一种大熊猫TSHβ单克隆抗体及其杂交瘤细胞株和应用的制作方法

一种大熊猫tsh
β
单克隆抗体及其杂交瘤细胞株和应用
技术领域
1.本发明属于生物免疫学技术领域，具体公开了一种大熊猫tshβ单克隆抗体及其杂交瘤细胞株和应用。


背景技术：

2.促甲状腺素（tsh）是垂体前叶分泌的一种糖蛋白激素，它由一个通用的糖蛋白亚基和一个特异的促甲状腺素β亚基非共价结合，形成二聚体分泌蛋白。tsh主要调控甲状腺的发育和甲状腺素的正常代谢，进而调控动物生长、发育、能量代谢以及繁殖等生命过程。人tshβ基因，它包含3个外显子，编码一个含138个氨基酸残基的前体蛋白，其氨基端含有20个氨基酸残基的信号序列shb主要在动物垂体组织表达，也有研究发现其在小肠、性腺表达。另外，人和小鼠tshβ均存在剪接体，新剪接体不仅表达于垂体，而且在外周血白细胞、甲状腺与骨髓等其他组织也有表达。由于种属差异的原因，目前没有特异的抗大熊猫tshβ亚基特异抗体，因此关于大熊猫tshβ亚基相关的表达研究尚未报道。


技术实现要素：

3.本发明的第一目的在于提供一种大熊猫tshβ单克隆抗体杂交瘤细胞株，其能够解决现目前无法获得大熊猫tshβ特异性抗体的技术问题。
4.本发明的第二目的在于提供一种大熊猫tshβ单克隆抗体，以解决现有技术中没有特异的抗大熊猫tshβ特异抗体的问题。
5.为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种大熊猫tshβ单克隆抗体，其重链可变区的氨基酸序列如seq id no.1所示，轻链可变区的氨基酸序列如seq id no.2所示。
6.进一步地，其亚型为igg1。
7.一种表达载体，包括上述大熊猫tshβ单克隆抗体。
8.一种分泌上述大熊猫tshβ单克隆抗体的杂交瘤细胞株tshb-a，该杂交瘤细胞株tshb-a的保藏号为cctcc no：c202282，于2022年3月27日保藏于中国武汉武汉大学中国典型培养物保藏中心。
9.上述大熊猫tshβ单克隆抗体在大熊猫促甲状腺素检测中的应用。
10.一种用于检测大熊猫tsh的试剂盒，包括上述大熊猫tshβ单克隆抗体。
11.进一步地，试剂盒为western blot检测用试剂盒。
12.与现有技术相比，本发明至少具有如下的优点与积极效果：本发明提供了一种大熊猫tshβ单克隆抗体及其杂交瘤细胞株，能够通过杂交瘤细胞株分泌得到大熊猫tshβ单克隆抗体，并且该抗体能准确识别目标蛋白tshβ亚基，为tsh蛋白的定位和组织表达信息、特异性配体、拮抗物、抗拮抗物的发现创造条件，此外，还可利用tsh高特异性的单克隆抗体对tsh受体的配体、拮抗物、抗拮抗物进行更进一步的深入研究。
附图说明
13.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
14.图1为本发明实施例1中细胞蛋白浓度的标准曲线图；图2为本发明实施例2中western-blot检测结果。
具体实施方式
15.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
16.需要说明的是，在不冲突的情况下，本技术中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考具体实施例来详细说明本发明。
17.实施例11. 抗大熊猫tshβ单克隆抗体的制备：1.1特异多肽片段的设计与合成：根据ncbi数据库大熊猫tshβ氨基酸序列，登录号：xp_002925358.1，序列为：mtaiylmsmlfglacgqvmsfcfpteytmhverkecaycltintticagycmtrdingklflpkyalsqdvctykdfmyktveipgcprhvtpyfsypvavscncgkcntdysdcihesiktnyctkpqksyavgfsi（seq id no.3），参考其它物种序列分析，设计了大熊猫tshβ特异序列(tshβ-1)：vscncgkcntdysdcihesiktnyctkpqks（seq id no.4），并通过人工合成，并与klh（匙空血蓝蛋白）偶联，作为生产特异性抗体的免疫原（tshβ-1-klh）。
18.对于多肽片段的合成，此工艺比较成熟，通过本技术公开的序列，生工生物工程（上海）股份有限公司即可生产出多肽片段tshβ-1以及免疫原tshβ-1-klh。
19.1.2抗原小鼠免疫用佐剂：抗原=1:1的混合液接种，(抗原量不够可与氯化钠混合后再与佐剂乳化)。首免用弗氏完全佐剂，后面免疫用弗氏不完全佐剂。免疫之前准备好灭菌的注射器、三通管、一次性注射器。先用灭菌好的注射器将抗原和nacl吸进注射器中（共400 μl，四只的量），再用灭菌好的注射器将佐剂吸入注射器中（共400 μl，四只的量）；最后将灭菌好的注射器连在三通管中进行乳化（乳化15分钟，至油包水状态即可），最后再将融合好的混合液转入一次性注射器中进行注射。
20.第1天：腹腔注射，200 μl一只。(抗原量为100 μg/只)第14天：腹腔注射，200 μl一只。（之后抗原都为50 μg/只）第21天：腹腔注射，200 μl一只。
21.第27天：腹腔注射，200 μl一只。
22.第三次免疫后3到4天可小鼠尾部采血，12000 rpm，8 min，取血清测定其效价，以tshβ-1，包被浓度为2 μg/ml作为抗原，elisa方法检测血清效价，效价达标后即可准备融合，效价不够高者需继续免疫直至达标。免疫血清效价如表1所示：
表1 免疫后血清效价以上结果表明小鼠达到免疫要求，可进行细胞融合实验。
23.1.3细胞融合1.3.1 骨髓瘤细胞（sp2）的复苏：先从液氮中取出冻存好的细胞，快速放于37℃水浴锅中融化，使细胞松散；再将细胞放入15 ml的离心管中，再取大概5 ml的pbs，混匀，1000 rpm、5 min，离心，弃上清，重复两次清洗sp2细胞，将细胞养在培养瓶中，做好标记，最后将培养瓶放入37℃、5% co2培养箱中培养。
24.1.3.2 sp2细胞的传代：当培养瓶中的细胞长满瓶底80%左右，就可进行细胞传代。用枪头将细胞吹打下来，将培养液吸出至15 ml离心管内1000 r/min，离心5分钟；弃上清，加pbs 5 ml，吹打混匀，再次离心弃上清，重复pbs洗涤步骤2次。洗涤完后加2 ml 10%完全培养液重悬细胞，取适量细胞至培养瓶中，放入二氧化碳培养箱中培养。
25.1.3.3滋养层巨噬细胞的制备（融合前一天可准备）：小鼠脱颈椎致死，注意断颈椎时尽量减少对腹腔的压迫，避免损伤腹腔内血管，以防饲养细胞内含有大量血细胞。将小鼠浸泡于75%酒精中5分钟，然后手提住小鼠尾巴，上下于酒精中涮洗数次。置于无菌平皿中。用无菌剪刀从后腹剪开皮肤，用手将两侧皮肤撕开，暴露腹部，注意不要损伤腹膜。用酒精棉球擦拭腹膜。用注射器吸取7 ml的含双抗的不完全培养基注射入腹腔（双抗:不完全培养液=1:100），注意注射时用镊子提起腹膜，避免针头刺到肠管等腹腔脏器。用棉球轻轻按摩腹部一分钟，吸出注入的培养液，转入离心管中。1000 r/min离心5 min，弃去上清。再用pbs洗涤四次。将细胞重悬于10%的完全培养液中。
26.将上述细胞悬液加入96孔板，每孔加100 μl，最后将96孔板放入co2的培养箱培养。（巨噬细胞不易过多，可视情况丢弃一部分收集到的细胞。）1.3.4免疫脾细胞制备：（1）取小鼠脾脏取达到免疫要求的小鼠。首先要注意无菌操作，以防细胞污染，处死小鼠后，将其在75%的酒精中浸泡五分钟左右，放在无菌的平皿中，摆放在利于自己操作的位置（超净台中），进行解剖。先用剪刀将小鼠尾部剪一个小口，再用手剖开皮毛层，用酒精棉球轻拭剖开
部位，再用镊子挑起包裹内脏的那层半透明的薄膜，将其剪开，暴露出脾脏，轻轻取出脾脏，并尽量去除上面的脂肪组织，将取出的脾脏至于pbs中洗涤。
27.（2）脾细胞悬液制备先用pbs洗涤脾脏，涮洗3次左右，将脾脏置于平皿中，用剪刀将脾脏尽可能的剪碎，加pbs洗涤过滤，不要组织细胞，收集分离的脾细胞悬液，1000 r/min，离心5分钟，弃上清；再用5 ml pbs洗涤，1000 r/min，离心5分钟；重复三次，洗涤完后加2 ml不完全培养液（dmem）重悬细胞，稀释细胞悬液100倍或1000倍用于细胞计数，剩余细胞置于37℃水浴锅中备用。
28.（3）sp2细胞悬液的制备：用胶头吸管将吸取细胞液吸气吹打培养瓶底部的薄膜（细胞均为悬浮或轻微贴壁生长），再将细胞液用加样枪转移至15 ml离心管内1000 r/min，离心5分钟；弃上清，再加pbs 5 ml，混匀，1000 r/min，离心5分钟，重复洗涤两次，洗涤完后加2 ml不完全培养液（dmem）重悬细胞，稀释细胞悬液100倍或1000倍用于细胞计数，剩余细胞置于37℃水浴锅中备用。
29.1.3.5 peg作用下进行细胞融合将sp2细胞悬液与脾细胞按1：4（1:10至1:4之间）的比例混合在一起，离心，600 rpm，3 min；弃上清。轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀略松动。1 min内缓慢加入37℃预热好的0.6 ml 50% peg溶液，边加边轻微摇动和叩击。加完后静置1 min。37℃预热好的不完全培养液10 ml以终止peg作用，边滴边叩击并旋转离心管，匀速加入，加完后静置2 min。离心，800 rpm，5 min，弃上清；再用pbs或不完全培养液洗涤2次，以去除peg。
30.洗涤完后弃上清，用10 ml hat选择培养液重悬细胞。上述细胞，加到已有饲养细胞层的96孔板内（用的是之前制备的巨噬细胞板，先将孔中的液体吸出不要，再用不完全培养液洗涤一次，吸出液体），每孔加100 μl；将培养板置co2培养箱中培养。4个小时之后再向孔中加入含hat的完全培养液（19.6 ml 10%完全培养液+0.4 ml hat），每孔加100 μl；将培养板置co2培养箱中培养。
31.1.3.6选择培养（1）融合培养的第四天半液法换hat培养液：用加样枪将96孔板中的上清液每孔吸取100 μl，弃掉，再加入新的每孔100 μl hat培养液（hat培养液配制为：10%的完全培养液：hat=1:50），每块板子需要在10 ml完全培养液中加入200 μl 50
×
hat。
32.（2）融合培养的第七天半液法换ht培养液：用加样枪将96孔板中的上清液每孔吸取100 μl，弃掉，再加入新的每孔100 μl ht培养液（ht培养液的配制为：10%的完全培养液：ht=1:50），每块板子需要在10 ml完全培养液中加入200 μl 50
×
ht。
33.1.3.7阳性克隆筛选在培养7天左右可见孔内明显的克隆细胞，待克隆细胞长得足够多时（大概在第12天左右），可吸取培养液检测其有无分泌抗体。
34.（1）先将之前包被好的相应的elisa(包被tshβ-1，包被浓度为2 μg/ml)板子从冰箱拿出让其恢复室温，再向板中加入要检测的培养液100 μl每一孔，两孔做阴阳性对照，阴性对照用10%的培养液，阳性对照用稀释10000倍的血清（融合前小鼠眼眶采血的血清）。
35.（2）孵育：用封板膜封板后置37℃孵育箱中孵育1小时。
36.（3）洗涤：小心揭掉封板膜，洗涤4遍，最后尽量扣干水分。
37.（4）加双抗：双抗稀释10000倍，50 μl每孔。
38.（5）孵育：用封板膜封板后置37℃孵育30分钟。
39.（6）洗涤：小心揭掉封板膜，洗涤4遍，最后尽量扣干水分。
40.（7）显色：每孔加显色剂tmb 100 μl，轻轻振荡混匀，孵育箱显色大概10 min。
41.（8）比色测定：每孔加终止液50 μl（终止液=21.5 ml的浓硫酸定容至200 ml），轻轻振荡混匀，设定酶标仪波长为450 nm，测定各孔值。
42.选取阳性结果高者（至少为阴性对照的4倍），作为阳性克隆孔。
43.1.3.8有限稀释法筛选抗大熊猫tshβ单克隆抗体杂交瘤细胞株（1）阳性孔细胞的计数：将筛选得到的阳性克隆孔做有限稀释。先将孔中的细胞转移到15 ml的离心管中（边吹打边旋转，使细胞悬浮），再补加10%的完全培养液至2 ml；再用计数板计数，计数之后取只含1000个细胞的细胞液进行下一步实验（由于1个孔只需要一个细胞，96孔板一板就需要大约100个细胞，10板就是1000个细胞）。
44.（2）将细胞液加入200 ml完全培养液中，混匀，96孔板加样，200 μl/孔，共十块96孔板。
45.（3）最后将培养板置co2培养箱中培养。
46.（4）培养5天后，在倒置显微镜上可见到小的细胞克隆，观察细胞的生长情况，记录单个细胞生长聚集的孔。
47.（5）培养第5天给有记录单个细胞生长聚集的孔进行换液，加10%完全培养液100 μl/孔。
48.（6）第8天时，肉眼可见细胞克隆，及时进行抗体检测，将由单个细胞生长聚集的孔并且生长情况比较好的孔进行培养液的检测（elsia检测），阳性强的孔即为抗大熊猫tshβ单克隆抗体杂交瘤细胞株。本发明最终筛选得到一株抗大熊猫tshβ单克隆抗体杂交瘤细胞株，命名为tshb-a。
49.1.3.9亚型鉴定使用pierce rapid elisa mouse mab isotyping kit 37503试剂盒进行亚型鉴定。
50.准备工作：将试剂盒中tbs溶于500 ml双蒸水中，用于稀释样品，870 ml双蒸水与30 ml 30
×
wash buffer混匀，用于洗板，根据所做样品的量确定需要多少条板子，其余放回4℃冰箱保存，准备450 μl的样品稀释液，吸取20 μl的细胞培养液加入980 μl的tbs中混匀。
51.实验步骤：将板子平衡到室温，加入待测样品到每孔，50 μl/孔，每个样需加8孔即一条，加入50 μl/孔的goat anti-mouse igg+iga+igm hrp，轻柔的晃动板子混匀 盖上封板膜，室温孵育一个小时，洗板4次，扣干水分，加入75 μl/孔的tmb显色液显色，将会看到孔内液体变成蓝色，显色10 min之后加入75 μl/孔的终止液终止反应，液体由蓝色变为黄色。经鉴定筛选所得到的抗大熊猫tshβ单克隆抗体细胞株所分泌的抗体亚型为igg1型，结果如表2所示。
52.表2 杂交瘤细胞株亚型
1.3.10单克隆抗体的扩大培养及纯化，浓缩。
53.（1）批量培养：将进行了亚型鉴定，结果为单抗的细胞孔转移到24孔板中（边旋转边吹打，使细胞悬浮，进行完全转移）培养，并加600 μl的10%完全培养液培养。
54.（2）观察细胞的生长情况，长得比较多之后进行效价测定，效价高的细胞进行转移，转移到小的培养瓶中培养（先将24孔板中的细胞吹打使细胞悬浮，在用加样枪将细胞转移到培养瓶中，补加10%的完全培养液7 ml）。
55.（3）观察细胞生长情况，长得比较好之后再转移至大的培养瓶中培养。一个小的培养瓶分别转移两个大的培养瓶中进行培养（细胞传代）。
56.（4）可多传几个培养瓶培养，冻存一部分细胞，再拿培养液进行抗体过柱纯化。所用柱子为所用填料为pierce protein g agarose，并用10000 kda超滤管浓缩纯化过的抗大熊猫tshβ单克隆抗体，-20℃保存备用。
57.1.3.11单克隆抗体细胞株冻存将鉴定的抗大熊猫tshβ单克隆抗体细胞株培养稳定后，将培养瓶中的细胞吹打使细胞悬浮在培养液中（细胞一般悬浮在培养液中或贴壁生长），在将细胞转移至15 ml的离心管中。离心，1000转/5分钟。用pbs洗涤两次：先将离心管中的上清液吸出，弃掉，加pbs，混匀，离心1000转/5分钟，最后重复一次。最后再用加样枪吸出上清液，再向细胞中加入适量冻存液（冻存液=5 ml血清+4 ml dmem+1 ml dmso，颠倒混匀，过滤备用），混匀。最后加入冻存管中，每管1 ml细胞液。放入冻存盒，先放-80℃过夜，再将细胞株放入液氮中长期保存备用。
58.实施例2一、抗大熊猫tshβ单克隆抗体在western blot技术中的应用。
59.1、目的组织总蛋白的提取应用蛋白提取试剂盒：c510004-0020，生工生物工程（上海）股份有限公司提供，提取），大熊猫骨髓间充质干细胞总蛋白，并通过bca法对总蛋白浓度进行测定。
60.2、制胶：制备聚丙烯酰胺凝胶，浓缩胶5%，分离胶12%。
61.3、制样：蛋白上样量为80 μg。
62.4、电泳：浓缩胶80 v，30 min；分离胶120 v，90 min。
63.5、转膜：250 ma，40 min。
64.6、封闭：5%脱脂乳，37℃缓慢震荡2 h。
65.7、孵育一抗：tshβ-1抗体1:1000稀释，4℃缓慢振荡过夜，次日37℃复温1 h。
66.8、孵育二抗：1:8000稀释，37℃孵育1 h。
67.9、ecl曝光。
68.二、应用结果：1、细胞蛋白浓度表3 标准曲线表标准曲线如图1所示。
69.表4 蛋白浓度表2、western-blot检测结果如图2所示。
70.根据图1和图2结果所示，本发明开发的抗大熊猫tshβ亚基单克隆抗体，能准确识别目标蛋白tshβ亚基，可用于western blot技术中的应用，然后将获得的杂交瘤细胞株tshb-a于2022年3月27日保藏于中国武汉武汉大学中国典型培养物保藏中心，其保藏号为cctcc no：c202282。
71.三、抗大熊猫tshβ单克隆抗体效价测定及序列测定使用间接elisa检测培养液上清纯化tshb-a细胞株单克隆抗体效价，具体步骤为：（1）将实施例1中多肽片段tshβ-1 2μg/ml，50μl/孔包被酶标板，置于4℃孵育过夜包被。
72.（2）洗净包被板，加入200μl/孔 含2% bsa的pbs，37℃封闭2h。
73.（3）洗板后，加入倍比稀释浓度的抗tshβ单克隆抗体（分别为：1000倍，2000倍，4000倍，8000倍，16000倍，32000倍，64000倍，128000倍，256000倍）和pbs孔作为对照，37℃孵育1h。
74.（4）洗板后，加入1：5000倍的辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体，37℃孵育1h。
75.（5）加入tmb显色底物100μl/孔，反应5min。
76.（6）加入50μl终止液终止反应。
77.（7）酶标仪450nm处，读取各孔od值，检测结果见表5。
78.如表5所示，培养液上清纯化的tshβ抗体效价达106以上，表明抗体效价高。
79.表5 抗体效价
将获得的抗大熊猫tshβ单克隆抗体细胞株(tshb-a)送至通用生物（安徽）股份有限公司进行测序，该单克隆抗体的重链可变区序列如下：evklvesggglvkpggslklscaasgfifrryamswvrqtpekrlewvaaissggniyyldnvkgrftisrddarnilylqmsslrsedtamyycarddydedwyfdvwgagttvtvss（seq id no.1）。
80.轻链可变区序列如下：dvlmtqiplslpvslgdqasiscrssqsivhsngntylewylqkpgqspnlliykvsnrfsgvpdrfsgsgsgtdftlkisrveaedlgvyycfqgshlpptfgggtkleik（seq id no.2）。
81.综上，本发明通过构建分泌tshβ单克隆抗体的杂交瘤细胞株，收集并纯化细胞株培养上清，获得高特异性tshβ单克隆抗体，然后将获得的高特异性的tshβ单克隆抗体应用于western blot蛋白检测。为促甲状腺素蛋白的定位和组织表达信息、对促甲状腺素及其相关肽的受体作用研究，以及进一步探讨促甲状腺素的功能，揭示生殖生理规律提供了新的资料和思路。
82.最后应说明的是，以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

技术特征：
1.一种大熊猫tshβ单克隆抗体，其特征在于，其重链可变区的氨基酸序列如seq id no.1所示，轻链可变区的氨基酸序列如seq id no.2所示。2.根据权利要求1所述的大熊猫tshβ单克隆抗体，其特征在于，其亚型为igg1。3.一种表达载体，其特征在于，包括权利要求1或2所述的大熊猫tshβ单克隆抗体。4.一种分泌如权利要求1或2所述的大熊猫tshβ单克隆抗体的杂交瘤细胞株tshb-a，其特征在于，所述杂交瘤细胞株tshb-a的保藏号为cctcc no：c202282，于2022年3月27日保藏于中国武汉武汉大学中国典型培养物保藏中心。5.权利要求1或2所述的大熊猫tshβ单克隆抗体在大熊猫促甲状腺素检测中的应用。6.一种用于检测大熊猫tshβ的试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1或2所述的大熊猫tshβ单克隆抗体。7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒为western blot检测用试剂盒。

技术总结
本发明提供了一种大熊猫TSHβ单克隆抗体及其杂交瘤细胞株和应用，属于生物免疫学技术领域。该大熊猫TSHβ单克隆抗体重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明提供了一种大熊猫TSHβ单克隆抗体及其杂交瘤细胞株TSHB-A，能够通过杂交瘤细胞株TSHB-A分泌得到大熊猫TSHβ单克隆抗体，并且该抗体能准确识别目标蛋白TSHβ亚基，为TSH蛋白的定位和组织表达信息、特异性配体、拮抗物、抗拮抗物的发现创造条件，此外，还可利用TSH高特异性的单克隆抗体对TSH受体的配体、拮抗物、抗拮抗物进行更进一步的深入研究。进一步的深入研究。进一步的深入研究。


技术研发人员：蔡开来 王东辉 王涓 胡贤彪 李非平 张梦诗 王神飞 刘玉良 侯蓉 李明喜 兰景超
受保护的技术使用者：成都大熊猫繁育研究基地
技术研发日：2023.08.23
技术公布日：2023/10/5