一种长链非编码RNAPGM5-AS1及检测方法和应用与流程

一种长链非编码rna pgm5-as1及检测方法和应用
技术领域
1.本发明属于分子生物学技术领域，尤其是一种长链非编码rna pgm5-as1(lncrna pgm5-as1)及检测方法和用于膀胱癌诊断分子标志物的用途。


背景技术：

2.膀胱癌，也称为泌尿系统肿瘤，是全球第九大常见癌症，且发病率呈稳步上升趋势。90％的膀胱癌症病例据报道是由膀胱中的尿路上皮细胞失控增殖引起的。虽然当前在膀胱癌预防、早期诊断和治疗方面有许多突破，但全世界膀胱癌症死亡率仍在全球癌症死亡中占极大比例。因此，确定尽早发现膀胱癌风险因素并识别预防和诊断显得极为迫切。另外，目前临床上，膀胱癌的检测仍缺乏高灵敏度和高特异性的早期诊断指标。
3.据报道，长度超过200个核苷酸的长非编码rna(lncrna)参与了多种癌症的进展，尽管它们不能编码蛋白质，lncrnas可以通过剪接调控、表观遗传沉默或海绵状mirnas来调节基因表达。在膀胱癌中发现lncrna snhg18可抑制膀胱癌细胞的生长和侵袭，并与膀胱癌的不良预后密切相关。hu等人证明lncrna lnpps在膀胱癌中下调并通过pdcd5/p53依赖的信号通路调节细胞凋亡。lncrnapgm5-as1(pgm5反义rna 1)是lncrna家族的一员，已被证明是多种癌症的肿瘤促进剂，如膀胱、宫颈和乳腺癌症。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于克服现有技术中的不足之处，提供一种长链非编码rna pgm5-as1及检测方法和用于膀胱癌诊断分子标志物的用途。
5.本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
6.一种长链非编码rna pgm5-as1，所述长链非编码rna pgm5-as1的核酸序列如seq id no.1所示，该长链非编码rna pgm5-as1为膀胱癌相关差异表达基因，且能够作为膀胱癌诊断标志物。
7.进一步地，所述长链非编码rna pgm5-as1在膀胱癌中与在健康组织中的表达水平差异在20倍以上，p《0.0001。
8.如上所述的长链非编码rna pgm5-as1在作为和/或制备膀胱癌诊断标志物中的应用。
9.一种检测膀胱癌组织中如上所述的长链非编码rna pgm5-as1表达水平的检测方法，所述检测方法为荧光定量聚合酶链式反应qrt-pcr，该检测方法所需材料包括：
10.1)用于扩增lncrna pgm5-as1的特异性引物对；
11.2)标准dna模板；
12.3)pcr反应液。
13.lncrna pgm5-as1的检测方法为荧光定量pcr法。
14.进一步地，所述扩增lncrna pgm5-as1的特异性引物对包括上游引物和下游引物，其
15.中上游引物序列为seq id no.2(5
′‑
gactatgttgtgagcctgcg-3
′
)，下游引物序列为seq id no.3(5
′‑
aaaaggggaggggcaataca-3
′
)。
16.进一步地，所述荧光定量聚合酶链式反应qrt-pcr的荧光定量体系为20μl：
[0017]2×
sybr green mix 10μl，上游引物0.5μl，下游引物0.5μl，cdna 2μl，ddh 2o 7μl；pcr循环为：50℃2min，95℃2min，95℃30sec，58℃30sec，72℃30sec，循环数为40。
[0018]
一种膀胱癌组织中如上所述的长链非编码rna pgm5-as1表达水平的检测试剂盒，所述检测试剂盒包括：
[0019]
1)用于扩增lncrna pgm5-as1的特异性引物对；
[0020]
2)标准dna模板；
[0021]
3)pcr反应液。
[0022]
进一步地，所述扩增lncrna pgm5-as1的特异性引物对包括上游引物和下游引物，其
[0023]
中上游引物序列为seq id no.2(5
′‑
gactatgttgtgagcctgcg-3
′
)，下游引物序列为seq id no.3(5
′‑
aaaaggggaggggcaataca-3
′
)。
[0024]
进一步地，所述检测试剂盒包括：
[0025]2×
sybr green mix 10μl，上游引物0.5μl，下游引物0.5μl，cdna2μl，ddh2o补足到20μl；pcr循环为：50℃2min，95℃2min，95℃30sec，58℃30sec，72℃30sec，循环数为40。
[0026]
本发明取得的优点和积极效果为：
[0027]
1、本发明长链非编码rna pgm5-as1可用作膀胱癌诊断分子标记物，达到膀胱癌早诊断、早治疗的用途。长链非编码rna调控机制是肿瘤发病机理研究中的一个新领域，lncrna pgm5-as1在膀胱癌组织和健康组织中均有表达，且在癌组织中的表达水平均显著低于健康组织，差异具有统计学意义，提示lncrna pgm5-as1作为膀胱癌诊断分子标志物的可行性及临床应用价值。lncrnapgm5-as1在膀胱癌中的检测结果如下：膀胱癌中，差异在20倍以上，p《0.0001。
[0028]
2、本发明针对目前临床上，膀胱癌的检测仍缺乏高灵敏度和高特异性的早期诊断指标，由此提供了lncrna pgm5-as1用于作为膀胱癌诊断标志物的用途。前期研究中，专利申请人采用全基因组表达谱芯片筛选技术发现了大量的膀胱癌相关差异表达基因，经pcr方法检测发现，与癌旁组织比较，所有膀胱癌组织中lncrna pgm5-as1表达水平显著增高。
[0029]
3、本发明运用pcr法进行lncrnapgm5-as1不需要增加其他的试剂，通用市面上常用的试剂盒，可直接用于pcr实验室检测，可有效地降低使用成本。
附图说明
[0030]
图1为本发明中长链非编码rna pgm5-as1在膀胱癌组织及健康人组织中的表达水平比较图。
具体实施方式
[0031]
下面结合实施例，对本发明进一步说明，下属实施例是叙述性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。
[0032]
具体实施例中所涉及的各种实验操作，均为本领域的常规技术，本文中没有特别
no.3(5
′‑
aaaaggggaggggcaataca-3
′
)。
[0060]
较优地，所述检测试剂盒包括：
[0061]2×
sybr green mix 10μl，上游引物0.5μl，下游引物0.5μl，cdna2μl，ddh2o补足到20μl；pcr循环为：50℃2min，95℃2min，95℃30sec，58℃30sec，72℃30sec，循环数为40。
[0062]
应用实施例：
[0063]
1、样品来源：
[0064]
收集2021年1月至2022年12月在潍坊医学院附属医院体检健康人尿液与确诊膀胱癌患者尿液。病人术前均未接受放化疗及生物治疗。所有标本常规取材，尿液用无菌管收集，2-8℃条件离心20分钟左右(2000-3000转/分)。去除上清保留沉淀，-80℃冰箱保存备用。
[0065]
2、rna提取及逆转录：
[0066]
trizol法分别提取膀胱癌上皮细胞及健康人上皮细胞的总rna。
[0067]
3、荧光定量pcr：
[0068]
通过荧光定量pcr方法检测组织中lncrnapgm5-as1的表达水平。利用全式金greenone-stepqrt-pcrsupermix试剂盒进行rna的荧光定量pcr。pcr引物由生工生物工程(上海)股份有限公司设计并合成，荧光定量pcr引物序列如下所示。
[0069]
引物名称引物序列(5
’‑3’
)
[0070]
gapdh-f：tgacttcaacagcagcaccca
[0071]
gapdh-r：caccctgttgctgtagccaaa
[0072]
pgm5-as1-f：gactatgttgtgagcctgcg
[0073]
pgm5-as1-r：aaaaggggaggggcaataca。
[0074]
荧光定量体系为20μl：
[0075]2×
sybrgreenmix10μl，fprimer0.5μl，rprimer0.5μl，cdna2μl，ddh2o7μl。pcr循环为：50℃2min，95℃2min，95℃30sec，58℃30sec，72℃30sec，循环数为40。
[0076]
荧光定量pcr相对定量内参基因为gapdh。如图1所示，以2-δct表示癌组织和癌旁组织中lncrnapgm5-as1的表达量，膀胱癌与癌旁组织中lncrnapgm5-as1的表达水平差异分析采用配对t检验。pgm5-as1在膀胱癌组织与相应癌旁组织中表达水平的差异如表1所示。
[0077]
表1lncrnapgm5-as1在膀胱癌及健康上皮组织中的表达水平差异
[0078][0079]
综上，通过qrt-pcr检测，发现在膀胱癌中，lncrnapgm5-as1在癌组织的表达水平均显著低于健康组织，提示pgm5-as1作为膀胱癌诊断分子标志物的可行性及临床应用价值。
[0080]
另外，现有技术中中国发明专利申请：申请号为202111285552.8，公开号为cn114045338a，发明名称为：olc1基因表达水平在膀胱癌预后评估中的应用，该发明专利申请通过应用real-timepcr在膀胱尿路上皮癌肿瘤组织和膀胱正常黏膜中检测olc1基因的表达水平以及吸烟史及病理分期来进行预后评估，无法实现肿瘤早筛的效果。
[0081]
中国发明专利申请：申请号为202010688356.4，公开号为cn113943799a，发明名称为：用于检测膀胱癌的组合物及其试剂盒和应用，该发明专利申请通过多重pcr扩增技术扩增经亚硫酸氢盐修饰的待测dna样品，根据pcr扩增结果来确定待测样品中目标基因的甲基化情况，进而实现对膀胱癌早期筛查的判断，该操作步骤多，需要先进行亚硫酸盐修饰再进行多重pcr，与本发明专利申请的方法相比，所需时间及成本较高。
[0082]
尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例所公开的内容。

技术特征：
1.一种长链非编码rna pgm5-as1，其特征在于：所述长链非编码rna pgm5-as1的核酸序列如seq id no.1所示，该长链非编码rna pgm5-as1为膀胱癌相关差异表达基因，且能够作为膀胱癌诊断标志物。2.根据权利要求1或2所述的长链非编码rna pgm5-as1，其特征在于：所述长链非编码rna pgm5-as1在膀胱癌中与在健康组织中的表达水平差异在20倍以上，p<0.0001。3.如权利要求1所述的长链非编码rna pgm5-as1在作为和/或制备膀胱癌诊断标志物中的应用。4.一种检测膀胱癌组织中如权利要求1或2所述的长链非编码rna pgm5-as1表达水平的检测方法，其特征在于：所述检测方法为荧光定量聚合酶链式反应qrt-pcr，该检测方法所需材料包括：1)用于扩增lncrna pgm5-as1的特异性引物对；2)标准dna模板；3)pcr反应液；lncrna pgm5-as1的检测方法为荧光定量pcr法。5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于：所述扩增lncrna pgm5-as1的特异性引物对包括上游引物和下游引物，其中上游引物序列为seq id no.2，下游引物序列为seq id no.3。6.根据权利要求4或5所述的检测方法，其特征在于：所述荧光定量聚合酶链式反应qrt-pcr的荧光定量体系为20μl：2
×
sybr green mix 10μl，上游引物0.5μl，下游引物0.5μl，cdna 2μl，ddh 2o 7μl；pcr循环为：50℃2min，95℃2min，95℃30sec，58℃30sec，72℃30sec，循环数为40。7.一种膀胱癌组织中如权利要求1或2所述的长链非编码rna pgm5-as1表达水平的检测试剂盒，其特征在于：所述检测试剂盒包括：1)用于扩增lncrna pgm5-as1的特异性引物对；2)标准dna模板；3)pcr反应液。8.根据权利要求7所述的检测试剂盒，其特征在于：所述扩增lncrna pgm5-as1的特异性引物对包括上游引物和下游引物，其中上游引物序列为seq id no.2，下游引物序列为seq id no.3。9.根据权利要求7或8所述的检测试剂盒，其特征在于：所述检测试剂盒包括：2
×
sybr green mix 10μl，上游引物0.5μl，下游引物0.5μl，cdna 2μl，ddh2o补足到20μl；pcr循环为：50℃2min，95℃2min，95℃30sec，58℃30sec，72℃30sec，循环数为40。

技术总结
本发明属于分子生物学技术领域，公开了一种长链非编码RNAPGM5-AS1(LncRNAPGM5-AS1)及检测方法和用于膀胱癌诊断分子标志物的用途，所述长链非编码RNAPGM5-AS1的核酸序列如SEQ ID No.1所示，该长链非编码RNAPGM5-AS1为膀胱癌相关差异表达基因，且能够作为膀胱癌诊断标志物。本发明长链非编码RNAPGM5-AS1可用作膀胱癌诊断分子标记物，达到膀胱癌早诊断、早治疗的用途。疗的用途。疗的用途。


技术研发人员：胡良昌 贾正虎 武晓丽 马骏 孙倩
受保护的技术使用者：天津尤金生物科技有限公司
技术研发日：2023.08.11
技术公布日：2023/10/5