一株具有增己降乙特性的热带假丝酵母诱变菌株及其用途

1.本发明属于生物工程技术领域，涉及工业微生物的育种，特别设计一种增产己酸乙酯且降低乙酸乙酯生成的热带假丝酵母菌株及其诱变方法与用途。


背景技术：

2.浓香型白酒以酯类香气为主，酯类物质占香气成分总量的60％左右，是构成浓香型白酒香气浓郁、口感醇厚等特征的决定因素。己酸乙酯、丁酸乙酯、乳酸乙酯、乙酸乙酯被称为浓香型白酒的四大酯类[王建科,李星禹.浓香型白酒主要酯类物质在馏酒过程中馏出规律的探究[j].酿酒,2022.49(06):80-83.赵红平,罗惠波,刘淼,黄丹,张宿义,秦辉,李子健.不同上甑条件对浓香型白酒乙醇及风味物质馏出的影响[j].食品与发酵工业,2023.49(05):101-108]。
[0003]
己酸乙酯是构成浓香型白酒典型风格的主体，它的存在对白酒口感和酒体风格具有重要作用[黄平,王子豪,郑佳,金垚,黄钧,赵东,周荣清,吴重德.浓香型白酒大曲微生物群落结构研究进展[j].微生物学通报,2023.1-24]。在传统浓香型白酒发酵过程中，己酸乙酯主要由大曲酒糟中的己酸菌在厌氧条件下，与酿酒酵母、酒醅和窖泥中的酵母菌共同发酵产生的[black paul n&dirusso concetta c.(2007).yeast acyl-coa synthetases at the crossroads of fatty acid metabolism and regulation[j].biochimica et biophysica acta(bba)-molecular and cell biology of lipids,2007.1771(3):286-298][何亚辉,马艳蕊,薛星祥,杜永静,陈叶福,郭学武,肖冬光.脂肪酸酰基辅酶a合成酶对酿酒酵母己酸乙酯合成的影响[j].天津科技大学学报,2020.35(02):13-21]。秦立芹[秦立芹,殷欢,成柳洁,龚艺，丁泽，李秀婷，范光森.一株高产己酸乙酯酵母菌株的筛选、鉴定及发酵条件优化[j].食品与发酵工业,2022.48(01):55-61]等采用传统筛选方法，在发酵过程中加入正己酸和无水乙醇，从不同酒曲中筛选出高产己酸乙酯的伯顿丝孢毕赤酵母酵母菌株，为浓香型白酒品质的提高提供了更好的理论基础。刘朋肖[刘朋肖,常煦,成柳洁.酿酒酵母y3401产己酸乙酯发酵条件的优化[j].中国食品学报,2022,22(02):178-189]等在酿酒酵母中加入无水乙醇和己酸进行发酵，对酿酒酵母产己酸乙酯条件进行优化。
[0004]
己酸乙酯一般有两条合成途径，一是在酯化酶的催化下，己酸和乙醇经过酯化反应形成己酸乙酯，这是合成己酸乙酯的主要途径[黄丹,储玉龙,尚志超,张强.大曲酯化酶根霉菌的分离及产酶条件研究[j].食品与发酵科技,2010.46(03):30-32]，另一途径是由醇乙酰基转移酶催化乙酰辅酶a与乙醇生成己酸乙酯[何亚辉,马艳蕊,薛星祥,杜永静,陈叶福,郭学武,肖冬光.脂肪酸酰基辅酶a合成酶对酿酒酵母己酸乙酯合成的影响[j].天津科技大学学报,2020.35(02):13-21]。


技术实现要素：

[0005]
针对上述问题，本发明的目的在于提供一株具有增己降乙特性的诱变菌株，该诱变菌株为热带假丝酵母菌株jm2(40s-18-46)主要以己酸为底物进行己酸乙酯的生成，经过
两轮诱变，菌株jm2(40s-18-46)产生己酸乙酯的能力大大提高，且同时能极大降低乙酸乙酯的生成。
[0006]
本发明的再一目的在于提供上述诱变菌株的应用。
[0007]
为了实现上述目的，本发明采用的具体方案为：一株具有增己降乙特性的诱变菌株，所述增己降乙是指增加己酸乙酯含量且降低乙酸乙酯含量；所述诱变菌株为热带假丝酵母菌株jm2(40s-18-46)，分类命名为candida tropicalis，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为中国北京市，保藏编号为cgmcc 27834，保藏日期为2023年07月07日。
[0008]
一种微生物菌剂，包含上述的诱变菌株。
[0009]
上述的诱变菌株或微生物菌剂在酿酒中的应用。
[0010]
一种提高浓香型白酒中己酸乙酯含量的方法，采用上述的诱变菌株，以己酸为底物进行酯化发酵。
[0011]
本发明具有以下有益效果：
[0012]
本发明从宋河浓香型白酒酒醅中筛选出一株产酯性能较好的热带假丝酵母jm2菌株，对这一株产酯酵母进行artp诱变筛选并采用gc-ms技术对其挥发性物质进行分析，经过两轮诱变及筛选获得酯化功能增强、促进己酸乙酯产量增加并且降低乙酸乙酯含量的菌株。
[0013]
(1)经分离纯化鉴定得出，从酒醅中筛选出的一株酵母菌株jm2为热带假丝酵母(candida tropicalis)。经过平板初筛及发酵复筛，发现该酵母菌具有较好的酯化作用，能够发酵产生多种酯类及醇类物质。
[0014]
(2)采用artp技术对菌株jm2进行第一次诱变，挑选致死率为90-95％的平板进行菌株的活化及保藏，对所有菌株进行平板初筛，jm2酯化酶酶活正突变率为54.3％。挑选酯化酶活最大的诱变菌株jm2(40s-18)，分别以己酸、己酸乙酯为底物进行发酵。其中诱变菌株jm2(40s-18)以己酸为底物酯化发酵产生的酯类物质中，己酸乙酯的相对含量平均为9.55mg/l，较原始菌株加入己酸发酵产生的己酸乙酯含量(3.65mg/l)增加了161.6％；而加入乙酸乙酯为底物进行发酵产生的酯类物质中，己酸乙酯的含量并没有显著提升，含量最高为0.40mg/l。结果表明，以己酸为底物，诱变菌株发酵后增加己酸乙酯的产量，且远远高于以乙酸乙酯为底物进行发酵产生己酸乙酯的含量。综合判断，菌株jm2(40s-18)主要是以己酸为底物酯化作用产生己酸乙酯，因此选择菌株jm2(40s-18)进行第二次诱变且选择加入己酸为底物进行后续发酵实验。同时经过第一次诱变后，菌株jm2(40s-18)酒醅糖化液发酵产乙酸乙酯的含量为1.87mg/l，与野生菌株jm2(39.60mg/l)相比，降低了95.3％；当以己酸为底物时，诱变菌株jm2(40s-18)发酵产乙酸乙酯含量为13.94mg/l，比野生菌株jm2(19.32mg/l)相比，降低了27.8％。
[0015]
(3)对第一次诱变后筛选出的诱变菌株jm2(40s-18)进行第二次诱变，挑选致死率为90-95％的平板进行菌株的活化及保藏，对所有菌株进行平板初筛，菌株jm2(40s-18)酯化酶酶活正突变率为33.3％，挑选酯化酶活最大的菌株jm2(40s-18-46)进行发酵实验。菌株jm2(40s-18-46)以己酸为底物发酵后己酸乙酯的平均相对含量为11.06mg/l，较第一次诱变后加入己酸进行发酵产生的己酸乙酯含量增加了15.81％。与原始菌株相比，经过两次诱变，以己酸为底物，菌株jm2(40s-18-46)的己酸乙酯的生成量增加了203.01％。同时经过
第二次诱变后，菌株jm2(40s-18-46)酒醅糖化液发酵产乙酸乙酯的含量为3.54mg/l，与野生菌株jm2(39.60mg/l)相比，降低了91.1％；当以己酸为底物时，诱变菌株jm2(40s-18-46)发酵产乙酸乙酯含量为0.11mg/l，比野生菌株jm2(19.32mg/l)相比，降低了99.4％。
[0016]
综上所述，菌株jm2(40s-18-46)主要以己酸为底物进行己酸乙酯的生成，菌株jm2(40s-18-46)产生己酸乙酯的能力大大提高，且同时能极大降低乙酸乙酯的生成。说明经过诱变，增强了株菌的“增己降乙”作用。对于在生产中与产己酸菌联合发酵强化“增己降乙”特性具有重要意义。
[0017]
菌种保藏说明：热带假丝酵母菌株jm2(40s-18-46)，分类命名为candida tropicalis，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为中国北京市，保藏编号为cgmcc 27834，保藏日期为2023年07月07日。
附图说明
[0018]
图1是热带假丝酵母菌jm2野生菌株形态图；
[0019]
图2是野生菌株jm2酯化作用平板检测结果图；
[0020]
图3是野生菌株jm2生长曲线图；
[0021]
图4是菌株jm2第一次诱变致死曲线图；
[0022]
图5是诱变菌株jm2第一次诱变后致死率为90-95％的菌落形态图；
[0023]
图6是酵母菌酯化作用平板形态图；
[0024]
图7是第一次诱变后菌株jm2(40s-18)生长曲线图；
[0025]
图8是菌株jm2(40s-18)致死率曲线图；
[0026]
图9是菌株jm2(40s-18)诱变后致死率为90-95％的菌落形态图；
[0027]
图10是两次诱变后菌株与原始菌株以己酸为底物液态发酵己酸乙酯含量对比图；图中，b1为jm2原始菌株；b2为jm2(40s-18)；b3为菌株jm2(40s-18-46)。
具体实施方式
[0028]
本发明利用artp诱变技术，结合gc-ms对诱变菌株挥发性代谢物质进行分析，筛选获得高产己酸乙酯且能够降低乙酸乙酯生成的假丝酵母菌株jm2(40s-18-46)，为浓香型白酒“增己降乙”提供宝贵菌种资源。
[0029]
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
[0030]
实施例1
[0031]
一、方法步骤
[0032]
1.酵母菌株分离纯化及产酯作用初筛
[0033]
(1)酵母菌株分离
[0034]
从宋河浓香型白酒酒醅中挑选两株酵母菌株，挑取少量菌落接种至yepd培养基中进行活化，观察菌株形态。并将活化出的菌株进行多次纯化筛选。
[0035]
(2)酵母菌株产酯特性初筛
[0036]
将纯化出的酵母菌株采用点植法接种至酯化酶筛选培养基，筛选具有产酯化酶功能的酵母菌。以酯化酶透明圈为观察指标，待菌落生长稳定后，测定菌落直径(d/mm)和总透明圈直径(d/mm)，选取d/d值较大的菌落进行液态发酵实验。
[0037]
2.酵母菌株挥发性物质检测
[0038]
(1)酵母菌株酒醅糖化液挥发性物质检测
[0039]
挑取少量原始菌株制成菌悬液(od600≈1.0)，加入50ml液态发酵糖化液培养基，该培养基采用以下方法制备：称取10kg的浓香型白酒酿酒原料(高粱:大米:糯米:小麦:玉米＝10:1.8:1.7:2.1:1)，置于蒸锅中，加温水浸泡，使水完全浸没原料高出20cm后，于60℃的烘箱中浸泡过夜，使其充分吸水膨胀，浸泡后将水沥干放入灭菌锅中115℃蒸煮20min破皮，蒸完后加温水再次浸泡30min左右，反复3次蒸热浸泡，使原料充分裂解破皮。按照酒醅:水体积比＝1:4添加水，加高温淀粉酶(每100g酒醅原料中加0.05g酶，先用温水将高温淀粉酶(河南中辰生物科技有限公司)融化后再加入)，高温(92℃)活化一个半小时后将水温降到60℃，加糖化酶(河南中辰生物科技有限公司)(每100g高粱加0.1g酶)，糖化两小时，后用八层纱布过滤、离心后取上清液，后用0.45微米滤纸进行抽滤后装瓶即可制成发酵液。置于恒温摇床中发酵14d。发酵完毕后，将发酵液取出，5000r/min，4℃，离心5min。取8ml上清液至顶空瓶，加入10μl 4-辛醇作为内标用于分析，加3g nacl，处理成气质样品。将处理完毕的气质样品采用gc-ms进行检测原始菌株的产己酸乙酯的情况。
[0040]
(2)酵母菌以己酸为底物挥发性物质检测
[0041]
挑取少量原始菌株制成菌悬液(od600≈1.0)，加入50ml液态发酵糖化液培养基，加入1％的己酸作为底物制成发酵液，置于恒温摇床中发酵14d。发酵完毕后将发酵液取出处理成气质样品，采用gc-ms检测挥发性物质。
[0042]
3.酵母菌株第一次诱变筛选实验
[0043]
(1)生长曲线测定
[0044]
将分离纯化出的两株原始酵母菌株接种于yepd液体培养基中，进行分光光度值的测定，检测其od560值，之后每隔4h检测一次，直至测完24h，最后绘制生长曲线。
[0045]
(2)artp诱变实验
[0046]
根据生长曲线，将培养至对数生长期的酵母菌株配制成菌悬液(od560≈0.8)。在无菌条件下吸取10μl菌悬液打到诱变专用的铁片表面，将铁片放置于artp诱变仪凹槽中，以氦气(he)作为工作气体，调节功率为120w，气流量为10l/min，将菌株按20、40、60、80、100、120s的诱变时间进行处理，每组时间取三个平行。诱变后将铁片置于盛有1000μl无菌水的ep管中，制成10-2
稀释梯度。用签子将铁片上的菌落刮下，随后在涡旋混匀仪上充分振荡1-2min，取200μl菌液涂布于yepd培养基上，28℃培养48h，以未经诱变处理的菌悬液作为空白对照。待菌落长出后，通过平板菌落计数计算致死率，并绘制致死曲线，确定最佳诱变时间。致死率计算公式如下：
[0047]
(3)产酯特性初筛实验
[0048]
将一次诱变后致死率为90-95％的菌株采用点植法接种至酯化酶筛选培养基，筛选具有产酯化酶功能的酵母菌。以酯化酶透明圈为观察指标，待菌落生长稳定后，测定菌落直径(d/mm)和总透明圈直径(d/mm)，选取d/d值较大的菌落进行液态发酵实验。
[0049]
(4)诱变酵母菌液态发酵挥发性物质检测
[0050]
挑取几株d/d值较大的菌落制成菌悬液(od600≈1.0)，加入50ml液态发酵培养基，一组加入1％的己酸作为底物，另一组加入1％的乙酸乙酯作为底物，每组取三个平行，制成
发酵液。以不加底物的发酵液作为对照组，置于摇床中发酵14d。
[0051]
发酵完毕后，将装有不同底物的发酵液取出，处理成气质样品，采用gc-ms技术检测发酵后酵母菌株的挥发性物质。
[0052]
4.酵母菌株第二次诱变筛选实验
[0053]
(1)生长曲线测定
[0054]
选择第一次诱变筛选后发酵产酯能力较强的酵母菌株接种于yepd液体培养基中，对菌落进行分光光度值的测定，检测其od560值，之后每隔4h检测一次，直至测完24h，随后绘制生长曲线。
[0055]
(2)artp诱变实验
[0056]
根据生长曲线，将培养至对数生长期的酵母菌株配制成菌悬液(od560≈0.8)。
[0057]
在无菌条件下吸取10μl菌悬液打到诱变专用的铁片表面，将铁片放置于artp诱变仪凹槽中，以氦气(he)作为工作气体，调节功率为120w，气流量为10l/min，将菌株按20、40、60、80、100、120s的诱变时间进行处理，每组时间取三个平行。诱变后将铁片置于盛有1000μl无菌水的ep管中，制成10-2
稀释梯度。用签子将铁片上的菌落刮下，随后在涡旋混匀仪上充分振荡1-2min，取200μl菌液涂布于yepd培养基上，28℃培养48h，以未经诱变处理的菌悬液作为空白对照。待菌落长出后，通过平板菌落计数计算致死率，并绘制致死曲线，确定最佳诱变时间。致死率计算公式如下：
[0058]
(3)产酯特性初筛实验
[0059]
将一次诱变后致死率为90-95％的菌株采用点植法接种至酯化酶筛选培养基，筛选具有产酯化酶功能的酵母菌。以酯化酶透明圈为观察指标，待菌落生长稳定后，测定菌落直径(d/mm)和总透明圈直径(d/mm)，选取d/d值较大的菌落进行液态发酵实验。
[0060]
(4)诱变酵母菌液体发酵挥发性物质检测
[0061]
将挑选出的酯化酶能力较强的酵母菌株制成菌悬液(od600≈1.0)，取200μl菌液加入带有内塞的100ml螺口厌氧瓶中，加入50ml液态发酵糖化液培养基，分成两组，一组以1％乙酸乙酯为底物，另一组1％己酸为底物，每组取三个平行，制成发酵液，放置摇床中发酵12d。以为加底物的发酵液作为对照组。
[0062]
发酵完毕后将发酵液取出，处理成气质样品，采用gc-ms方法检测发酵后菌株挥发性物质。
[0063]
二、结果分析
[0064]
1.1酵母菌株分离纯化及产酯作用初筛
[0065]
1.1.1酵母菌株分离结果
[0066]
将酒醅中的酵母进行分离纯化，经形态去重复之后，获得两种不同类型的酵母菌，如表1所示，菌落形态图及透射电镜图如图1所示。根据yepd培养基上的菌落特征可以看出，两种酵母菌株菌呈白色、表面光滑且质地粘稠。其中，菌株jm2菌落呈中间凸起的白色的不规则形状，18s-rrna基因测序结果显示该菌株与热带假丝酵母(candida tropicalis)相似度为100％，初步判断菌株jm2为热带假丝酵母。
[0067]
表1酵母菌株分离纯化结果
[0068]
1.1.2酵母菌株产酯特性初筛结果
[0069]
对分离纯化出的两株酵母菌株进行产酯化酶能力平板检测，其结果如表2和图2所示，菌株jm2(candida tropicalis)的d/d值为1.4。说明菌有一定的酯酶活性，随后对酵母菌株进行液态模拟发酵。
[0070]
表2原始酵母菌株酯化酶能力测定结果。
[0071]
原始菌株酯化作用平板形态图如图2所示。
[0072]
1.2酵母菌株挥发性物质检测分析
[0073]
1.2.1酵母菌酒醅糖化液挥发性物质检测分析
[0074]
对分离出的两株酵母菌株进行酒醅原料发酵挥发性物质检测，其结果如表3所示。gc-ms结果显示共检测到24种挥发性物质，菌株jm2(candida tropicalis)的己酸乙酯含量为0.15mg/l。结果表明，两株菌能够以液态发酵糖化液发酵产生己酸乙酯及多种酯类、醇类及酸类物质。
[0075]
表3原始酵母菌株挥发性物质检测结果。
[0076]
注：nd为“未检测到”。
[0077]
3.2.2酵母菌以己酸为底物发酵挥发性物质检测分析
[0078]
对分离出的两株酵母菌株以己酸为底物进行液态发酵检测挥发性物质，其结果如表4所示。gc-ms结果显示共检测到24种挥发性物质，菌株jm2(candida tropicalis)的己酸乙酯含量为3.65mg/l。
[0079]
表4酵母菌株以己酸为底物发酵挥发性物质检测结果。
[0080]
注：nd为“未检测到”[0081]
1.3酵母菌株诱变筛选
[0082]
1.3.1第一次诱变筛选结果分析
[0083]
(1)酵母菌株生长曲线测定
[0084]
菌株jm2(candida tropicalis)的生长曲线如图3所示，菌株jm2培养至0-4h区间处于延滞期。4-12h区间进入对数生长期，12h后趋于稳定。当菌株jm2培养至12h时，处于对数生长期后期，因此选取该阶段的细胞进行artp诱变实验。
[0085]
(2)第一次诱变致死曲线绘制
[0086]
菌株jm2在artp诱变中的致死结果如表5所示。菌株jm2致死曲线如图4所示。当处理时间为40s时致死率达94％：当处理时间增加到80s时，其致死率高达99％。因此选择40s为此次诱变的最佳诱变时间，通过平板菌落计数得到此时菌落数为46个，将其按照jm2
(40s-1)、jm2(40s-2)
……
jm2(40s-46)的方式进行编号，随后进行下一步酯化能力筛选。
[0087]
表5菌株jm2第一次诱变致死率结果。
[0088]
菌株jm2第一次诱变后致死率为90-95％的菌落形态图如图5所示。
[0089]
(3)第一次诱变酵母菌酯化酶能力筛选
[0090]
经过诱变筛选，菌株jm2总共挑选46株菌进行酯化酶初筛。以具有透明圈作为阳性指标，菌株jm2的正突变率为54.3％。正突变菌株的酯酶透明圈直径比值如表6所示。诱变菌株jm2(40s-11、40s-14、40s-18)的d/d值大于原始菌株。因此挑选jm2(40s-18)进行液态模拟发酵实验。
[0091]
表6第一次诱变后jm2部分菌株酯酶透明圈检测。
[0092]
菌落酯化作用平板形态图如图6所示。
[0093]
(4)第一次诱变酵母菌液态发酵挥发性物质检测。
[0094]
通过artp第一次诱变及酯化能力初筛，筛选能力最强的菌株进行液态模拟发酵。菌株单独发酵及添加己酸和乙酸乙酯为底物发酵挥发性物质检测结果如表7、8所示，加入己酸为底物后，菌株jm2共检测到己酸乙酯、乙酸乙酯等6种不同的酯类化合物，加入乙酸乙酯为底物后检测出己酸乙酯、乙酸丙酯、戊酸乙酯、乙酸甲酯、丙酸乙酯10种不同的酯类物质。
[0095]
如表7、8所示，菌株jm2(40s-18)(图6)单纯菌株发酵，产生的己酸乙酯的含量为0.11mg/l，与原始菌株(0.15mg/l)相比未见较大变化。己酸为底物酯化发酵产生的酯类物质中，己酸乙酯的相对含量平均为9.55mg/l，较原始菌株加入己酸发酵产生的己酸乙酯含量(3.65mg/l)增加了161.6％；而加入乙酸乙酯为底物进行发酵产生的酯类物质中，己酸乙酯的含量并没有显著提升，含量最高为0.40mg/l。同时经过第一次诱变后，菌株jm2(40s-18)酒醅糖化液发酵产乙酸乙酯的含量为1.87mg/l，与野生菌株jm2(39.60mg/l)相比，降低了95.3％；当以己酸为底物时，诱变菌株jm2(40s-18)发酵产乙酸乙酯含量为13.94mg/l，比野生菌株jm2(19.32mg/l)相比，降低了27.8％。
[0096]
结果表明，以己酸为底物，诱变菌株发酵菌能增加了己酸乙酯的含量，且远远高于以乙酸乙酯为底物进行发酵产生的己酸乙酯的含量，故推测该诱变菌株的己酸乙酯的形成是以酯化功能为主。因此在第二次诱变中选择加入己酸作为底物进行液态发酵实验。
[0097]
表7第一次诱变后加入己酸发酵酯化检测结果。
[0098]
注：nd为“未检测到”。
[0099]
表8第一次诱变后菌株加入乙酸乙酯为底物发酵酯化检测结果。
[0100]
注：nd为“未检测到”[0101]
1.3.2第二次诱变筛选结果分析
[0102]
(1)酵母菌株生长曲线测定
[0103]
选取菌株jm2(40s-18)作为第二次诱变的出发菌株，其生长曲线如图7所示。菌株jm2(40s-18)培养至0-4h区间处于延滞期。4-12h区间进入对数生长期，12h后趋于稳定。本实验选取菌株jm2 12h的发酵液进行后续诱变实验。
[0104]
(2)第二次诱变致死曲线绘制
[0105]
根据一次诱变后酯化能力筛选结果，筛选出jm2(40s-18)菌进行二次诱变筛选，致死率结果如表9所示，致死曲线如图8所示。
[0106]
由图8可知，菌株jm2(40s-18)在处理时间为20s时的致死率比较低。当处理时间达40s时，菌株jm2(40s-18)的致死率高达94％，因此选择诱变时间为40s长出的菌落进行后续筛选实验，通过平板菌落计数得到该时间段的菌落数为54个。同理，将其按照jm2(40s-18-1)、jm2(40s-18-2)
……
jm2(40s-18-54)的方式进行编号，随后进行下一步酯化能力筛选实验。
[0107]
表9第二次诱变筛选致死率结果。
[0108]
菌诱变后致死率为90-95％的菌落形态图如图9所示。
[0109]
(3)第二次诱变酵母菌酯化酶能力筛选
[0110]
菌株jm2(40s-18)第二次诱变总共挑选54株诱变菌株进行平板初筛。以具有透明圈作为阳性指标，菌株jm2(40s-18)的正突变率为33.3％。正突变菌株的酯酶透明圈直径比值如表10所示。其中诱变菌株jm2(40s-18-46、40s-18-45、40s-18-43)的直径比大于原始菌株。因此挑选jm2(40s-18-46)进行液态模拟发酵实验。
[0111]
表10第二次诱变后jm2部分产酯化酶能力结果。
[0112]
(4)第二次诱变酵母菌液体发酵挥发性物质检测。
[0113]
第二次诱变后菌株发酵酯化检测结果如表11所示。两次诱变后筛选出的菌株以己酸为底物后发酵产己酸乙酯含量与原始菌株以己酸为底物发酵产己酸乙酯的相对含量对比图如图10所示。菌株jm2(40s-18-46)以己酸为底物发酵后己酸乙酯的平均相对含量为11.06mg/l，较第一次诱变后加入己酸进行发酵产生的己酸乙酯含量增加了15.81％。与原始菌株相比，经过两次诱变，以己酸为底物，菌株jm1的己酸乙酯的生成量增加了30.81％；菌株jm2的己酸乙酯的生成量增加了203.01％。同时经过第二次诱变后，菌株jm2(40s-18-46)酒醅糖化液发酵产乙酸乙酯的含量为3.54mg/l，与野生菌株jm2(39.60mg/l)相比，降低
了91.1％；当以己酸为底物时，诱变菌株jm2(40s-18-46)发酵产乙酸乙酯含量为0.11mg/l，比野生菌株jm2(19.32mg/l)相比，降低了99.4％。
[0114]
表11二次诱变后酵母菌株jm2以己酸为底物液态发酵酯化检测结果。
[0115]
注：nd为“未检测到”。
[0116]
需要说明的是，以上所述的实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对本发明作出的一些非本质的改进和调整仍属于本发明的保护范围。

技术特征：
1.一株具有增己降乙特性的诱变菌株，所述增己降乙是指增加己酸乙酯含量且降低乙酸乙酯含量；所述诱变菌株为热带假丝酵母菌株jm2（40 s-18-46），分类命名为candida tropicalis，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为中国北京市，保藏编号为cgmcc no.27834，保藏日期为2023年07月07日。2.一种微生物菌剂，包含权利要求1所述的诱变菌株。3.根据权利要求1所述的诱变菌株或权利要求2所述的微生物菌剂在酿酒中的应用。4.一种提高浓香型白酒中己酸乙酯含量的方法，其特征在于：采用权利要求1所述的诱变菌株，以己酸为底物进行酯化发酵。

技术总结
本发明提供一株具有增己降乙特性的热带假丝酵母诱变菌株及其用途，属于生物工程技术领域。本发明从宋河浓香型白酒酒醅中筛选出一株产酯性能较好的热带假丝酵母JM2菌株，利用ARTP诱变技术，结合GC-MS对诱变菌株挥发性代谢物质进行分析，筛选获得高产己酸乙酯且能够降低乙酸乙酯生成的假丝酵母菌株JM2（40 s-18-46），为浓香型白酒“增己降乙”提供宝贵菌种资源。资源。资源。


技术研发人员：刘冰冰 王来友 赵容基 程爽 郭书贤 张雪 严依婷 杜美金 徐述红 周美薇 赵栩 刘正宇
受保护的技术使用者：南阳理工学院
技术研发日：2023.07.31
技术公布日：2023/10/5