一种同时生产生长素和细胞分裂素的5406链霉菌发酵方法与流程

1.本发明涉及微生物发酵技术领域，具体涉及一种同时生产生长素和细胞分裂素的5406链霉菌发酵方法。


背景技术：

2.5406链霉菌，又称泾阳链霉菌（streptomyces jingyanggensis），是植物根际促生菌(plant growth promoting rhizobacteria，pgpr)的典型代表。5406链霉菌在我国作为抗生菌肥料已有多年，是从我国陕西泾阳等地土壤中分离到的，通过分类研究定名为泾阳链霉菌，5406为这个新种的典型菌株，在中国农业微生物菌种保藏管理中心菌种保藏号为accc40021，在中国普通微生物菌种保藏管理中心的保藏编号为4.891。5406链霉菌不仅能抑制30多种病原菌的生长，同时还具有刺激植物生根、发芽等性能。5406链霉菌能产生抗病物质起到防治植物病害的作用，但其产生的具体物质、以及同时生产生长素和细胞分裂素的发酵方法尚无报道。


技术实现要素：

3.本发明旨在提供一种同时生产生长素和细胞分裂素的5406链霉菌发酵方法，以填补现有技术的空白。
4.本发明技术方案如下：一种同时生产生长素和细胞分裂素的5406链霉菌发酵方法，包括以下步骤：（1）5406链霉菌活化；（2）培养基配方及配制：在高氏一号液体培养基中添加色氨酸和乳糖（lactobiose，cas号：63-42-3）；（3）5406链霉菌培养：取活化后的5406链霉菌单菌落，接种在步骤（2）所述培养基中，震荡培养。
5.优选的，色氨酸和乳糖在培养基中的添加量分别为色氨酸10~12 g/l、乳糖20~60 g/l。
6.优选的，色氨酸和乳糖在培养基中的添加量分别为色氨酸11g/l、乳糖40g/l。
7.优选的，震荡培养的条件为转速250
±
50 rpm、温度30
±
2℃。
8.优选的，震荡培养的时间为至少5 d。
9.优选的，震荡培养的时间为5-6 d。
10.优选的，所述生长素包括吲哚-3-乙酸、吲哚-3-乳酸、吲哚-3-甲酸。
11.优选的，所述细胞分裂素包括呋喃甲基腺嘌呤-9-葡萄糖苷、玉米素。
12.与现有技术相比，本发明的有益成果在于：（1）本发明提供了一种同时生产生长素和细胞分裂素的5406链霉菌发酵方法，填补了5406链霉菌同时生产生长素和细胞分裂素的发酵技术方面的空白。
13.（2）本发明在高氏一号培养基的基础上，同时添加色氨酸和乳糖进行发酵，可同时
生产得到多种生长素和细胞分裂素。
14.（3）本发明方法简单、操作方便，利于科研工作者的研究。
附图说明
15.图1：质谱多反应监测模式（mrm）示意图。
具体实施方式
16.为使本领域技术人员更好的理解本发明技术内容，下面结合具体实施例和附图对本发明做进一步的说明。
17.实施例1 一种同时生产生长素和细胞分裂素的5406链霉菌发酵方法(1)5406链霉菌活化：将5406链霉菌菌种（来源于中国普通微生物菌种保藏管理中心，编号cgmcc 4.891）从-80℃ 取出，在pda无抗平板上划线，30
±
2℃培养2-3天。
18.(2)培养基配方及配制：配制高氏一号液体培养基（可溶性淀粉20g/l、kno31g/l、k2hpo40.5g/l、mgso4· 7h2o 0.5g/l、nacl 0.5g/l、feso4· 7h2o 0.01g/l、ph=7.4-7.6）。配制时，先用少量冷水，将淀粉调成糊状，倒入少于所需水量的沸水中，在火上加热，边搅拌边依次逐一溶化其他成分。添加色氨酸10g/l和乳糖20g/l，溶化后，补足水分到1000ml，调ph，121℃灭菌20min。
19.(3)5406链霉菌培养：从活化的pda平板挑起单菌落，接种在步骤（2）配制的培养基中，250
±
50 rpm、30
±
2℃震荡培养5-6 d（本例优选6d）。
20.(4)激素含量测定：发酵液10000rpm离心10 min，去沉淀取上清液，采用lc-ms/ms法测定生长素、细胞分裂素含量。
21.测试方法如下：样本前处理：移取50 μl样本，分别加入10 μl浓度为100 ng/ml的内标混合溶液，混匀，浓缩至干；浓缩后用100 μl 80%甲醇/水溶液复溶，过0.22 μm滤膜，置于进样瓶中，用于lc-ms/ms分析。
22.色谱质谱采集条件：数据采集仪器系统主要包括超高效液相色谱（ultra performance liquid chromatography，uplc）（exionlc
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ad，https://sciex.com.cn/）和串联质谱（tandem mass spectrometry，ms/ms）（qtrap
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6500+，https://sciex.com.cn/）。
23.液相条件主要包括：1）色谱柱：waters acquity uplc hss t3 c18柱（1.8
ꢀµ
m，100 mm
×
2.1 mm i.d.）；2）流动相：a相，超纯水（加入0.04%的乙酸）；b相，乙腈（加入0.04%的乙酸）；3）梯度洗脱程序：0 min a/b为95:5（v/v），1.0 min a/b为95:5（v/v），8.0 min为5:95（v/v），9.0 min为5:95（v/v），9.1 min为95:5（v/v），12.0 min为95:5（v/v）；4）流速0.35 ml/min；柱温40
°
c；进样量2 μl。
24.质谱条件主要包括：电喷雾离子源（electrospray ionization，esi）温度550
ꢀ°
c，正离子模式下质谱
电压 5500 v，负离子模式下质谱电压-4500 v，气帘气（curtain gas，cur）35 psi。在q-trap 6500+中，每个离子对是根据优化的去簇电压（declustering potential，dp）和碰撞能（collision energy，ce）进行扫描检测。
25.定性与定量：基于标准品构建mwdb（metware database）数据库，对质谱检测的数据进行定性分析。
26.定量是利用三重四级杆质谱的多反应监测模式（multiple reaction monitoring，mrm，如图1）分析完成。mrm模式中，四级杆首先筛选目标物质的前体离子（母离子），排除掉其他分子量物质对应的离子以初步排除干扰；前体离子经碰撞室诱导电离后断裂形成多个碎片离子，碎片离子再通过三重四级杆过滤选择出所需要的特征碎片离子，排除非目标离子干扰，使定量更为精确，重复性更好。获得不同样本的质谱分析数据后，对所有目标物的色谱峰进行积分，通过标准曲线进行定量分析。
27.实施例2一种同时生产生长素和细胞分裂素的5406链霉菌发酵方法(1)5406链霉菌活化：将5406链霉菌菌种从-80℃取出，在pda无抗平板上划线，30
±
2℃培养2-3天。
28.(2)培养基配方及配制：配制高氏一号液体培养基（可溶性淀粉20g/l、kno31g/l、k2hpo40.5g/l、mgso4· 7h2o 0.5g/l、nacl 0.5g/l、feso4· 7h2o 0.01g/l、ph=7.4-7.6）。配制时，先用少量冷水，将淀粉调成糊状，倒入少于所需水量的沸水中，在火上加热，边搅拌边依次逐一溶化其他成分。添加色氨酸11g/l和乳糖40g/l，溶化后，补足水分到1000ml，调ph，121℃灭菌20min。
29.(3)5406链霉菌培养：从活化的pda平板挑起单菌落，接种在步骤（2）配制的培养基中，250
±
50 rpm、30
±
2℃震荡培养5-6 d（本例优选6d）。
30.(4)激素含量测定：发酵液10000rpm离心10 min，去沉淀取上清液，采用lc-ms/ms法测定生长素、细胞分裂素含量。
31.实施例3 一种同时生产生长素和细胞分裂素的5406链霉菌发酵方法(1)5406链霉菌活化：将5406链霉菌菌种从-80℃取出，在pda无抗平板上划线，30
±
2℃培养2-3天。
32.(2)培养基配方及配制：配制高氏一号液体培养基（可溶性淀粉20g/l、kno31g/l、k2hpo40.5g/l、mgso4· 7h2o 0.5g/l、nacl 0.5g/l、feso4· 7h2o 0.01g/l、ph=7.4-7.6）。配制时，先用少量冷水，将淀粉调成糊状，倒入少于所需水量的沸水中，在火上加热，边搅拌边依次逐一溶化其他成分。添加色氨酸12g/l和乳糖60g/l，溶化后，补足水分到1000ml，调ph，121℃灭菌20min。
33.(3)5406链霉菌培养：从活化的pda平板挑起单菌落，接种在步骤（2）配制的培养基中，250
±
50 rpm、30
±
2℃震荡培养5-6 d（本例优选6d）。
34.(4)激素含量测定：发酵液10000rpm离心10 min，去沉淀取上清液，采用lc-ms/ms法测定生长素、细胞分裂素含量。
35.对比例1 一种同时生产生长素和细胞分裂素的5406链霉菌发酵方法(1)5406链霉菌活化：将5406链霉菌菌种从-80℃取出，在pda无抗平板上划线，30
±
2℃培养2-3天。
36.(2)培养基配方及配制：配制高氏一号液体培养基（可溶性淀粉20g/l、kno31g/l、k2hpo40.5g/l、mgso4
· 7h2o 0.5g/l、nacl 0.5g/l、feso4· 7h2o 0.01g/l、ph=7.4-7.6）。配制时，先用少量冷水，将淀粉调成糊状，倒入少于所需水量的沸水中，在火上加热，边搅拌边依次逐一溶化其他成分。溶化后，补足水分到1000ml，调ph，121℃灭菌20min。
37.(3)5406链霉菌培养：从活化的pda平板挑起单菌落，接种在步骤（2）配制的培养基中，250
±
50 rpm、30
±
2℃震荡培养5-6 d（本例优选6d）。
38.(4)激素含量测定：发酵液10000rpm离心10 min，去沉淀取上清液，采用lc-ms/ms法测定生长素、细胞分裂素含量。
39.对比例2一种同时生产生长素和细胞分裂素的5406链霉菌发酵方法(1)5406链霉菌活化：将5406链霉菌菌种从-80℃取出，在pda无抗平板上划线，30
±
2℃培养2-3天。
40.(2)培养基配方及配制：配制高氏一号液体培养基（可溶性淀粉20g/l、kno31g/l、k2hpo40.5g/l、mgso4· 7h2o 0.5g/l、nacl 0.5g/l、feso4· 7h2o 0.01g/l、ph=7.4-7.6）。配制时，先用少量冷水，将淀粉调成糊状，倒入少于所需水量的沸水中，在火上加热，边搅拌边依次逐一溶化其他成分。添加色氨酸11g/l，溶化后，补足水分到1000ml，调ph，121℃灭菌20min。
41.(3)5406链霉菌培养：从活化的pda平板挑起单菌落，接种在步骤（2）配制的培养基中，250
±
50 rpm、30
±
2℃震荡培养5-6 d（本例优选6d）。
42.(4)激素含量测定：发酵液10000rpm离心10 min，去沉淀取上清液，采用lc-ms/ms法测定生长素、细胞分裂素含量。
43.对比例3一种同时生产生长素和细胞分裂素的5406链霉菌发酵方法(1)5406链霉菌活化：将5406链霉菌菌种从-80℃取出，在pda无抗平板上划线，30
±
2℃培养2-3天。
44.(2)培养基配方及配制：配制高氏一号液体培养基（可溶性淀粉20g/l、kno31g/l、k2hpo40.5g/l、mgso4· 7h2o 0.5g/l、nacl 0.5g/l、feso4· 7h2o 0.01g/l、ph=7.4-7.6）。配制时，先用少量冷水，将淀粉调成糊状，倒入少于所需水量的沸水中，在火上加热，边搅拌边依次逐一溶化其他成分。添加乳糖40g/l，溶化后，补足水分到1000ml，调ph，121℃灭菌20min。
45.(3)5406链霉菌培养：从活化的pda平板挑起单菌落，接种在步骤（2）配制的培养基中，250
±
50 rpm、30
±
2℃震荡培养5-6 d（本例优选6d）。
46.(4)激素含量测定：发酵液10000rpm离心10 min，去沉淀取上清液，采用lc-ms/ms法测定生长素、细胞分裂素含量。
47.为了说明本发明的效果，分别统计了前述实施例和对比例的生长素和细胞分裂素浓度。每组3次重复。结果见下表。
48.注：呋喃甲基腺嘌呤-9-葡萄糖苷，英文名称：kinetin-9-glucoside，cas号：98177-43-6 ，也叫激动素-9-葡萄糖苷。
49.研究结果表明，比较实施例和对比例可知，本发明在高氏一号培养基基础上，同时添加10~12 g/l色氨酸和20~60g/l乳糖，5406链霉菌可同时发酵生产生长素和细胞分裂素，其中吲哚-3-乙酸的含量最高。
50.以上所述仅为本发明的部分实施例而已，并不用限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种同时生产生长素和细胞分裂素的5406链霉菌发酵方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）5406链霉菌活化；（2）培养基配方及配制：在高氏一号液体培养基中添加色氨酸和乳糖；（3）5406链霉菌培养：取活化后的5406链霉菌单菌落，接种在步骤（2）所述培养基中，震荡培养。2.根据权利要求1所述的一种同时生产生长素和细胞分裂素的5406链霉菌发酵方法，其特征在于，色氨酸和乳糖在培养基中的添加量分别为色氨酸10~12 g/l、乳糖20~60 g/l。3.根据权利要求1所述的一种同时生产生长素和细胞分裂素的5406链霉菌发酵方法，其特征在于，色氨酸和乳糖在培养基中的添加量分别为色氨酸11g/l、乳糖40 g/l。4.根据权利要求1所述的一种同时生产生长素和细胞分裂素的5406链霉菌发酵方法，其特征在于，震荡培养的条件为转速250
±
50 rpm、温度30
±
2℃。5.根据权利要求1所述的一种同时生产生长素和细胞分裂素的5406链霉菌发酵方法，其特征在于，震荡培养的时间为至少5 d。6.根据权利要求1所述的一种同时生产生长素和细胞分裂素的5406链霉菌发酵方法，其特征在于，震荡培养的时间为5-6 d。7.根据权利要求1所述的一种同时生产生长素和细胞分裂素的5406链霉菌发酵方法，其特征在于，所述生长素包括吲哚-3-乙酸、吲哚-3-乳酸、吲哚-3-甲酸。8.根据权利要求1所述的一种同时生产生长素和细胞分裂素的5406链霉菌发酵方法，其特征在于，所述细胞分裂素包括呋喃甲基腺嘌呤-9-葡萄糖苷、玉米素。

技术总结
本发明公开了一种同时生产生长素和细胞分裂素的5406链霉菌发酵方法，该方法是在普通高氏一号培养基中添加添加色氨酸和乳糖进行5406链霉素培养同时生产获得细胞分裂素和生长素。本发明首次解决同时产生获得细胞分裂素和生长素的5406链霉菌发酵的问题，操作简单。操作简单。操作简单。


技术研发人员：李春强 熊国如 常凯军 孙建波 彭明 郑玉华 熊林艳 李淑霞
受保护的技术使用者：海南环农生物科技有限公司
技术研发日：2023.08.29
技术公布日：2023/10/5