一种发酵液中5-氨基乙酰丙酸和甘氨酸含量的测定方法与流程

1.本发明涉及饲料组分检测领域，具体涉及一种发酵液中5-氨基乙酰丙酸和甘氨酸含量的测定方法。


背景技术：

2.5-氨基乙酰丙酸(5-ala)是生物体内四吡咯和卟啉合成的前体，可作为新一代光动力学剂用作除草剂、杀虫剂、抗微生物药剂、植物生长促进剂及医学诊断，越来越受到关注。然而，关于5-ala 发酵生产方面的研究较少，特别是关于对发酵过程中的目标代谢产物及时准确的监测方面很少有人研究。目前主要采用微生物发酵技术生产5-ala，在5-ala合成酶的作用下将琥珀酰coa 和甘氨酸缩合为5-ala是目前发酵法生产5-ala的主要途径。
3.当前使用微生物发酵技术生产5-ala中需要使用甘氨酸作为5-ala合成的前体物质，所以在发酵中需要及时准确的测定发酵中甘氨酸含量与5-ala含量，进而计算当前阶段甘氨酸与产物的转化率，了解微生物状态，进而更好的对发酵条件进行控制，促进产物合成。另外，5-ala在溶液中很不稳定, 温度、浓度 、ph、溶氧都会引起它两分子缩合产生其它物质。因此, 寻找一种快速、简便、稳定的检测方法十分重要。
4.当前5-ala与甘氨酸含量的主要检测方法有两种：一是分光光度法：目前检测5-ala含量大多数使用化学显色法测定，该方法原理为5-ala与乙酰丙酮在ph4.6的乙酸-乙酸钠缓冲溶液中（100℃、15min水浴）能够发生缩合，生成吡咯衍生物，此衍生物在强酸介质中形成橙红色物质，在553nm波长下，进行检测。该方法每次测定都需要配制新的标准液进行新的标准曲线绘制，中间过程需要使用高氯酸以及乙酰丙酮等有毒强酸危险化学药品，操作过程繁琐，每次测量耗时2小时，而5-ala发酵生产中，需要及时跟踪前体物质消耗速率以及合成物质的合成速率，从而做到生产环节的及时把控，而该方法做不到产物测量的及时跟踪，也做不到对前体物质含量进行跟踪。
5.二是丹黄酰氯（dst）检测法：当前有一些文献报道中使用丹黄酰氯衍生化法对甘氨酸与5-ala同时进行测定，该方法利用丹黄酰氯（dst）对显性胺基团的亲和性，在碱性条件下将胺基团转化为丹黄酰胺基团，从而使分析物中的含氮化合物生成丹黄酰胺衍生物。但该方法衍生时间较长（1h），过程中操作步骤繁琐，并且，样品洗脱时间较长，检测中杂峰较多，每次测定耗时2小时以上，仍无法做到对生产的及时跟踪。
6.甘氨酸与5-ala为两种伯胺类物质，而荧光胺是一种伯胺类物质的特效衍生剂，可以特异性的与伯胺类物质产生荧光，而荧光胺本身不具有荧光性，在水中也会水解为非荧光物质，因此对检测峰形不会产生干扰，并且荧光胺与伯胺类物质衍生时间较短，可以显著减少检测时间，因此将采用荧光胺作为衍生试剂进行方法优化。但是，由于菌体发酵生产5-ala的发酵液中会产生一些含伯胺类物质，与荧光胺特异性反应，会出来其他杂峰，而现有检测方法中都没有考虑到分离这些杂峰，但杂峰不分离出来对5-ala和甘氨酸的检测会造成影响。
7.由此可见，现有技术无法满足生产需要，因此急需一种操作方式简单衍生时间短
同时整体检测时间短的方法，可以有效帮助对生产过程中各个重要环节的掌握和调节，以更加高效生产5-ala。


技术实现要素：

8.为了解决以上问题，本发明提出一种发酵液中5-氨基乙酰丙酸和甘氨酸含量的测定方法。
9.本发明提供的发酵液中5-氨基乙酰丙酸和甘氨酸含量的测定方法，使用hplc-荧光法进行测定，具体步骤如下：步骤1）取发酵液5ml于离心管中，4000r/min离心5分钟；步骤2）取上述离心管中的上清液0.1ml置于100ml容量瓶中，定容，摇匀；步骤3）取上述容量瓶中的溶液100μl于1.5ml离心管中，加入100μl的0.1%的荧光胺丙酮溶液，再加入200μl的bbs缓冲液，再加入100μl的0.5%三乙胺溶液，使用振荡器震荡1min，静置3-5min后，微滤到进样瓶中，进行检测。
10.其中，色谱条件及程序设置为：流动相为：a相：0.1%三氟乙酸溶液；b相：乙腈； 采用梯度洗脱方式；色谱柱温度：35℃；进样体积：10μl；激发波长：398nm；发射波长：480nm；流速：1.4ml/min。
11.优选地，所述bbs缓冲液为0.46g十四水硼酸钠和0.51g硼酸溶解定容到100ml容量瓶。
12.优选地，所述梯度洗脱方式的ab相比例和程序如下表所示：
13.本发明的有益效果如下：1、本发明的方法可以同时检测发酵液中5-氨基乙酰丙酸和甘氨酸含量。
14.2、本发明的方法在细节上进行优化，解决了采用常规hplc-荧光法进行测定时，图谱中存在峰形未分离、峰未回归基线、峰形不对称、峰形存在扫尾等问题。
15.3、本发明的方法在检测5-ala在0.1-50ppm间有着良好的线性关系，在检测甘氨酸在0.5-50ppm间有着良好的线性关系，获得的结果准确度高，重复性好。
16.4、本发明的方法回收率很好，适用于生产需求。
17.5、本发明的方法同时检测发酵液中5-氨基乙酰丙酸和甘氨酸含量，用时短，只需25min，比现有检测技术的平均2小时出结果快得多，操作简单，重复性和准确度高，为高效生产5-ala提供了有力的保障。
附图说明
18.图1为实施例1的检测图谱部分峰形截图；图2为实施例2中2.1的检测图谱部分峰形截图；图3为实施例2中2.2的检测图谱部分峰形截图；图4为实施例2中2.3的检测图谱部分峰形截图；
图5为实施例2中2.4的检测图谱部分峰形截图；图6为实施例2中2.5的检测图谱部分峰形截图；图7为实施例2中2.6的检测图谱部分峰形截图；图8为实施例2中2.7的检测图谱部分峰形截图；图9为实施例2中2.8的检测图谱部分峰形截图；图10为实施例2中2.9的检测图谱部分峰形截图；图11为实施例2中2.10的检测图谱部分峰形截图；图12为实施例2中2.11的检测图谱部分峰形截图；图13为实施例2中2.12的检测图谱部分峰形截图；图14为实施例3的甘氨酸标准曲线；图15为实施例3的5-ala标准曲线；图16为实施例3的混标检测图谱部分峰形截图。
具体实施方式
19.以下结合实施例对本发明作进一步说明。
20.实施例1：采用常规hplc-荧光法进行发酵液中5-ala和甘氨酸含量检测5-ala发酵液制备：将5-ala生产菌株进行菌种复壮后，接种到1l摇瓶中，制备得5-ala菌种摇瓶，培养达到接种要求后，将5-ala种子摇瓶接种到5l发酵罐中，培养一段时间后进行诱导表达，产出含有5-ala发酵液。
21.步骤1）取发酵液5ml于离心管中，4000r/min离心5分钟；步骤2）取上清0.1ml置于100ml容量瓶中，定容，摇匀；步骤3）取100μl溶液于1.5ml离心管中，加入100μl0.1%荧光胺丙酮溶液，再加入300μl的bbs缓冲液（0.46g十四水硼酸钠和0.51g硼酸溶解定容到100ml容量瓶），使用振荡器震荡1min，静置3-5min后，微滤到进样瓶中进行检测实施例1的方法的检测条件：色谱柱：diamonsil c18(2) 5μm 250 x 4.6mm流动相：a相：0.1%三氟乙酸溶液、b相：乙腈；a相：b相=7：3；色谱柱温度：40℃； 进样体积：20μl；激发波长：398nm；发射波长：480nm；流速：1.5ml/min。
22.实施例1获得的图谱如图1所示，通过对发酵液使用内标法已经确认1#为甘氨酸峰形、3#为5-ala峰形，另外，2#为干扰峰型，这种干扰峰与1#和3#峰未分离，会影响测定结果。
23.由图1可见，采用常规的hplc-荧光法检测发酵液中5-ala和甘氨酸含量，获得的图谱中存在峰形未分离、峰未回归基线、峰形不对称的问题，所以需要这对峰形分离以及峰形回归基线等问题做出优化。
24.实施例2：对常规hplc-荧光法的优化改进筛选实验采用实施例1的发酵液，2.1 减少流动相b的比例将流动相比例调整为a:b=8：2，其余步骤同实施例1。
25.2.1获得的图谱如图2所示，减少流动相b的比例，峰形洗脱效果比较差，由于b相减少，导致对两种氨基酸洗脱能力减弱，不能进行有效洗脱。
26.2.2 增加流动相b的比例将流动相比例调整为a:b=6：4，其余步骤同实施例1。
27.2.2获得的图谱如图3所示，增加流动相b的比例，由a相：b相=7：3改变为a相：b相=6：4，峰形聚在一起，分离效果更差，所以单纯的调整等度洗脱流动相比例无法做到保持峰形的同时将峰形有效分离，后续在分析完其他因素对峰形效果影响的基础上，考虑使用梯度洗脱来分离峰形。
28.2.3 减少流动相流速为1.2ml/min，同时减少进样量为10μl将流动相流速由常规的1.5ml/min减少为1.2ml/min，同时进样量由20μl 减少为10μl，其余同实施例1。
29.减少流动相流速，通过改变流动相流速来调整出峰时间，进而使峰形分离，同时减少进样量，尝试解决峰形有前延峰以及未回落基线问题。
30.2.3获得的图谱如图4所示，减少进样量至10μl对于峰形的回落有一定的帮助，后续实验中可以都采用10μl进样量；同时流动相流速降低至1.2ml/min会导致2#峰形无法洗脱出来，并且峰展变大，但可以增加一定峰距。
31.2.4 减少流动相流速为1.4ml/min，同时减少进样量为10μl将流动相流速由常规的1.5ml/min减少为1.4ml/min，同时进样量由20μl 减少为10μl，其余同实施例1。
32.2.4获得的图谱如图5所示，降低流动相流速为1.4ml/min能够将2#峰形有洗脱出来，综合2.3和2.4说明降低流速可以增加峰形间距，但流速太低会影响峰形的洗脱效果；减少进样量可以使得峰形回落得到一定的解决，后续将采用10μl进样量。
33.2.5 降低色谱柱温度至30℃将色谱柱温度由40℃降低为30℃，同时进样量由20μl 减少为10μl，其余同实施例1。
34.通过改变色谱柱温度进一步考察温度单因素对于出峰的影响。
35.2.5获得的图谱如图6所示，在柱温30℃情况下，前面1#、2#峰形没有分离并且整体洗脱效果变差，所以色谱柱温度降低对于目标物的洗脱有较大影响。
36.2.6 降低色谱柱温度至35℃将色谱柱温度设定为35℃，其余同实施例2的2.5。
37.2.6获得的图谱如图7所示，通过图6和图7图谱可得出，色谱柱温度会影响出峰效果，随着柱温下降，对目标物的洗脱能力会变差，但降低色谱柱温度可以增加峰形之间距离，图7中的峰形间距就比较理想。
38.2.7使用其他碱性缓冲液将bbs缓冲液改为磷酸盐缓冲液 0.01mol/l，ph 7.9，同时进样量由20μl 减少为10μl，其余同实施例1。
39.2.7获得的图谱如图8所示，使用磷酸盐缓冲液后，峰形杂乱，不利于峰形的分离，所以应继续使用bbs缓冲液。
40.2.8 采用梯度洗脱方式在筛选完单因素对出峰影响的基础上，采用梯度洗脱方式进行进一步的优化，梯度洗脱程序a如表1所示，同时进样量由20μl 减少为10μl，其余同实施例1。
41.为了使中间的峰进行分离，在7min后降低b流动相比例，改变中期出峰时间。
[0042][0043]
2.8获得的图谱如图9所示，最后一个峰形洗脱效果差，但与前面两峰有效分离，2#峰形未能有效分离，说明，b流动相减少导致洗脱效果较差，需要提高b流动相比例，使得2#峰能够洗脱出来，所以针对出现的问题再次优化洗脱程序。
[0044]
2.9 改进梯度洗脱方式采用梯度洗脱方式，梯度洗脱程序b如表2所示，其余同实施例2的2.8。
[0045]
在2.8方法基础上，调高开始时流动相b比例，以及8-20min时间b流动相比例，增加洗脱能力，改善峰形的洗脱效果。
[0046][0047]
2.9获得的图谱如图10所示，峰形大致得到分离，但1#、2#仍连在一起形成肩峰，仍需要对两峰进行分离，通过对温度以及流动相流速进行下调，延长出峰时间，进而对1#、2#峰形进行进一步分离。
[0048]
2.10 继续改进梯度洗脱方式下调色谱柱温为35℃，降低流速为1.4ml/min，其余同实施例2的2.9。
[0049]
2.10获得的图谱如图11所示，降低流动相流速以及下调柱温后，峰形得到进一步分离，1#、2#峰之间仍有峰形未回落现象，所以进一步调整流动梯度洗脱程序，使1#峰更早出峰，延迟2#峰出峰时间。
[0050]
2.11 再次改进梯度洗脱方式在2.10的基础上，对梯度洗脱程序进行调整，梯度洗脱程序c如表3所示。
[0051]
初始5分钟保持35%b相比例，加快1#出峰时间，6-9min为正常洗脱浓度，洗脱1#峰形，之后降低b相比例，延长2#出峰时间，2#出峰后，保持正常b相比例，洗脱3#峰形。
[0052][0053]
2.11获得的图谱如图12所示，基本得到所需峰形，但1#峰形存在拖尾问题，使得峰形不对称，需要进一步对此进行优化，考虑加入扫尾剂三乙胺溶液进行扫尾。
[0054]
2.12 扫尾改进在2.11的基础上，将bbs溶液用量由300μl减少为200μl，同时补充加入100μl 0.5%三乙胺溶液，解决1#峰存在拖尾的问题。
[0055]
2.12获得的图谱如图13所示，通过加入100μl 0.5%三乙胺溶液替换100μl的bbs溶
液后，解决了1#峰存在的扫尾问题，峰形都得到有效分离，峰形对称性好，得到满足实际生产的检测方法。
[0056]
综上所述，以2.12的方法为本发明的方法，在生产实践中对发酵液的5-氨基乙酰丙酸和甘氨酸含量进行测定。具体为：步骤1）取发酵液5ml于离心管中，4000r/min离心5分钟；步骤2）取上述离心管中的上清液0.1ml置于100ml容量瓶中，定容，摇匀；步骤3）取上述容量瓶中的溶液100μl于1.5ml离心管中，加入100μl的0.1%的荧光胺丙酮溶液，再加入200μl的bbs缓冲液，再加入100μl的0.5%三乙胺溶液，使用振荡器震荡1min，静置3-5min后，于液相色谱仪上微滤进样；其中，色谱条件及程序设置为：流动相为：a相：0.1%三氟乙酸溶液；b相：乙腈；采用梯度洗脱方式；色谱柱温度：35℃；进样体积：10μl；激发波长：398nm；发射波长：480nm；流速：1.4ml/min。
[0057]
所述bbs缓冲液为0.46g十四水硼酸钠和0.51g硼酸溶解定容到100ml容量瓶。
[0058]
所述梯度洗脱方式的ab相比例和程序如表3梯度洗脱程序c所示。
[0059]
实施例3使用本发明的方法对甘氨酸、5-ala标品以及两者的混合标品进行检测并绘制标准曲线。
[0060]
试验试剂：试剂
①
：精密称取5-ala盐酸盐0.126g于100ml容量瓶中，定容，摇匀，得浓度为1000μg/ml溶液，之后取10ml该溶液于100ml容量瓶中，定容，摇匀，得100μg/ml的5-ala标准母液试剂
②
：精密称取甘氨酸（ar）0.1g于100ml容量瓶中，定容，摇匀，得浓度为1000μg/ml的溶液，之后取10ml该溶液于100ml容量瓶中，定容，摇匀，得100μg/ml的甘氨酸标准母液。
[0061]
试验方案：一、甘氨酸、5-ala单独标准曲线绘制：取试剂
①
按照0.5、1、5、10、20、50ppm分别稀释，得梯度溶液，然后按照2.12方法进行样品处理、进样、测定，最后绘制标准曲线；试剂
②
进行同样操作，最终绘制标准曲线，见表4、表5和图14、图15。
[0062]
二、甘氨酸、5-ala混标试验：将10ml容量瓶中依次加入1ml试剂
①
、1ml试剂
②
，使用超纯水稀释、定容，得含有甘氨酸、5-ala含量为10ppm的待测液，按照2.12方法处理，得图谱（见图16），该图谱中甘氨酸、5-ala峰形出峰时间、以及峰形面积与各自单标时出峰时间、面积保持一致，说明混合后这两种物质不会对检测造成干扰。从图16中也可以看出，采用5-ala和甘氨酸标品混合物检测结果中就没有杂峰出现，再次说明菌种发酵生产5-ala过程中的确会产生与荧光胺有反应的其他物质，影响了对发酵液中5-ala和甘氨酸的含量测定，所以需要采取改进的检测方法，把这个杂峰分离出来，更为准确的获得5-ala和甘氨酸的含量，才能更好的指导生产实践。
[0063][0064]
图14为甘氨酸标准曲线，图15为5-ala标准曲线，图16为混标图谱。
[0065]
从本实施例结果显示，通过对5-ala与甘氨酸标液的测定得出，采用本发明的方法检测5-ala在0.1-50ppm间有着良好的线性关系（r2=1），甘氨酸在0.5-50ppm间有着良好的线性关系（r2=0.9991）。
[0066]
实施例4 本方法的回收率测定通过将5ala和甘氨酸的低、中、高三个浓度标品加入发酵液中进行标品加样回收来确定该方法的回收率。
[0067]
1）试验中试剂的配置方法：试剂
①
：精密称取5-ala盐酸盐0.256g于100ml容量瓶中，定容，摇匀，得浓度为2000μg/ml溶液，之后取1ml该溶液于10ml容量瓶中，定容，摇匀，得200μg/ml的5-ala标液；试剂
②
：精密称取甘氨酸（ar）0.2g于100ml容量瓶中，定容，摇匀，得浓度为2000μg/ml的溶液，之后取1ml该溶液于10ml容量瓶中，定容，摇匀，得200μg/ml的甘氨酸标液；试剂
③
：将上面试剂
①
和试剂
②
标液混合在一起，混匀，得到每毫升含100μg的5-ala和甘氨酸的标液，待用；试剂
④
：取试剂
③
1ml于10ml容量瓶中，定容，摇匀，得到每毫升含10μg的5-ala和甘氨酸的标液，待用；试剂
⑤
：取发酵液5ml于离心管中，4000r/min离心5min，取上清液0.1ml于100ml容
量瓶中，定容，摇匀，待用；2）低浓度5-ala（5ppm）与甘氨酸（5ppm）回收试验：取试剂
⑤
50μl、试剂
④
50μl于1.5ml离心管中，震荡混匀后，加入100μl的0.1%荧光胺丙酮溶液，再加入200μl的bbs缓冲液（0.46g十四水硼酸钠和0.51g硼酸溶解定容到100ml容量瓶），加入100μl的0.5%三乙胺溶液，使用振荡器震荡1min，静置3-5min后，微滤进样。
[0068]
对照样：将该方法中的试剂
④
更换为50μl超纯水，其余步骤相同，进行三次操作，计算回收率。
[0069][0070]
3）中浓度5-ala（20ppm）与甘氨酸（20ppm）回收试验：取试剂
⑤
80μl、试剂
③
20μl于1.5ml离心管中，震荡混匀后，加入100μl0.1%荧光胺丙酮溶液，再加入200μlbbs缓冲液（0.46g十四水硼酸钠和0.51g硼酸溶解定容到100ml容量瓶），加入100μl0.5%三乙胺溶液，使用振荡器震荡1min，静置3-5min后，微滤进样。
[0071]
对照样：将该方法中的试剂
④
更换为50μl超纯水，其余步骤相同，进行三次操作，计算回收率。
[0072][0073]
4）高浓度5-ala（40ppm）与甘氨酸（40ppm）回收试验：取试剂
⑤
60μl、试剂
③
40μl于1.5ml离心管中，震荡混匀后，加入100μl0.1%荧光胺丙酮溶液，再加入200μlbbs缓冲液（0.46g十四水硼酸钠和0.5 1g硼酸溶解定容到100ml容量瓶），加入100μl0.5%三乙胺溶液，使用振荡器震荡1min，静置3-5min后，微滤进样。
[0074]
对照样：将该方法中的试剂
④
更换为50μl超纯水，其余步骤相同，进行三次操作，计算回收率。
[0075][0076]
由表7/8/9可知，9次回收试验中甘氨酸平均回收率99.9%，rsd=1.09(n=9)；5-ala平均回收率100.7%，rsd=1.1（n=9）。因此，该方法回收率很好，适用于生产需求。
[0077]
实施例5与现有检测方法的对比试验将同一发酵液采用本发明的方法和现有常用的检测方法进行检测。各个检测方法的具体操作如下：分光光度计显色法：
①
先制备0、2、4、6、8ppm5-ala标准液（每次现配）各1ml，待测样品1ml于15ml离心管中。
②
再依次分别加入0.5ml乙酸钠缓冲液（1m,ph4.6）、25μl乙酰丙酮，震荡均匀，离心一分钟（4000r/min），离心后沸水浴15min。
③
冷却到室温后振荡均匀，离心一分钟（4000r/min），离心结束后再每个离心管中分别加入1.525ml的ehrlish’s试剂（42ml冰醋酸、8ml70%高氯酸、1g二甲氨基苯甲醛），震荡均匀后，显色10min，在553nm波长下检测吸光值，绘制标准曲线，得标准曲线后代入样品检测吸光值进行计算丹黄酰氯（dst)柱前衍生法：
①
样品处理：将发酵液先冷冻离心5min去除大分子杂质，取上清液0.2ml加入同体积40%三氯乙酸，离心5分钟（13000r/min），得待测样品。
②
取待测样品100ul加入100μl丹黄酰氯溶液（28.8mmol/l）在30℃温度下避光衍生1h后，取200μl盐酸溶液（0.01mol/l）中止反应，加入0.9ml水稀释，于常规的紫外检测器上微滤进样测定。
[0078]
本发明的操作方法同实施例2中2.12的方法。
[0079]
3种方法的对比如表10所示：
[0080]
通过上述不同方法的对比可见：1、本发明的方法可以同时检测发酵液中5-ala和甘氨酸的含量，且其用时用时短只有25min，具有很好的时效性，能够满足生产中的及时监控，而现有技术检测平均时长均为2小时；2、本发明的方法检测5-ala和甘氨酸的含量的浓度范围广；3、本发明的方法前处理时间短，减少了前处理步骤，无需进行除蛋白步骤，衍生时间以及条件都有极大的优化，由1小时缩短至3-5分钟,缩短检测时长的同时更有利于试验
操作的准确性。
[0081]
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
[0082]
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

技术特征：
1.一种发酵液中5-氨基乙酰丙酸和甘氨酸含量的测定方法，其特征在于，使用hplc-荧光法进行测定，具体步骤如下：步骤1）取发酵液5ml于离心管中，4000r/min离心5分钟；步骤2）取上述离心管中的上清液0.1ml置于100ml容量瓶中，定容，摇匀；步骤3）取上述容量瓶中的溶液100μl于1.5ml离心管中，加入100μl的0.1%的荧光胺丙酮溶液，再加入200μl的bbs缓冲液，再加入100μl的0.5%三乙胺溶液，使用振荡器震荡1min，静置3-5min后，微滤到进样瓶中，进行检测；其中，色谱条件及程序设置为：流动相为：a相：0.1%三氟乙酸溶液；b相：乙腈； 采用梯度洗脱方式；色谱柱温度：35℃；进样体积：10μl；激发波长：398nm；发射波长：480nm；流速：1.4ml/min。2.根据权利要求1所述发酵液中5-氨基乙酰丙酸和甘氨酸含量的测定方法，其特征在于，所述bbs缓冲液为0.46g十四水硼酸钠和0.51g硼酸溶解定容到100ml容量瓶。3.根据权利要求1所述发酵液中5-氨基乙酰丙酸和甘氨酸含量的测定方法，其特征在于，所述梯度洗脱方式的ab相比例和程序如下表所示：。

技术总结
本发明涉及一种发酵液中5-氨基乙酰丙酸和甘氨酸含量的测定方法，使用HPLC-荧光法进行测定，其中，色谱条件及程序设置为：流动相为：A相：0.1%三氟乙酸溶液；B相：乙腈；采用梯度洗脱方式；色谱柱温度：35℃；进样体积：10μL；激发波长：398nm；发射波长：480nm；流速：1.4mL/min。本发明的方法可以同时检测发酵液中5-氨基乙酰丙酸和甘氨酸含量，解决了采用常规HPLC-荧光法进行测定时，图谱中存在峰形未分离、峰未回归基线、峰形不对称、峰形存在扫尾等问题，回收率很好，适用于生产需求；本发明的方法用时短，只需25min，操作简单，重复性和准确度高，为高效生产5-ALA提供了有力的保障。ALA提供了有力的保障。ALA提供了有力的保障。


技术研发人员：梁艺超 华跃飞 李爽 张广民 蔡辉益
受保护的技术使用者：天津博菲德科技有限公司
技术研发日：2023.08.24
技术公布日：2023/10/5