一种油莎豆组织培养再生体系的方法

1.本发明涉及植物组织培养技术领域，特别是涉及一种油莎豆组织培养再生体系的方法。


背景技术：

2.油莎豆(cyperus esculentus l.)为莎草属多年生植物，是目前已知的唯一块茎可以榨油的新型油料作物，具有分蘖性强、繁殖力高、易存活等优点(吴琼,2009；郭婷婷等,2021；akabassi et al.,2022)。作为重要的新型油料作物，油莎豆同时也是优质的植物油脂替代资源，其一般不开花或开花不结实，繁殖方式有种子、匍匐根茎和块茎这三种类型，主要以块茎繁殖。然而，油莎豆种质匮乏，油莎豆块茎在地下容易积累毒素，随着时间的增长，会造成品种严重退化(王瑞元,2019；akabassi et al.,2022)，因此保护和增加油莎豆的种质资源与多样性非常重要。
3.油莎豆易种植，生物量大，且不与主要粮食作物争地，但其经过冬季贮藏后会进入休眠状态，且贮藏期间块茎往往容易失去活力或迅速腐烂，因此，在种植前打破其休眠对提高发芽率十分重要。种子休眠过程受到多种内源性遗传因素和环境因素的精确调控，休眠可使种子在逆境条件下避免受到伤害，但处于休眠状态的种子新陈代谢缓慢，不利于农业生产(zhang et al.,2022)。种子休眠的诱导、维持和解除是一个复杂的连续过程，受内源因素和环境因素调控，打破种子休眠的方法包括物理、化学及生物等多种方法，其中，植物激素在打破种子休眠方面具有重要意义(杨文秀等,2008)。细胞分裂素(ck)、赤霉素(ga3)、萘乙酸(naa)和6-ba等植物激素能有效解除植物种子的休眠。杨映根等(2001)研究发现，通过施用外源植物激素ga3和6-ba，对打破种子的休眠具有促进作用；在七叶一枝花种子萌发的研究中也表明，利用6-ba和ga3这两种激素处理种子有利于其萌发(翁琳琳等,2021)。
4.传统育种技术培育杂交新品种往往需要花费较长的时间和精力，而分子育种能对作物产量、品质、抗性以及育性等方面进行改良并创造出理想的种质资源，比传统育种技术更高效(杨迎霞等,2022)。组织培养技术是分子育种重要的一环，已用于植物的脱毒、快繁、品种选育、基因工程、遗传研究等多个方面，其中，成熟的再生体系系统能为遗传转化提供良好的实验基础(bevitori et al.,2014；gao et al.,2022；许丁帆等,2022)。瞿萍梅等(2007)以块茎为外植体，建立了油莎豆的快繁及组织培养体系，吴琼(2009)将油莎豆丛生芽茎基部接种于ms+3.0mg/l2,4-d+1.0mg/l kt+0.5mg/l 6-ba+0.5mg/l naa+600-800mg/l ch+3％蔗糖+0.7琼脂(ph 5.8)成功诱导出愈伤组织，李佳婷等(2019)发现油莎豆丛生芽可以在不含植物生长调节剂的空白ms培养基上生根。目前均存在高效再生体系不够完善、外植体易污染褐化、块茎发芽率低及难以获得无菌苗等问题，因此，油莎豆组织培养体系亟需进一步改进和完善。外植体的选择对建立高效组培再生体系也十分重要，因为其生长状态和来源会影响体胚的生成，从而影响胚性愈伤组织的诱导率。除此之外，胚性愈伤组织的诱导与基因型、所用外植体类型、碳氮源和培养基中的植物生长调节剂等因素有关(shahsavari et al.,2010)，在水稻的组织培养中发现色氨酸、山梨醇、激动素(kin)、苄基
氨基嘌呤(bap)、萘乙酸(naa)等植物生长调节剂与噻苯隆(tdz)搭配使用有利于水稻胚性愈伤组织的形成和再生(feng et al.,2011；din et al.,2016)。2,4-d是水稻(bevitori et al.,2014)、地胆草(abraham and thomas.,2015)、麻竹(ye et al.,2017)等植物愈伤组织诱导常用的植物生长调节剂，在愈伤组织的诱导和分化过程都起到十分重要的作用(李玉静等,2005)。前述的油莎豆组织培养研究均以丛生芽基部为外植体诱导愈伤组织，认为根系不能诱导出愈伤组织，目前也尚未有采用油莎豆根系成功诱导出愈伤组织的相关报道。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种油莎豆组织培养再生体系的方法，以解决上述现有技术存在的问题，本发明以丛生芽不定根的根尖为外植体，接种在愈伤诱导培养基中，成功诱导出愈伤组织，该方法丰富了油莎豆愈伤组织培养方案和外植体选择，为油莎豆大规模繁殖和分子研究提供技术支持。
6.为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
7.本发明提供一种油莎豆组织培养再生体系的方法，包括以下步骤：
8.将油莎豆块茎置于含有6-ba的萌发皿中诱导培养，获得幼芽，将幼芽移植到芽增殖培养基进行增殖继代培养，获得丛生芽；
9.将丛生芽接种至不定根诱导培养基进行不定根诱导培养，获得根系，以根系为诱导愈伤组织的外植体，在愈伤组织诱导培养基中进行培养；
10.所述芽增殖培养基包括：ms+0.5-1.0mg/l 6-ba+0.5-1.5mg/lzt+300-500mg/l头孢霉素+4-6g/lpvp+30-50g/l蔗糖+2-6g/l琼脂；
11.所述不定根诱导培养基包括：ms+30-50g/l蔗糖+2-6g/l琼脂；
12.所述愈伤组织诱导培养基包括：ms+3-5mg/l 2,4-d+0.5-2mg/lnaa+0.25-0.65％w/v卡拉胶+30-50g/l蔗糖+2-4g/lpvp+300-600mg/lvc+300-500mg/l酸水解酪蛋白。
13.进一步地，所述愈伤组织诱导培养基包括：ms+3mg/l 2,4-d+0.5mg/lnaa+0.65％w/v卡拉胶+30g/l蔗糖+4g/lpvp+600mg/lvc+500mg/l酸水解酪蛋白；在所述愈伤组织诱导培养基中进行培养的条件包括：25℃温度下暗培养。
14.进一步地，所述芽增殖培养基包括：ms+1.0mg/l 6-ba+0.5mg/lzt+500mg/l头孢霉素+4g/l pvp+30g/l蔗糖+6g/l琼脂；所述不定根诱导培养基包括：ms+30g/l蔗糖+6g/l琼脂；
15.所述增殖继代培养和所述不定根诱导培养的条件均包括：25℃、光照强度为5000lx和光周期为昼/夜各12h。
16.进一步地，所述萌发皿中6-ba的浓度为1.5mg/l。
17.进一步地，将幼芽移植到芽增殖培养基进行增殖继代培养之前，还包括幼芽消毒的步骤。
18.进一步地，所述幼芽采用75％v/v酒精消毒30s，0.1％v/v升汞浸泡3min的消毒处理。
19.进一步地，以根系中粗壮、白色的根尖为诱导愈伤组织的外植体。
20.本发明公开了以下技术效果：
21.本发明用不同浓度水平的6-ba对油莎豆块茎进行芽萌发诱导，并通过消毒幼苗的方式来获得无菌苗，结果表明，块茎在含1.5mg/l 6-ba的萌发皿中萌发率最高，萌发率为61.67％；单芽在含有1.0mg/l 6-ba+0.5mg/l zt的ms芽增殖培养基中培养，芽增殖系数为2.65。丛生芽在低浓度的zt或iaa培养基中均可诱导出不定根，且在不含植物激素的ms培养基中，不定根更容易被诱导。本发明以丛生芽不定根的根尖为外植体，接种在愈伤诱导培养基中(ms+3mg/l 2,4-d+0.5mg/l naa+0.65％卡拉胶+30g/l蔗糖+4g/l pvp+600mg/lvc+500mg/l ch)，成功诱导出愈伤组织。
22.本发明丰富了油莎豆愈伤组织培养方案和外植体选择，为油莎豆大规模繁殖和分子研究提供技术支持。
附图说明
23.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
24.图1为消毒后接种的幼芽；
25.图2为继代2个月后的无菌苗；
26.图3为不同不定根诱导培养基(表1)中油莎豆的生根状况；a：a组培养基；b：b组培养基；c：c组培养基；
27.图4为不同愈伤诱导培养基(表2)中根尖诱导的愈伤组织状况；；a：a组培养基；b：b组培养基；c、d分别为f组培养基下的2种愈伤组织形态。
具体实施方式
28.现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
29.应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
30.除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
31.在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
32.关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即
意指包含但不限于。
33.实施例1
34.1材料与方法
35.1.1植物材料
36.本实施例用到的油莎豆块茎为圆粒型油莎豆，品种为“中油莎1号”，由广东石油化工学院提供。
37.1.2油莎豆块茎芽萌发诱导与增殖
38.挑选饱满、无虫眼黑点、大小均一的圆粒油莎豆块茎，将块茎表面土、鳞片、根系冲刷干净，再将块茎置于锥形瓶中于摇床30℃、200rpm振荡浸泡两天。吸胀的油莎豆用75％酒精消毒90s，无菌水冲洗三遍；0.1％升汞浸泡10min，再用含有效氯10％的次氯酸钠消毒30min，无菌水冲洗4～5次，将消毒完的块茎在无菌滤纸上风干，切开块茎，分别在含有6-ba浓度为0mg/l、0.5mg/l、1.0mg/l、1.5mg/l、2.0mg/l、2.5mg/l的一次性塑料萌发皿中诱导培养，每个浓度水平接种60个外植体，三次重复，五天后统计块茎发芽势，发芽势(ge，％)＝规定天数内发芽块茎数/供试块茎数
×
100％；十天后统计发芽率，发芽率(gp，％)＝发芽块茎数量/供试块茎数量
×
100％，用excel与spss26进行数据处理。
39.将诱导的幼芽经过一周培养，经过75％酒精消毒30s，0.1％升汞浸泡3min后移植到ms+1.0mg/l 6-ba+0.5mg/l zt+500mg/l cef(头孢霉素)+4g/l pvp+30g/l蔗糖+6g/l琼脂(ph 5.8)的芽增殖培养基中进行单芽增殖培养，10d后统计20个单芽的增殖率及增殖系数，获得的增殖苗用于后续实验及继代培养，培养条件为25℃、5000lx光照强度、光周期为昼/夜12h。
40.1.3丛生芽不定根诱导
41.将增殖获得的丛生芽接种在以下不同不定根诱导培养基上(表1，a、b、c三组培养基均额外添加了30g/l蔗糖和6g/l琼脂，ph 5.8)中进行不定根诱导，10～30d后测定生根率，培养条件为25℃，5000lx光照强度，光周期为昼/夜12h。
42.表1不定根诱导培养基
[0043][0044]
1.4愈伤组织诱导
[0045]
以粗壮、白色的根尖为诱导愈伤组织的外植体，将根部幼嫩的根尖部分切成长0.5mm大小，在培养基中(表2)诱导培养，所用的培养基均加有30g/l蔗糖、500mg/l酸水解酪蛋白(ch)、600mg/l抗坏血酸(vc)、4g/lpvp；ph值5.8。每组培养基分别接种48个外植体，两周后统计诱导率，培养条件为25℃、暗培养。
[0046]
表2愈伤组织诱导培养基
[0047][0048]
2结果分析
[0049]
2.1芽萌发诱导与无菌苗获取
[0050]
6-ba能有效促进芽的萌发，浓度为1.5mg/l时，芽萌发率最高(61.67％)，块茎的发芽势及萌发率统计(表3)。结果显示，6-ba浓度为0和2.0mg/l时，发芽势最高，为15.00％(第5天)。6-ba浓度为1.5mg/l时萌发率(第10天)最高，为61.67％。6-ba浓度不同对块茎的发芽势影响不显著，但对块茎的发芽率有较大影响，6-ba浓度分别为0.5mg/l、1.0mg/l、1.5mg/l时，d组与b组、c组的发芽率差异显著。
[0051]
表3不同6-ba浓度水平对油莎豆块茎萌发的影响
[0052][0053]
将萌发的幼芽消毒后转移到芽增殖培养基中培养(图1)，单芽经过10d增殖培养，20个单芽都产生了不同个数的分蘖，平均增殖系数为2.65，然后挑选绿色健壮的四周龄增殖苗用于继代培养，继代培养2个月左右即可获得长满瓶的无菌苗(图2)。
[0054]
2.2不定根诱导
[0055]
增殖获得的丛生芽在含有低浓度zt或是iaa的培养基中经过较长时间的培养均可诱导出不定根，但其在不含植物激素的ms培养基中，不定根更容易被诱导。经记录观察发现，丛生芽在a组培养基中需要20～25d，才能诱导出不定根，根系生长良好，生根数多，但是发根时间较长(图3中a)，生根率为40％。无根苗在b组中，生根数多，但根系较短，所需时间大概25d(图3中b)，生根率为35％。c组7d左右即可长出根系，10d左右能观察到较长的根(图3中c)，30d后生根率达到100％。
[0056]
2.3植物生长调节剂水平对愈伤组织诱导的影响
[0057]
将根尖置于含有2,4-d的培养基中诱导培养能够诱导出膨大呈水珠状或两端膨胀，晶莹的愈伤组织。根尖经过两周时间的诱导，在体式显微镜下，可看到外植体在a、b培养基都能诱导出外植体一端或中间肿胀、膨大呈水珠状的愈伤组织(图4中a，b)，外植体一端或两端发黑、甚至整个外植体发黑，愈伤组织诱导率a组为18.75％，b组为75％(表4)。外植体在c、d、e组培养基中不能被诱导且外植体从第2天就开始发黑，一周后坏死。根尖在f组培养基中诱导出膨大显著、呈晶莹透亮的软质愈伤组织(图4中c，d)，诱导率为47.92％(表4)。经对比，ms+3mg/l 2,4-d+0.5mg/lnaa+0.65％卡拉胶+30g/l蔗糖+4g/lpvp+600mg/lvc+500mg/l ch的培养基比较适合用于根尖诱导愈伤组织。
[0058]
表4根尖愈伤组织诱导率
[0059][0060][0061]
3结论
[0062]
虽然油莎豆因其产量高、投入低、适应性广、产油量大等综合利用价值而愈发受到重视，但诸多生理和分子机制仍不清楚，种质资源匮乏，为此分子层次的研究势在必行。目前，油莎豆已经建立了快速繁殖体系和再生体系，体外繁殖已不成问题，但块茎休眠、陈年块茎发芽率低，组织培养外植体选择少，块茎含杂质多、毒素积累导致组织培养过程中，污染率高，胚性愈伤组织诱导率低等难题仍未解决，因此油莎豆组织培养研究还需丰富和深入。在本研究中，发现6-ba能有效解除油莎豆块茎休眠、促进芽萌发，可以为油莎豆育苗、种植、快速繁殖提供技术支持，有利其推广与应用。建立了先诱导芽萌发，再消毒以获得无菌苗的方法，减少芽萌发所需时间及污染。此外，本发明使用了不同的植物生长调节剂搭配，运用不同配方对油莎豆进行了丛生芽增殖、不定根诱导、愈伤组织诱导，丰富了油莎豆组织培养的方案和外植体选择，可为油莎豆高效再生体系后续研究提供技术支持。花粉、叶片、根、胚乳、种子等是常用于植物组织培养的外植体，不同外植体对激素的敏感性不一样，低浓度的细胞分裂素刺激器官发生过程，6-ba能够促进打破种子休眠，其能促进油莎豆块茎萌发芽。油莎豆是重要的油料作物，具有一定的耐旱性和耐盐碱性，能够在沙质地种植，其块茎经过冬季贮藏后会进入休眠状态，萌发较慢，因此在种植前需要打破其休眠。在本研究中，6-ba在油莎豆块茎芽萌发诱导中起重要作用，切开的块茎在含有1.5mg/l 6-ba的萌发皿中发芽率最高且3d左右就可诱导块茎发芽，发芽率为61.67％，打破陈年油莎豆块茎发芽慢、萌发率低的难题，这项研究可用于油莎豆快繁和种植。将油莎豆无菌苗转移到不定根诱导培养基中25d左右，在不含激素或含有低浓度激素的培养基中都能诱导出不定根，其中在不含激素的ms空白培养基上培养10天左右就能诱导生根，30d后甚至达到100％，说明油莎
豆易于生根，无论在体内还是体外都具有良好的生根能力。
[0063]
关于油莎豆愈伤组织诱导研究及相关资料较少，且研究均以茎基部为诱导愈伤组织的外植体且能够成功诱导出愈伤组织，表明根尖为诱导不能诱导出愈伤组织。油莎豆富含碳水化合物、膳食纤维、脂类和油酸，在组织培养的过程中，外植体和愈伤组织容易氧化变黑，腐烂甚至坏死，在以往油莎豆组织培养的研究中都存在这些问题，其原因可能是由于酚类物质氧化导致有毒物质积累造成的。在本发明实验中，以根尖为外植体成功诱导出了愈伤组织，其中的关键植物生长调节剂是2,4-d。在本发明研究结果中发现2,4-d是诱导油莎豆愈伤组织的关键。在此次研究中还发现，愈伤诱导培养基中无2,4-d或2,4-d浓度小于3.0mg/l时，外植体更容易氧化成棕褐色甚至坏死，无法诱导出愈伤组织。本发明研究结果表明最佳的诱导油莎豆芽萌发的6-ba浓度为1.5mg/l，芽诱导之后消毒并转移到ms+1.0mg/l 6-ba+0.5mg/l zt+500mg/l cef+4g/l pvp+30g/l蔗糖+6g/l琼脂(ph 5.8)进行丛生芽增殖，以获得大量的无菌苗。最佳的不定根诱导培养基为ms+30g/l蔗糖+6g/l琼脂(ph 5.8)，愈伤组织诱导培养基为ms+3mg/l 2,4-d+0.5mg/l naa+0.65％卡拉胶+30g/l蔗糖+4g/l pvp+600mg/lvc+500mg/l ch。
[0064]
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

技术特征：
1.一种油莎豆组织培养再生体系的方法，其特征在于，包括以下步骤：将油莎豆块茎置于含有6-ba的萌发皿中诱导培养，获得幼芽，将幼芽移植到芽增殖培养基进行增殖继代培养，获得丛生芽；将丛生芽接种至不定根诱导培养基进行不定根诱导培养，获得根系，以根系为诱导愈伤组织的外植体，在愈伤组织诱导培养基中进行培养；所述芽增殖培养基包括：ms+0.5-1.0mg/l 6-ba+0.5-1.5mg/lzt+300-500mg/l头孢霉素+4-6g/lpvp+30-50g/l蔗糖+2-6g/l琼脂；所述不定根诱导培养基包括：ms+30-50g/l蔗糖+2-6g/l琼脂；所述愈伤组织诱导培养基包括：ms+3-5mg/l 2,4-d+0.5-2mg/lnaa+0.25-0.65％w/v卡拉胶+30-50g/l蔗糖+2-4g/lpvp+300-600mg/lvc+300-500mg/l酸水解酪蛋白。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述愈伤组织诱导培养基包括：ms+3mg/l2,4-d+0.5mg/lnaa+0.65％w/v卡拉胶+30g/l蔗糖+4g/l pvp+600mg/lvc+500mg/l酸水解酪蛋白；在所述愈伤组织诱导培养基中进行培养的条件包括：25℃温度下暗培养。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述芽增殖培养基包括：ms+1.0mg/l6-ba+0.5mg/lzt+500mg/l头孢霉素+4g/l pvp+30g/l蔗糖+6g/l琼脂；所述不定根诱导培养基包括：ms+30g/l蔗糖+6g/l琼脂；所述增殖继代培养和所述不定根诱导培养的条件均包括：25℃、光照强度为5000lx和光周期为昼/夜各12h。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述萌发皿中6-ba的浓度为1.5mg/l。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将幼芽移植到芽增殖培养基进行增殖继代培养之前，还包括幼芽消毒的步骤。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述幼芽采用75％v/v酒精消毒30s，0.1％v/v升汞浸泡3min的消毒处理。7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，以根系中粗壮、白色的根尖为诱导愈伤组织的外植体。

技术总结
本发明公开了一种油莎豆组织培养再生体系的方法，属于植物组织培养技术领域，该方法包括：将油莎豆块茎置于含有6-BA的萌发皿中诱导培养，获得幼芽，将幼芽移植到芽增殖培养基进行增殖继代培养，获得丛生芽；将丛生芽接种至不定根诱导培养基进行不定根诱导培养，获得根系，以根系为诱导愈伤组织的外植体，在愈伤组织诱导培养基中进行培养。本发明发现块茎在含1.5mg/L 6-BA的萌发皿中萌发率最高，单芽在含有6-BA和ZT的MS芽增殖培养基中培养，芽增殖系数高，丛生芽在不含植物激素的MS培养基中，不定根更容易被诱导，本发明以丛生芽不定根的根尖为外植体成功诱导出愈伤组织，为油莎豆大规模繁殖和分子研究提供技术支持。规模繁殖和分子研究提供技术支持。规模繁殖和分子研究提供技术支持。


技术研发人员：赵永国 陆光远 余珠 林泳欣 谢威 许美花 张佳丽
受保护的技术使用者：广东石油化工学院
技术研发日：2023.08.18
技术公布日：2023/10/5