一种异喹啉类生物碱的制备方法和应用

1.本发明涉及农药技术领域，具体涉及一种异喹啉类生物碱的制备方法和应用。


背景技术：

2.植物病毒对寄主的危害，防治上十分困难。现植物病毒的危害有日益严重的趋势，发病病毒种类越来越多，混发现象日趋严重。当前如何解决植物病毒病，是农业生产中的迫切问题，也是农民增产增收的保证。番茄斑萎病毒（tomato spotted wilt virus，tswv）是目前已知寄主范围最广、最具破坏力的植物病毒之一；已成为严重危害世界农作物的病毒，寻找有效治疗tswv农药是影响中国乃至世界农作物安全的重大课题。目前，农业生产中对tswv的防治措施包括喷施病毒抑制剂（宁南霉素、盐酸吗啉胍、香菇多糖、葡聚烯糖等）、诱杀传播媒介蓟马、培育抗性品种等措施。但由于tswv在媒介昆虫和宿主植物体内特殊的寄生性、传毒媒介蓟马易产生抗药性、抗病品种易出现抗性缺失、病毒耐药性增加和农药残留污染环境等一系列问题。如何开发出高效、环保、安全的抗病毒剂已成为当前抗植物病毒新农药研发的重点和热点。
3.植物在长期进化过程中，形成了针对害虫和病原微生物的化学防御物质，这些防御物质具有高识别特异性，在抵御外来致病菌或病毒侵染的同时，保持对植物自身低毒性对环境低污染性。因此，开发基于植物体内的化学防御性物质是开发新型、高效、环保农药的有效途径。


技术实现要素：

4.基于此，本发明提供了一种喹啉类生物碱及其制备方法和作为农药的应用。本发明的喹啉类生物碱是从岩黄连中提取得到的。岩黄连为罂粟科植物石生黄堇的全草，现临床多用于肝炎、痢疾、腹泻和广谱抗菌剂使用。岩黄连中的异喹啉类生物碱具有理化性质稳定、低毒、高活性、易代谢等优点，可作为高效抗tswv活性先导物，为后续明确其作用靶标和抗病毒机制，以开发新型、高效、高选择性的植物病毒抑制剂提供重要依据。
5.本发明是采用以下技术方案实现的：一种异喹啉类生物碱，其化学结构式为下列中的一种：（1），（2），
（3）。
6.本发明所述异喹啉类生物碱的制备方法，包括以下步骤：s1、将岩黄连全草干燥后粉碎，得到岩黄连粉；然后利用乙醇进行超声提取至少3次，将提取液进行合并后浓缩，得到浸膏；s2、浸膏采用酸碱处理，使用0.1%盐酸将ph值调节为2，再使用石油醚萃取去除非生物碱成分；水层采用26%浓氨水将ph调节为10再依次使用二氯甲烷、正丁醇萃取，回收溶剂干燥后得总生物碱；s3、将所述总生物碱经mci柱色谱分离，使用甲醇：水以体积比0:100~100:0为流动相进行梯度洗脱，以体积比40：60 洗脱时，收集洗脱液蒸干后得馏分a；s4、将所述馏分a通过300目～400目硅胶柱层析，先利用体积比为200:1~5:1二氯甲烷和甲醇为流动相进行梯度洗脱，在以体积比为15:1时收集得到洗脱液i，在以体积比为10:1时收集得到洗脱液ii；最后利用体积比5:1收集得到洗脱液iii；s5、将所述洗脱液i经３种不同的溶剂系统（石油醚：丙酮：二乙胺；二氯甲烷：甲醇；醋酸乙酯：甲醇）展开，薄层行为一致为单一化合物，收集后使用旋转蒸发仪回收溶剂，得到所述化合物（1）；将所述洗脱液ii经上述相同方法处理后得到所述化合物（2）；将所述洗脱液iii在0～4℃下进行静置析晶，过滤干燥后得到黄色粉末，即为所述化合物（3）。
7.优选的，步骤s1所述乙醇质量浓度为70%。
8.本发明所述异喹啉类生物碱作为防治番茄斑萎病毒药物的应用。
9.具体而言，本发明所述防治番茄斑萎病毒药物中包括所述异喹啉类生物碱或其在农药学上可应用的盐类，或其在农药学上可应用的载体。
10.本发明化合物（1）的核磁氢谱（1h-nmr）和碳谱（
13
c-nmr）数据（δ in ppm，j in hz）如下：1h-nmr (300 mhz, dmso-d6) δ: 2.96 (1h, s, 13-ch3),3.89 (3h, s,-och3),3.84 (3h, s,
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och3), 3.13 (2h, t, j= 9.0 hz, h-5), 4.79 (2h, t, j= 9.0 hz, h-6), 6.54 (2h, s,
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och2o-), 7.16 (1h, s, h-1), 7.36 (1h, s, h-4), 7.98 (1h, d, j= 9.0 hz, h-12), 8.04 (1h, d, j = 9.0 hz, h-11), 9.93 (1h, s, h-8); 13c-nmr (75 mhz, dmso-d6) δ: 19.0 (13-ch3), 27.6 (c-5), 57.5 (-och3), 57.0 (-och3), 57.5 (c-6), 105.4 (-och2o-), 111.6 (c-4), 111.7 (c-1), 115.2 (c-11), 119.8 (c-12), 120.1 (c-13), 131.7 (c-14a), 135.5 (c-14), 132.4 (c-12a), 133.1 (c-8a), 136.3 (c-4a), 143.7 (c-8), 145.3 (c-10), 147.6 (c-9), 147.8 (c-3), 150.6 (c-2)。
11.本发明化合物（2）的核磁氢谱（1h-nmr）和碳谱（
13
c-nmr）数据（δ in ppm，j in hz）
如下：1h-nmr (300 mhz, dmso-d6) δ: 2.88 (3h, s, 13-ch3), 3.18 (2h, t, j = 5.4 hz, h-5), 3.88 (3h, s, 2-och3), 4.86 (2h, t, j = 5.4hz,h-6), 6.52 (2h,s,-och2o-), 7.06 (1h,s,h-4), 7.75 (1h,s,h-1), 7.80 (1h,d,j=8.7hz,h-12), 8.02 (1h,d,j=8.7hz,h-11), 9.92 (1h,s,h-8); 13c-nmr (75mhz,dmso-d6) δ:18.2 (13-ch3), 26.3 (c-5), 55.0 (c-6), 55.8 (2-och3), 104.3 (-och2o-), 105.1 (c-1), 108.3(c-4), 111.5 (c-8a), 119.0 (c-14a), 120.8 (c-11), 121.5 (c-12), 130.4 (c-4a),131.7 (c-12), 132.1 (c-13), 136.6 (c-14), 143.6 (c-8), 144.3 (c-9), 146.8 (c-10), 147.5 (c-3), 149.5 (c-2)。
12.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明以岩黄连全草为原料，采用了一种较为简便易操作的提取分离方式，得到了小檗碱型异喹啉类生物碱。经实验验证，本发明的异喹啉类生物碱对tswv在预防、防控方面均具有良好效果。
附图说明
13.图1为本发明异喹啉类生物碱对tswv初侵染中抗tswv抑制率；图2为本发明异喹啉类生物碱对tswv复制增殖中抗tswv抑制率。
具体实施方式
14.下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
15.一种异喹啉类生物碱的制备方法，步骤如下s1、将岩黄连全草干燥后粉碎，得到岩黄连粉；然后利用乙醇进行超声提取至少3次，将提取液进行合并后浓缩，得到浸膏；s2、浸膏采用酸碱处理，使用0.1%盐酸将ph值调节为2，再使用石油醚萃取去除非生物碱成分；水层采用26%浓氨水将ph调节为10再依次使用二氯甲烷、正丁醇萃取，回收溶剂干燥后得总生物碱；s3、将所述总生物碱经mci柱色谱分离，使用甲醇：水以体积比0:100~100:0为流动相进行梯度洗脱，以体积比40：60 洗脱时，收集洗脱液蒸干后得馏分a；s4、将所述馏分a通过300目～400目硅胶柱层析，先利用体积比为200:1~5:1二氯甲烷和甲醇为流动相进行梯度洗脱，在以体积比为15:1时收集得到洗脱液i，在以体积比为10:1时收集得到洗脱液ii；最后利用体积比5:1收集得到洗脱液iii；s5、将所述洗脱液i经３种不同的溶剂系统（石油醚：丙酮：二乙胺；二氯甲烷：甲醇；醋酸乙酯：甲醇）展开，薄层行为一致为单一化合物，收集后使用旋转蒸发仪回收溶剂，定重，得到所述化合物（1）；将所述洗脱液ii经上述相同方法处理后得到所述化合物（2）；将所述洗脱液iii在0～4℃下进行静置析晶，过滤干燥后得到黄色粉末，即为所述化合物（3）。
16.利用本发明实施例1制备的三种化合物进行防治tswv活性研究验证，具体实验如下：a、番茄斑萎病毒准备：番茄斑萎病毒普通株系，由云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所提供。繁殖于普通烟k326上，提纯后用紫外分光光度计测定其浓度后置于-80℃冰箱中保存，备用：b、接种病毒和施药化合物对tswv初侵染的抑制作用（预防作用）：挑选健康、长势一致的5-6片真叶期k326烟苗，于第 4 片和第5片真叶上均匀涂抹待测化合物（100μg/ml），直至化合物制剂用完（2 ml）10 min后用清水将叶片表面金刚砂冲洗干净，6h后摩擦接种tswv（100μg/ml），10min后用清水冲洗。设置阳性对照2个，一个阳性对照为先涂抹等量ddh2o其余处理步骤相同；另一个阳性对照为先施宁南霉素其余处理步骤相同。上述每个样品重复三次，在无虫温室中培养3～4天后统计枯斑数，并计算抑制率。
17.抑制率=（对照枯斑数-处理枯斑数）/对照枯斑数
×
100%化合物对tswv复制增殖的抑制作用（治疗作用）：挑选健康、长势一致的5-6片真叶期k326烟苗，于第4片和第5片真叶上摩擦接种tswv（100 μg/ml），10min后用水将叶表面的金刚砂冲洗干净，24h后均匀涂抹待测化合物（100μg/ml）。设置阳性对照2个，一个阳性对照为先涂抹等量ddh2o其余处理步骤相同；另一个阳性对照为先施宁南霉素其余处理步骤相同。上述每个样品重复三次，在无虫温室中培养3～4天后统计枯斑数，并计算抑制率。
18.表1.化合物（1）-化合物（3）抗tswv活性
19.a
三次平均值；b宁南霉素作为阳性对照通过体内抗tswv实验表明；化合物（3）（100μg/ml）对tswv表现出较好的保护和治疗作用，其预防作用抑制率为62%高于阳性对照宁南霉素45%，其治疗作用的抑制率为50%高于阳性对照宁南霉素42%。
20.需要说明的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例，显然本发明不仅仅限于以上实施例，还可以有其他变形。本领域的技术人员从本发明公开内容直接导出或间接引申的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

技术特征：
1.一种异喹啉类生物碱的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：s1、将岩黄连全草干燥后粉碎，得到岩黄连粉；然后利用乙醇进行超声提取至少3次，将提取液进行合并后浓缩，得到浸膏；s2、浸膏采用酸碱处理，使用0.1%盐酸将ph值调节为2，再使用石油醚萃取去除非生物碱成分；水层采用26%浓氨水将ph调节为10再依次使用二氯甲烷、正丁醇萃取，回收溶剂干燥后得总生物碱；s3、将所述总生物碱经mci柱色谱分离，使用甲醇：水以体积比0:100~100:0为流动相进行梯度洗脱，以体积比40：60 洗脱时，收集洗脱液蒸干后得馏分a；s4、将所述馏分a通过300目～400目硅胶柱层析，先利用体积比为200:1~5:1二氯甲烷和甲醇为流动相进行梯度洗脱，在以体积比为15:1时收集得到洗脱液i，在以体积比为10:1时收集得到洗脱液ii；最后利用体积比5:1收集得到洗脱液iii；s5、将所述洗脱液i经３种不同的溶剂系统（石油醚：丙酮：二乙胺；二氯甲烷：甲醇；醋酸乙酯：甲醇）展开，薄层行为一致为单一化合物，收集后使用旋转蒸发仪回收溶剂，得到化合物（1）；将所述洗脱液ii经上述相同方法处理后得到化合物（2）；将所述洗脱液iii在0～4℃下进行静置析晶，过滤干燥后得到黄色粉末，即为化合物（3）；其中化合物（1）~（3）的结构式如下：（1）（2）（3）。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤s1所述乙醇质量浓度为70%。3.根据权利要求1或2所述方法制备的异喹啉类生物碱作为防治番茄斑萎病毒药物的应用。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述防治番茄斑萎病毒药物中包括所述异喹啉类生物碱或其在农药学上可应用的盐类，或其在农药学上可应用的载体。

技术总结
本发明公开了一种异喹啉类生物碱的制备方法和应用，涉及农药技术领域。本发明是从岩黄连全草中经过提取、分离纯化得到三种小檗碱型异喹啉类生物碱。本发明制备的异喹啉类生物碱能够有效预防以及防控TSWV，具有较高的防治效果。效果。效果。


技术研发人员：赵立华 张仲凯 张桐 张洁 胡占兴 李靖 郑雪
受保护的技术使用者：云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所
技术研发日：2023.08.24
技术公布日：2023/10/5