须的粗黄酮粉末。ab-8大孔吸附树脂湿法装柱，再用乙醇加水(乙醇:水＝1:5)冲洗，直到流出液不再浑浊，然后用足够的纯
净水冲洗，直到没有醇的味道。最佳的纯化条件：上样液中总黄酮的浓度为1.88mg/ml，ph＝6.0，90％的乙醇洗脱，流速为2.5bv/h，洗脱剂的用量为5bv。收集洗脱液，冷冻干燥，得纯化黄酮样品，以下称为玉米须黄酮。
[0022]
根据本发明的第三个方面，本发明提供了一种玉米须皂苷在制备用于抗凝血药物中的用途。
[0023]
优选地，所述玉米须皂苷采用如下方法制备而成：采用有机溶剂浸提的方法提取玉米须的粗皂苷，提取条件为：取15g玉米须，向其中加入600ml 60％乙醇，放置在50℃的水浴锅中提取3h。提取1次后真空抽滤，弃去滤渣。滤液使用200ml石油醚萃取，弃去石油醚层，水层利用旋转蒸发仪在70℃下浓缩至挂壁状态，停止浓缩。将所得的浓缩液转入蒸发皿中，加入蒸馏水，使其体积至400ml。再利用正丁醇(400:200)连续萃取2次，过滤得上清，浓缩，70℃下蒸干得到棕黑色糊状物，冷冻干燥，即制备得到玉米须粗皂苷。ab-8大孔吸附树脂的预处理：先用足够的蒸馏水反复冲洗，然后用95％的乙醇溶液浸泡一整夜，采用乙醇湿法装柱，再用95％乙醇溶液洗至流出液加水(1:5)不呈现浑浊为止，最后用大量的蒸馏水冲洗至没有醇的味道，备用。称取一定量的粗玉米须皂苷粉末，用适量的蒸馏水溶解(试样浓度为1.6mg/ml)后上大孔吸附树脂柱静态吸附30min，然后先以蒸馏水洗脱至无色，再使用80％乙醇溶液洗脱皂苷类化合物(流速为1ml/min)，收集洗脱液，浓缩，将洗脱液冷冻干燥，制得纯化皂苷，以下称为玉米须皂苷。
[0024]
本发明技术整体构思：
[0025]
本发明首先研究挑选吉林省玉米须为原料，对玉米须多糖、黄酮、皂苷等有效部位进行提取和纯化，采用半自动凝血仪，以体外活化部分凝血活酶时间(aptt)、体外凝血酶原时间(pt)、体外凝血酶时间(tt)和体外纤维蛋白原(fib)为评判指标，氨甲环酸、0.9％生理盐水、肝素钠分别作阳性对照组、空白对照组和阴性对照组，筛选出玉米须促进凝血的活性部位。发掘其凝血的药用功效，并从中筛选出促进凝血作用的活性部位。
[0026]
其次采用高效液相色谱对不同产地的玉米须多糖建立凝血谱效关系，进一步研究其凝血有效部位的凝血活性。
[0027]
根据本发明的另一个方面，本发明提供了一种玉米须皂苷在制备治疗抗凝血药物中的用途；所述玉米须皂苷是通过如下方法制备而成：
[0028]
采用有机溶剂浸提的方法提取玉米须的粗皂苷，提取条件为：取15g玉米须，向其中加入600ml 60％乙醇，放置在50℃的水浴锅中提取3h。提取1次后真空抽滤，弃去滤渣。滤液使用200ml石油醚萃取，弃去石油醚层，水层利用旋转蒸发仪在70℃下浓缩至挂壁状态，停止浓缩。将所得的浓缩液转入蒸发皿中，加入蒸馏水，使其体积至400ml。再利用正丁醇(400:200)连续萃取2次，过滤得上清，浓缩，70℃下蒸干得到棕黑色糊状物，冷冻干燥，即制备得到玉米须粗皂苷。ab-8大孔吸附树脂的预处理：先用足够的蒸馏水反复冲洗，然后用95％的乙醇溶液浸泡一整夜，采用乙醇湿法装柱，再用95％乙醇溶液洗至流出液加水(1:5)不呈现浑浊为止，最后用大量的蒸馏水冲洗至没有醇的味道，备用。称取一定量的粗玉米须皂苷粉末，用适量的蒸馏水溶解(试样浓度为1.6mg/ml)后上大孔吸附树脂柱静态吸附30min，然后先以蒸馏水洗脱至无色，再使用80％乙醇溶液洗脱皂苷类化合物(流速为1ml/min)，收集洗脱液，浓缩，将洗脱液冷冻干燥，制得纯化皂苷，以下称为玉米须皂苷。
附图说明
[0029]
图1玉米须多糖的凝血测定结果；
[0030]
图2玉米须分离出的单体多糖对pt的作用时间；
[0031]
图3玉米须分离出的单体多糖对tt的作用时间；
[0032]
图4玉米须分离出的单体多糖对aptt的作用时间；
[0033]
图5不同产地玉米须多糖aptt凝血活性；
[0034]
图6不同产地玉米须多糖pt凝血活性；
[0035]
图7不同产地玉米须多糖tt凝血活性；
[0036]
图8本发明实验研究方案设计流程图。
具体实施方式
[0037]
实施方案一多糖的制备提取
[0038]
玉米须粗多糖：将玉米须洗净，在水里浸泡24个小时，按照1：30料液比，在90℃热水中回流提取1h，重复操作3次，过滤，合并滤液，用旋转蒸发仪浓缩到1/5的滤液体积。将其冷却至室温，连续搅拌，再加入95％乙醇使乙醇浓度达到80％。然后，将其置于4℃低温下放置过夜，再利用离心机以4000r/min的转速离心10min，冷冻干燥，得到玉米须的粗多糖粉末，纯度为14.52％；
[0039]
玉米须纯化多糖：称取1g玉米须粗多糖，制成5mg/ml的溶液，称取经处理过的棉状deae去气泡湿法上柱，按粗多糖：抽干的棉状deae＝1：70(g/g)的比例上样，1mg/ml的流速，用1000ml的nacl溶液(0.5mol/l)进行洗脱。收集洗脱液，用旋转式蒸发仪进行浓缩，24h后用流动的蒸馏水进行分离，去除小分子的氯化钠，然后进行浓缩，冷冻并干燥，得到纯化后的玉米须多糖粉末，纯度为61.27％。
[0040]
玉米须单体多糖：五个组分单体多糖提取及结构表征参考文献现有技术(玉米须多糖结构表征及其生物活性的研究[d].吉林化工学院,2019.)。采用deae-52色谱法对纯化后的玉米须多糖分离单体多糖的方法扩大样品量做凝血实验。根据实施方案一多糖的制备提取的实验方法，用蒸馏水、0.1、0.2、0.3及0.4mol/ml的氯化钠溶液进行洗脱，流速1ml/min，分别收集五管5ml并进行浓缩步骤、透析步骤、冷冻干燥步骤，然后采用sephadex g-150进行分离。称取sephadex g-150，用蒸馏水浸泡至过夜，沸水煮20min，除去气泡并湿法装柱，将上述五份玉米须多糖溶解为10mg/ml，用蒸馏水进行洗脱以0.6ml/min的流速，收集三管3ml并用苯酚-硫酸法测定其吸光度，绘制洗脱曲线。收集洗脱液进行浓缩及冷冻干燥，该方法稳定、分离效果好，结构与现有技术(玉米须多糖结构表征及其生物活性的研究[d].吉林化工学院,2019.)一致，得到一致的csp-1、csp-2、csp-3、csp-4、csp-5。本技术将现有技术(玉米须多糖结构表征及其生物活性的研究[d].吉林化工学院,2019.)中的所有内容援引至本技术中，作为公知技术。
[0041]
申请人在前期对玉米须分别用乙醇提取米须粗黄酮，ab-8大孔吸附树脂进行纯化得到米须黄酮。采用有机溶剂浸提的方法提取玉米须的粗皂苷，ab-8大孔吸附树脂进行纯化得到玉米须皂苷。具体方法如下：
[0042]
玉米须黄酮：采用乙醇溶液玉米须粗黄酮，提取条件为：按照乙醇浓度70％，料液比1：70(g/ml)，在80℃热水中回流提取2.5h，后于旋转蒸发仪中45℃进行浓缩，待浓缩液出
现挂壁现象后立即停止浓缩，转移至蒸发皿中继续使用45℃水浴加热的方式呈浸膏状态，冷冻干燥，得到玉米须的粗黄酮粉末。ab-8大孔吸附树脂湿法装柱，再用乙醇加水(乙醇:水＝1:5)冲洗，直到流出液不再浑浊，然后用足够的纯净水冲洗，直到没有醇的味道。本实验依据景怡等人
[52]
最佳的纯化条件：上样液中总黄酮的浓度为1.88mg/ml，ph＝6.0，90％的乙醇洗脱，流速为2.5bv/h，洗脱剂的用量为5bv。收集洗脱液，冷冻干燥，得纯化黄酮样品，以下称为玉米须黄酮。
[0043]
玉米须皂苷：采用有机溶剂浸提的方法提取玉米须的粗皂苷，提取条件为：取15g玉米须，向其中加入600ml 60％乙醇，放置在50℃的水浴锅中提取3h。提取1次后真空抽滤，弃去滤渣。滤液使用200ml石油醚萃取，弃去石油醚层，水层利用旋转蒸发仪在70℃下浓缩至挂壁状态，停止浓缩。将所得的浓缩液转入蒸发皿中，加入蒸馏水，使其体积至400ml。再利用正丁醇(400:200)连续萃取2次，过滤得上清，浓缩，70℃下蒸干得到棕黑色糊状物，冷冻干燥，即制备得到玉米须粗皂苷。ab-8大孔吸附树脂的预处理：先用足够的蒸馏水反复冲洗，然后用95％的乙醇溶液浸泡一整夜，采用乙醇湿法装柱，再用95％乙醇溶液洗至流出液加水(1:5)不呈现浑浊为止，最后用大量的蒸馏水冲洗至没有醇的味道，备用。称取一定量的粗玉米须皂苷粉末，用适量的蒸馏水溶解(试样浓度为1.6mg/ml)后上大孔吸附树脂柱静态吸附30min，然后先以蒸馏水洗脱至无色，再使用80％乙醇溶液洗脱皂苷类化合物(流速为1ml/min)，收集洗脱液，浓缩，将洗脱液冷冻干燥，制得纯化皂苷，以下称为玉米须皂苷。
[0044]
实施方案二凝血活性的方法测定
[0045]
取绵羊血，将其置于含有1/10体积的0.109mol/l枸橼酸(抗凝剂)试管中，在3000rpm的条件下离心15-20min，采集上层血浆，并将其放置-20℃冰箱中保存备用。阳性对照溶液：称取一定量的氨甲环酸，加入9倍蒸馏水配制成阳性对照品溶液；阴性对照溶液：称取适量的肝素钠，加入9倍蒸馏水配制成阴性对照品溶液；空白对照：本实验使用0.9％的生理盐水作空白对照；样品溶液：分别取经前期纯化后的玉米须有效部位，依次配制成质量浓度为31.25、62.5、125、250、500μg/ml的待测溶液。
[0046]
凝血酶时间tt测定：每瓶tt试剂加入2.0ml的缓冲液轻缓溶解，使用前预温30s。用移液枪分别移取20μl样品和80μl血浆混匀，37℃孵育30s，加入100μl复溶后的试剂r，记录血浆凝固时间，即为tt值。使用同样的方法检测血浆的凝血酶时间。
[0047]
活化部分凝血活酶时间aptt测定：移取20μl样品和80μl血浆混合，再加入0.1ml的aptt试剂，混匀，37℃条件下预温1min。随即加入0.1ml氯化钙溶液，记录血浆凝固时间，即为aptt值。使用同样的方法检测血浆的活化部分凝血活酶时间。
[0048]
凝血酶原时间pt测定：每瓶pt试剂加入2.0ml的缓冲液，使用前预温30s。用移液枪分别移取20μl样品和80μl血浆混合，37℃孵育30s，加入200μl复溶后的pt试剂r，记录血浆凝固时间，即为pt值。使用同样的方法检测质控血浆的凝血酶原时间。
[0049]
血浆纤维蛋白原fib测定：每瓶fib试剂加入2.0ml的缓冲液，绘制标准曲线。使用移液枪移取20μl样品和80μl血浆混合，加入900μl的稀释液(dlt)稀释，37℃孵育30s。取上述稀释后的血浆100μl，加入50μl复溶后的试剂，记录凝固时间。根据待测血浆的凝固时间，在标准曲线上读出其fib的含量。使用同样的方法检测血浆的凝血酶原时间。
[0050]
标准曲线的绘制：将复溶后的fib用20mmol/l稀释液(dlt)分别作1:5、1:10、1:15、1:20、1:30不同比例稀释，取不同稀释度的定值血浆200μl，37℃预温30s，然后分别加入100
μl fib凝血酶，测定凝固时间。以不同稀释度的fib定值血浆浓度(mg/dl)为横坐标，以相应的凝固时间(s)为纵坐标，在双对数坐标系上做标准曲线，fib的标准曲线为lgt＝-0.821lgc+3.3413。待测样本中fib的含量可以从标准曲线上读出。
[0051]
实施方案三玉米须纯化多糖的凝血活性
[0052]
将纯化样品稀释成一系列的浓度梯度，分别为31.25、62.5、125、250、500μg/ml，对不同的玉米须活性部位进行三次平行的凝血实验，取平均值，得到实验结果。图1显示，与空白对照组生理盐水组(13.6
±
0.3s)相比，玉米须多糖在125μg/ml时就可以极显著地缩短pt(10
±
0.2s)的作用时间(p≤0.001)；与空白对照组生理盐水组(10.3
±
0.2s)相比，玉米须多糖在500μg/ml时显著缩短tt(8.55
±
0.3s)的作用时间(p≤0.01)。与空白对照组生理盐水组(41
±
2s)相比，玉米须多糖125μg/ml时就可以极显著地缩短aptt(37
±
2s)的作用时间(p≤0.001)。与空白对照组生理盐水组(2.5
±
0.1s)相比，玉米须多糖在62.5μg/ml时极显著增加fib(2.59
±
0.1s)的值(p≤0.001)。表明玉米须多糖具有促凝血活性，多糖在500μg/ml时的促凝血效果接近阳性对照组氨甲环酸，且随着多糖样品浓度的增大，多糖的促凝血活性也随之增强，显示出显著的剂量-效应关系。
[0053]
类似的，申请人对实施方案一中制备得到的玉米须黄酮和玉米须皂苷进行了凝血活性测试，具体结果显示：1)与空白对照组生理盐水组(13.6
±
0.3s)相比，玉米须黄酮31.25μg/ml时就可以极显著地延长pt(35
±
0.3s)的作用时间(p≤0.001)。与空白对照组生理盐水组(10.3
±
0.2s)相比，玉米须黄酮在31.25μg/ml时极显著延长tt(29
±
0.4s)的作用时间。与空白对照组生理盐水组(41
±
2s)相比，玉米须黄酮31.25μg/ml时可以显著地显著延长aptt(44
±
2s)的作用时间(p≤0.01)。与空白对照组生理盐水组(2.5
±
0.1s)相比，玉米须黄酮在31.25μg/ml时极显著降低fib(2.03
±
0.4s)的值(p≤0.001)。综上与空白对照组生理盐水组相比，玉米须黄酮在31.25μg/ml就可以显著地延长pt、tt和aptt的作用时间，并且显著降低fib的含量，表明玉米须黄酮具有抗凝血活性。2)与空白对照组生理盐水组(13.6
±
0.3s)相比，玉米须皂苷31.25μg/ml时就可以极显著地延长pt(30
±
0.1s)的作用时间(p≤0.001)。与空白对照组生理盐水组(10.3
±
0.2s)相比，玉米须皂苷在31.25μg/ml时极显著延长tt(15
±
0.4s)的作用时间。与空白对照组生理盐水组(41
±
2s)相比，玉米须皂苷250μg/ml时可以显著地显著延长aptt(58
±
2s)的作用时间(p≤0.001)。与空白对照组生理盐水组(2.5
±
0.1s)相比，玉米须皂苷在31.25μg/ml时极显著降低fib(2.21
±
0.1s)的值(p≤0.001)。综上与空白对照组生理盐水组相比，玉米须皂苷可以显著地延长pt、tt和aptt的作用时间，并且显著降低fib的含量，表明玉米须皂苷具有抗凝血活性，且随着皂苷样品浓度的增大，皂苷的抗凝血活性也随之增强，显示出显著的剂量-效应关系。
[0054]
由以上实验结果可知玉米须多糖为促凝血活性部位(成分)，玉米须黄酮、皂苷为抗凝血活性部位(成分)。
[0055]
实施方案四玉米须单体多糖的凝血活性
[0056]
凝血酶原时间pt是指在血浆中凝血酶原通过转变成凝血酶的过程，再使纤维蛋白原转变成为纤维蛋白的过程，从而促使血浆凝固所需要的时间，它是最常用的检测外源性凝血系统功能的方法，其结果受血浆中因子ⅰ、ⅱ、
ⅴ
、ⅶ和
ⅹ
的浓度和抗凝物质的影响，也是血栓与止血实验室常规的基本实验之一。
[0057]
将现有技术(玉米须多糖结构表征及其生物活性的研究[d].吉林化工学院,
2019.)得到的csp-1、csp-2、csp-3、csp-4、csp-5分别进行如下活性测试：
[0058]
如图2所示(其中txa为氨甲环酸，saline为生理盐水，heparin为肝素三个对照组，其余实施例同)，与生理盐水组(17.5
±
0.4s)相比，五个单体多糖在500μg/ml的作用时间分别为csp-1(4.4
±
0.2s)、csp-2(14.4
±
0.4s)、csp-3(9.5
±
0.4s)、csp-4(14.3
±
0.4s)、csp-5(6.2
±
0.1s)均能够极显著缩短pt的作用时间(p≤0.001)，且随着浓度的增加其作用时间随之减少，与csp-2、csp-3、csp-4、csp-5相比，在低浓度时csp-1就表现出了对pt较强的作用效果。
[0059]
凝血酶时间tt是测量血浆中纤维蛋白原转变为不溶性纤维蛋白，从而促使血浆凝固所需要的时间，它是检查受试者血浆凝血功能的简便实验，也是检测凝血、抗凝及纤维蛋白溶解系统功能的一个过筛实验。
[0060]
如图3所示，与生理盐水组(13
±
0.3s)相比，在31.25μg/ml时五个单体多糖就表现出了对tt较强的作用效果，作用时间分别为csp-1(11.7
±
0.3s)、csp-2(9.0
±
0.03s)、csp-3(8.7
±
0.05s)、csp-4(9.5
±
0.05s)、csp-5(11.4
±
0.2s)均能够极显著缩短pt的作用时间(p≤0.001)，均显著缩短tt的作用时间(p≤0.001)，在31.25μg/ml时五个单体多糖就表现出了对tt较强的作用效果，在浓度为500μg/ml时的促凝血效果接近阳性对照组氨甲环酸。
[0061]
活化部分凝血活酶时间aptt是一种检测内源性凝血因子缺陷的筛查试验，它先以激活剂激活凝血因子，在激活内源性凝血途径，使凝血酶原通过转变为凝血酶的过程，凝血酶使纤维蛋白原转变为纤维蛋白的过程导致血浆凝固，从而记录从添加试剂到血浆凝固所需要的时间。
[0062]
如图4所示，与空白对照生理盐水(47.1
±
0.6s)组相比，五个组分均显著缩短aptt的作用时间，且随着浓度的增加其作用时间随之减少，说明分离出的单体多糖具有较好的促凝血活性；与csp-1(32.7
±
0.3s)、csp-3(31.2
±
0.03s)、csp-4(31.0
±
0.2s)、csp-5(29.9
±
0.4s)相比，csp-2(25.2
±
0.05s)在500μg/ml时的促凝血活性最强；与csp-1、csp-3、csp-4、csp-5相比，在低浓度时csp-2就表现出了对aptt较强的作用效果。csp-2对aptt的作用效果最强，同时说明csp-2玉米须多糖的五个组分的促凝血活性与“内源性途径”凝血因子的缺陷有关。
[0063]
五个组分的单糖组成种类相同，但摩尔比不同，主要种类有葡萄糖、半乳糖和半乳糖醛酸，其次是阿拉伯糖、木糖、鼠李糖、岩藻糖、核糖、葡萄糖醛酸和岩藻糖。其中，csp-1占比例较多的是葡萄糖和甘露糖，csp-2中占比例较多的是葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖和木糖且高于其它几种多糖。csp-3、csp-4、csp-5的单糖组成相似。由于低浓度时csp-1和csp-2的凝血活性就极其显著，所以推测葡萄糖、甘露糖、半乳糖、木糖和阿拉伯糖是影响玉米须促凝血活性单糖，但是有待下一步实验的验证。
[0064]
综上，由上述的体外凝血实验探究可得，通过对比阳性对照组氨甲环酸、空白对照组0.9％生理盐水和阴性对照组肝素钠注射液，对提取和纯化后的玉米须有效部位能够得到以下结论：
[0065]
1、玉米须多糖能够缩短pt、tt和aptt的作用时间，升高fib的含量，表明其具有促凝血的活性，且随着样品浓度的增大，显示出显著的剂量-效应关系。而玉米须黄酮和皂苷具有抗凝血的活性，能够有效延长pt、tt和aptt的作用时间，降低fib的含量。
[0066]
2、玉米须分离多糖csp-1、csp-2、csp-3、csp-4、csp-5能够缩短pt、tt和aptt的作
用时间，表现出良好的促凝血活性，与其他三个组分相比在低浓度时csp-2和csp-1就表现出较好的促凝血活性，可能与葡萄糖、甘露糖、半乳糖、木糖和阿拉伯糖是影响玉米须促凝血活性的主要多糖有关。通过对玉米须多糖分离组分的促凝血活性研究，进一步验证了玉米须多糖有效部位的促凝血活性。
[0067]
3、本实验利用不同的提取和纯化方法得到三种玉米须有效部位，利用体外凝血实验筛选出玉米须促凝血活性部位，为玉米须凝血活性的进一步开发利用提供实验依据。
[0068]
实施方案五不同产地玉米须多糖的凝血活性
[0069]
以吉林产地玉米须的多糖含量为标准，按照现有技术中的方法将不同产地得到的玉米须纯化多糖统一配置成均含有500μg/ml多糖的待测溶液。
[0070]
图5-7显示，与空白对照组生理盐水组(13.8s)相比，吉林(6.8
±
0.08s)、云南(7.3
±
0.6s)、山东(6.2
±
0.4s)、河南(8.2
±
1.3s)、甘肃(5.8
±
0.7s)、四川(6.3
±
0.3s)、广西(7.5
±
0.8s)、河北(7.2
±
0.6s)、黑龙江(6.5
±
0.1s)、安徽(6.4
±
1.3s)，不同产地的玉米须多糖可以极显著地缩短pt作用时间(p《0.001)，并且其凝血效果接近阳性对照组氨甲环酸(4.2s)。与空白对照组生理盐水相(10.4s)比，云南(5.7
±
0.4s)、河南(5.4
±
0.9s)、河北(4.4
±
0.4s)、吉林(6.6
±
0.5s)、甘肃(6.6
±
1.4s)及广西(7.1
±
1.5s)显著缩短tt的作用时间，山东(7.7
±
1.2s)、四川(8.6
±
1.9s)、黑龙江(7.4
±
1.8s)虽然没有显著的影响，但其凝血时间也明显小于空白对照组生理盐水，不同产地玉米须多糖对aptt的影响效果不显著，综上不同产地玉米须多糖具有促凝血活性。
[0071]
上述实施例为本发明优选地实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种玉米须多糖在制备促凝血药物中的用途，所述玉米须多糖采用水提醇沉的方法制备玉米须粗多糖，然后利用棉状deae纤维素对粗多糖进行纯化得到玉米须多糖。2.根据权利要求1所述的用途，所述促凝血药物为能够缩短活化局部凝血时间(aptt)、凝血酶原时间(pt)、凝血酶时间(tt)中的任意一种，和/或增加纤维蛋白原(fib)的值。3.根据权利要求1所述的用途，所述玉米须多糖的浓度为31.25μg/ml-500μg/ml；进一步优选为用于制备用于缩短pt时的促凝血药物的使用量为125μg/ml；用于制备缩短tt时的促凝血药物的使用量为500μg/ml；用于制备缩短aptt时的促凝血药物的使用量为125μg/ml；用于制备增加fib值时的促凝血药物的使用量为62.5μg/ml。4.根据权利要求1所述的用途，所述玉米须多糖采用水提醇沉的方法制备玉米须粗多糖，然后利用棉状deae纤维素对粗多糖进行纯化得到玉米须多糖的具体步骤为：将玉米须洗净，在水里浸泡24个小时，按照1：30料液比，在90℃热水中回流提取1h，重复操作3次，过滤，合并滤液，用旋转蒸发仪浓缩到1/5的滤液体积；将其冷却至室温，连续搅拌，再加入95％乙醇使乙醇浓度达到80％；然后，将其置于4℃低温下放置过夜，再利用离心机以4000r/min的转速离心10min，冷冻干燥，得到玉米须的粗多糖粉末，纯度为14.52％；称取1g玉米须粗多糖，制成5mg/ml的溶液，称取经处理过的棉状deae去气泡湿法上柱，按粗多糖：抽干的棉状deae＝1：70(g/g)的比例上样，1mg/ml的流速，用1000ml的nacl溶液(0.5mol/l)进行洗脱；收集洗脱液，用旋转式蒸发仪进行浓缩，24h后用流动的蒸馏水进行分离，去除小分子的氯化钠，然后进行浓缩，冷冻并干燥，得到纯化后的玉米须多糖粉末，纯度为61.27％。5.根据权利要求1所述的用途，所述玉米须多糖为分离出的单体多糖csp-1、csp-2、csp-3、csp-4或csp-5中任意一种；所述单体多糖的浓度为31.25μg/ml-500μg/ml。6.根据权利要求5所述的用途，所述玉米须多糖为分离出的单体多糖csp-1或csp-2。7.根据权利要求6所述的用途，所述玉米须多糖为分离出的单体多糖csp-1，用于制备缩短pt值的促凝血药物中的用途。8.根据权利要求6所述的用途，所述玉米须多糖为分离出的单体多糖csp-2，用于制备缩短aptt值的促凝血药物中的用途。

技术总结
本发明涉及止血药物技术领域，尤其是止血剂方面的应用。在本发明中，采用热水法提取玉米须多糖、用DEAE法纯化玉米须多糖、以活化局部凝血时间APTT、凝血酶原时间PT、凝血酶时间TT、纤维蛋白原FIB为评判指标，氨甲环酸作阳性对照组，0.9％生理盐水作空白对照组，肝素钠作阴性对照组测定凝血时间，验证了玉米须多糖具有优异的促凝血功能，综上玉米须多糖具有良好的市场开发应用前景。的市场开发应用前景。的市场开发应用前景。


技术研发人员：李雪 刘天月 朱蕴文 李亚洁 周鸿立
受保护的技术使用者：吉林化工学院
技术研发日：2023.07.28
技术公布日：2023/10/5