一种激光诱导石墨烯PCR检测装置及方法与流程

一种激光诱导石墨烯pcr检测装置及方法
技术领域
1.本发明属于酶、核酸或微生物的测定或检验技术领域，具体涉及一种激光诱导石墨烯pcr检测装置及方法。


背景技术：

2.聚合酶链式反应技术（pcr）是一种用于放大扩增特定的dna片段的分子生物学技术，因其快速、灵敏、特异和准确等优点，被广泛应用于细菌、真菌、病毒和寄生虫的快速检测和鉴定，以及疾病的早期筛查与诊断中。pcr是利用dna在体外95℃高温时变性会变成单链，低温（通常是60℃左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至dna聚合酶最适反应温度（72℃左右），dna聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。基于pcr反应原理，一个完整的pcr反应过程中会经过变性（90～95℃）—退火（40～60℃）—延伸（70～75℃）三个阶段，并且将上述阶段循环往复45次。因此，pcr反应过程中，控温模块的升降温速度，决定了pcr反应速度。提高控温模块的升降温速度，即能够有效提升pcr反应速度。
3.传统的pcr仪器需要采用专用热循环设备，并且采用风扇等辅助降温方式，提供pcr反应所需的温度。例如cn110551622a公开了一种快速pcr反应芯片以及快速荧光定量检测仪，包括面板与底膜，面板底表面开设至少一处反应池，反应池不贯通面板，反应池两侧开设有加样孔和排气孔与面板顶面连通，在面板底面附着底膜，面板为透光材质。当pcr芯片置于温控模块上，底膜紧贴温控模块，加样后底膜上方反应池中的pcr反应液与温控模块仅间隔一层底膜，温控模块的制冷量或制热量可以快速穿过底膜传导至pcr反应液。cn107603874a公开了一种微流控pcr检测系统，包括微流控pcr芯片、加样装置、热循环装置以及荧光采集装置，其中，所述微流控pcr芯片包括基底部、腔室部、密封盖及加气口；所述加样装置用于在所述亲水单元处投加待检测样品，于所投加的待检测样品上方形成密封油层，以及由所述加气口向所述反应腔室内注入气体；所述热循环装置用于对所述基底进行加热，以使所述待检测样品进行热循环扩增；所述荧光采集装置用于对热循环扩增后的所述待检测样品进行荧光信号采集，并可将采集信号向外输出。
4.这类热循环设备价格昂贵、体积大、系统复杂、需要采用220v的电源供电，且升降温速率较慢（4~5 ℃/s），从而使得pcr技术几乎完全在大型集中式的临床实验室或检测中心，不能有效的应用于即时快速检测领域。


技术实现要素：

5.基于上述问题，本发明中提出一种激光诱导石墨烯pcr检测装置及方法，采用基于激光诱导石墨烯材料的超快速升降温芯片，以解决目前pcr仪热循环设备价格昂贵、体积大、系统复杂、需要采用220v的电源供电，且升降温速率较慢（4~5℃/s）的问题。
6.本发明完整的技术方案包括：一种激光诱导石墨烯pcr检测装置，包括pcr反应腔室，石墨烯加热器件，电源，以
及电源控制模块，石墨烯加热器件与电源相连接，电源由电源控制模块控制；所述电源控制模块控制电源对石墨烯加热器件进行通电/断电循环操作，所述石墨烯加热器件与pcr反应腔室接触，并在通电时对pcr反应腔室加热，断电时对pcr反应腔室冷却，以实现pcr反应腔室的升温/降温循环。
7.进一步的，所述电源为低压直流电源。
8.进一步的，所述电源包括但不限于电池、充电电池、移动电源、手机、电源供应器、220v电源。
9.进一步的，所述石墨烯加热器件为片状。
10.进一步的，所述石墨烯加热器件包括激光诱导石墨烯层和基底材料层，所述激光诱导石墨烯层位于在基底材料层表层，厚度为1 μm~20 μm。
11.进一步的，所述激光诱导石墨烯层为采用激光诱导加工还原前体材料层的方式制备得到，所述前体材料层位于基底材料层表面，激光诱导加工开始形成的激光通量为5.5 j/cm2。
12.进一步的，所使用的激光包括但不限于二氧化碳激光器、飞秒激光，所述基底材料层包括但不限于聚酰亚胺材料、聚酰亚胺薄膜、聚酰亚胺胶带、酚醛树脂、聚乙烯亚胺、木质纤维素、木材。
13.进一步的， 所述pcr检测装置为即时快速检测装置或高通量台式检测装置。
14.进一步的，所述pcr反应腔室为圆盘式pcr检测芯片，所述圆盘式pcr检测芯片包括上方的进样层和下方的检测层。
15.利用所述检测装置进行述pcr检测的方法，采用电源控制模块控制电源对石墨烯加热器件进行通电/断电循环，使pcr反应腔室的热循环45次。
16.相比现有技术，本发明具有如下优点：1．本发明提供了一种新型的基于激光诱导石墨烯升降温芯片，芯片通过激光诱导的方式进行制备，无需掩膜版，制备图案可根据实际需求自由设计、形貌可控、成分可调。制备方式简单，可批量制备，成本低廉，能够有效降低目前pcr仪热循环设备的成本，适用于现场快速检测场景。
17.2.本发明在制备形成的激光诱导石墨烯材料具有良好的机械坚固性和热稳定性，优异的导电性和导热性，能够通过电流热效应，快速产生热量和传导热量；同时具有良好的孔隙度，利于散热和降温。因此，激光诱导石墨烯升降温芯片仅通过对电压的控制，即可实现超快速升降温。施加低电压，便可实现超快速升温（》10 ℃/s）；关闭电压后，便可依托良好的孔隙度，自主实现超快速降温（》10 ℃/s），无需其他辅助降温方式，减小扩增芯片和设备的体积，有效应用于即时快速检测领域。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
18.图1为本发明的激光诱导石墨烯升降温芯片制备过程示意图。
19.图2为激光诱导石墨烯升降温芯片连接示意图。
20.图3为使用激光诱导石墨烯升降温芯片进行检测过程的示意图。
21.图4为激光诱导石墨烯升降温芯片实测升降温性能图。
22.图5为本发明的激光诱导石墨烯升降温芯片热传导途径与传统的pcr仪对比。
23.图6为pcr反应腔室的结构示意图。
24.图中：1-激光器；2-激光诱导石墨烯升降温芯片；3-基底材料层；4-电源；5-电源控制模块；6-pcr反应腔室，7-进样层，8-检测层，9-试纸条，10-密封塞，11-旋转柱，12-注入口，13-环形滑轨，14-进样腔，15-前洗样腔，16-后洗样腔，17-扩增反应腔，18-检测腔，19-观察窗，20-试纸条凹槽。
具体实施方式
25.下面将结合本技术实施方式中的附图，对本技术的实施方式中的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施方式仅仅是作为例示，并非用于限制本技术。
26.本发明首先公开了一种采用激光诱导制备作为pcr检测加热器件的石墨烯片状材料的方法，以及由此得到的石墨片状材料，如图1所示，所述的方法包括：在制备过程中，提供具有含碳的特殊前体材料层，该前体材料层位于基底材料层3上，该前体材料层和基底材料层可以为一体的相同材料，也可以为分离的不同材料。前体材料包括但不限于聚酰亚胺、酚醛树脂、聚乙烯亚胺、木质纤维素、木材等，采用激光器1对上述含碳的特殊前体材料层表面进行直接扫描，激光辐照产生的局部热量使得前体材料表面碳化。在碳化过程中，碳原子由sp3键重组为sp2键，并且前体材料的氧、氮基团被分解，以获得激光诱导石墨烯升降温芯片2。所使用的激光器包括但不限于二氧化碳激光器、飞秒激光器等。
27.为了适应pcr检测装置的快速升降温需求，本实施方式激光诱导式石墨烯材料开始形成的激光通量为5.5 j/cm2，通过调整激光参数，调控激光诱导石墨烯材料的物理化学性质。通过增大激光功率，可以增大激光诱导石墨烯材料的厚度，增强导电性能，进而减小电阻。根据电流热效应（q=v2/r*t），在同样的输入电压条件下，电阻越小，相同时间内产生的热量越多，升温速度越快。同时，增大激光功率，在制备过程中，会提高气体的释放速率，从而增加气孔数量，增大激光诱导石墨烯材料的孔隙度及孔径，达到更快的降温速度。然而激光功率超过阈值，会导致激光诱导石墨烯材料结构破坏，丧失功能。因而本实施方式经过设计和实际验证，对激光诱导式石墨烯材料开始形成的激光通量进行优化，选择5.5 j/cm2的激光通量，既可以得到完整的石墨烯结构，又能够得到数量多的气孔数量和孔隙度，提高了换热效率，得到了更好的升降温性能。
28.为了适应pcr检测装置的快速升降温需求，本发明中的升降温芯片采用的是片状的激光诱导石墨烯结构，通过控制功率，将激光诱导石墨烯材料集中在基底前体材料层表层，厚度一般为1 μm~20 μm。
29.本发明同时公开了一种采用上述制备得到的石墨烯材料制备的pcr检测装置，如图2-3所示，包括pcr反应腔室6，石墨烯加热器件，低压直流电源4，以及电源控制模块5，其中石墨烯加热器件即为前面所得到的激光诱导石墨烯升降温芯片2，石墨烯加热器件贴紧pcr反应腔室，低压直流电源4为石墨烯加热器件供电后，实现超快速升温（》10℃/s）；关闭
电压后，依靠周围环境散热便可自主实现超快速降温（》10℃/s），无需其他辅助降温方式。实测升降温性能如图4所示，图中实线为设定温度，虚线为实际温度，从图中可以看到，实际温度与设定温度吻合良好。此外，供给电压的方式包括但不限于电池、充电电池、移动电源、手机、电源供应器、220v电源。
30.上述pcr反应微腔室体积为25 μl ~ 100 μl，可以装载荧光定量pcr反应试剂（一般为25 μl，包括酶、底物、引物、荧光分子以及目标检测物）。如图5所示，本发明中石墨烯升降温芯片紧贴pcr反应腔室，热量传导由石墨烯升降温芯片直接到pcr反应腔室中，相较于传统pcr仪，热量传导需要从传统的pcr仪加热材料到铝制基底板到薄层空气，最终到pcr反应腔室中，热传导效率高，热量损耗少，升降温速度快。减少了传统pcr仪中多步热量传导路径，有效提高了热传导效率，进一步提升反应速度。
31.本发明同时提供了一种对于上述检测的控制方法，具体的，控制方法包括热循环过程中电源对石墨烯加热器件的通电/断电时间（电源电压）控制，该通电/断电时间（电源电压）控制由电源的控制模块实现，根据环境条件（温度、风速等）实现不同条件下的升降温精确控制，循环45次。
32.如上所述，本发明提供了一种新型的基于激光诱导石墨烯升降温芯片，可自主实现超快速升降温。该芯片通过采用激光诱导加工方式制备，可以进行批量制备，成本低，可以改善目前pcr仪的控温模块，降低成本，提高pcr反应速度。除此之外，该基于激光诱导石墨烯升降温芯片可以有效应用于即时快速检测领域，从而推动pcr技术真正实现现场快速检测。并也可以用于高通量台式检测器件。
33.可选地，所述pcr反应腔室为一种圆盘式pcr检测芯片，具有上下两层结构，自上而下依次包括：进样层7和检测层8。
34.如图6所示，本发明进样层7的直径为60 mm，高度为3 mm，上表面上设有凸起高度为5mm的旋转柱11，可以用手指推动操作使进样层转动。旋转柱11一侧设有直径4mm、高度2mm的注入口12，以及与注入口12大小匹配的密封塞10，加样之后用于密封注入口，防止污染。
35.检测层8的直径为60mm，高度为7mm。检测层8的上表面外侧设有环形滑轨13，对应的，进样层的下表面设有环形滑块，上述滑轨滑块可以使进样层在检测层中转动，进样层转动时，进样层中的纤维素滤纸可通过转动进入不同的反应腔。
36.注入口12下方设有滤纸固定孔，用于镶嵌纤维素滤纸。纤维素滤纸被剪切成直径为6mm的圆形，用3m胶带粘贴到注入口的下方，并能够完全覆盖注入口，以便进样后液体直接被纤维素滤纸吸收，当样本被吸附到纤维素滤纸上，带负电荷的大分子dna卷曲与纤维素滤纸基质紧密结合。
37.在检测层8上以外直径50mm、内直径40mm的圆环形式切割出各个反应腔室。依次包括进样腔14、前洗样腔15、后洗样腔16、扩增反应腔17和检测腔18。反应腔之间单独独立，防止相互漏液。检测腔内设置试纸条进样孔，并用石蜡密封。
38.其中前洗样腔15和后洗样腔16容纳500μl洗涤缓冲液，如tris缓冲液、te缓冲液、fta卡纯化试剂等；扩增反应腔17容纳50μl反应缓冲液，包括rpa试剂、lamp试剂等；检测腔18容纳100μl运行缓冲液，如tris缓冲液、te缓冲液等。试纸条进样孔由石蜡密封。选择熔点在60℃左右的石蜡，在扩增反应完成后，转动纤维素滤纸至检测腔，使纤维素滤纸10中的产
物与检测腔18中的反应缓冲液混合，然后，提高该部位的加热装置的温度至60℃左右，融化石蜡，使液体下落到试纸条9上；试纸条凹槽20位于检测层8背面，与试纸条进样孔相通；观察窗19位于试纸条凹槽中，为椭圆形通孔，便于肉眼查看免疫试纸条的结果。
39.进样层和检测层进行了表面疏水处理，即将两层结构与三氯(1h,1h,2h,2h-全氟辛基)硅烷试剂在真空中抽取三个小时，使硅烷在无机物表面形成自组装的单分子层，增加其疏水性，防止漏液。
40.pcr反应腔室上下两层扣在一起，整体形成密封空间，防止液体漏出。正面可根据检测层的进样腔、前洗样腔、后洗样腔、扩增反应腔，标记数字
①
、
②
、
③
、
④
等，模仿旋转号盘电话机的外形，通过转动，使纤维素滤纸进入不同反应腔，分别实现进样、洗涤、扩增三个过程。
41.采用pcr方式进行核酸检测时，本发明采用纤维素滤纸作为核酸检测的吸附材料，可以快速结合来自复杂生物样品的核酸，经过简单的洗涤步骤，将其保留并能够直接释放到扩增反应体系中。本发明中探究了不同材料的纤维素滤纸结合血液中核酸的能力。发现fta卡对唾液、尿液、血液、血清等体液中的核酸均能迅速捕获。因此，利用基于纤维素滤纸从不同生物样本中纯化核酸的快速且经济实惠的方法，为本发明的pcr检测芯片在资源有限的环境进行快速、即时检测提供了关键的技术手段。
42.当完成核酸提取后，在对核酸扩增产物检测时，采用免疫试纸条用于核酸扩增后的产物检测，免疫试纸条装载于试纸条凹槽，并将样品垫置于试纸条进样孔的下方，检测线和质控线位于试纸条凹槽中观察窗的下方。
43.以核酸恒温扩增检测血液中的egfr基因为例。将纤维素滤纸与免疫试纸条应用于本发明的pcr检测芯片，在前洗样腔和后洗样腔中分别加入500μl的tris缓冲液，在扩增反应腔中加入50μl的环介导等温扩增反应缓冲液，在检测腔中加入100μl的te缓冲液作为运行缓冲液。在正常人血液中加入一定浓度的egfr质粒，使其终浓度分别达到105copies/ml、104copies/ml、103copies/ml、102copies/ml。取15μl该系列样本分别注入到本发明的pcr检测芯片的注入口，使核酸质粒吸附到纤维素滤纸上。经过两次洗涤后，将纤维素滤纸置于核酸扩增反应缓冲液，打开加热装置使扩增反应腔的温度升高至65℃进行核酸扩增。40分钟后，反应完成。将纤维素滤纸转动至检测腔，利用运行缓冲液稀释纤维素滤纸上的扩增产物，并升高该反应腔温度至80℃，使检测腔内的石蜡融化，并通过试纸条进样孔通过毛细力吸收到免疫试纸条上进行显色反应。反应结果通过观察窗可进行肉眼直观判读，免疫试纸条
①
、
②
、
③
、
④
、
⑤
分别为105copies/ml、104copies/ml、103copies/ml、102copies/ml和空白对照，其中免疫试纸条
①
、
②
、
③
均在检测线和质控线显示红色条带，免疫试纸条
④
和
⑤
只在质控线显示红色条带，说明本发明的pcr检测芯片可达到103copies/ml的检测限。
44.因此，本发明设计的一种低成本、便携式的、现场核酸快速pcr检测芯片，通过简单的转动操作，即可满足快速、现场检测核酸的需求，特别是在资源有限的地区。其优势在于：（1）模仿旋转号盘电话机的外形，设计了一种圆盘式pcr检测芯片，仅需手指旋转柱，即可实现包括核酸提取、洗涤和扩增在内的整个过程，对实验操作人员技术要求低。集成化程度高，试剂及样本消耗量小，仅需要检验者的一滴血或者其他体液，即可实现样本进，结果出。最后用免疫试纸条可直接人工读取检测结果，无需任何仪器。
45.（2）圆盘式pcr检测芯片易于生产，成本较低，包括pcr检测芯片的制备、核酸扩增
反应缓冲液、酶和引物等所有元素。
46.（3）检测时间小于60分钟，包括核酸提取和核酸扩增，有利于病原体的快速即时筛查。
47.一种基于圆盘式pcr检测芯片的核酸检测方法，包括以下五个步骤：步骤1，将进样层的注入口旋转于检测层的进样腔上方，进样。一定量的体液如血液、血清、尿液、唾液等采用移液枪通过注入口注入到纤维素滤纸表面。等待3-5分钟，使液体干燥。纤维素滤纸中的特殊化学物质能够自主裂解体液中的体液中的细胞，并与带负电荷的核酸结合。
48.步骤2，用手指拨动进样层的旋转柱，将纤维素滤纸转动至前洗样腔，等待2分钟，洗去纤维素滤纸表面的杂质，如细胞、蛋白质、酚类等。轻微左右拨动旋转柱可加快洗涤速度。
49.步骤3，再次拨动进样层的旋转柱，将纤维素滤纸转动至后洗样腔，再次等待2分钟，使洗涤更充分。轻微左右拨动旋转柱可加快洗涤速度。
50.步骤4，拨动进样层的旋转柱，将纤维素滤纸转动至扩增反应腔。然后打开加热装置。当温度上升到一定程度，扩增反应腔中的反应缓冲液就会和纤维素滤纸上的核酸进行扩增反应，不限于恒温扩增反应和pcr反应。
51.步骤5，反应完成后，再次转动使纤维素滤纸转动至检测腔。纤维素滤纸上的扩增产物与通过连通孔被免疫试纸条上的样品垫吸收，并在检测线和质控线显示结果。通过试纸条凹槽上的观察窗可用肉眼观察结果。
52.综合所述，证明上述装置对于在资源有限的环境中扩大对临床病原体分子检测、流行病学调查、食品检验检疫等领域具有较大的社会经济效益。
53.以上申请的仅为本技术的一些实施方式。对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本技术创造构思的前提下，还可以做出若干变型和改进，这些都属于本技术的保护范围。

技术特征：
1.一种激光诱导石墨烯pcr检测装置，其特征在于，包括pcr反应腔室，石墨烯加热器件，电源，以及电源控制模块，石墨烯加热器件与电源相连接，电源由电源控制模块控制；所述电源控制模块控制电源对石墨烯加热器件进行通电/断电循环操作，所述石墨烯加热器件与pcr反应腔室接触，并在通电时对pcr反应腔室加热，断电时对pcr反应腔室冷却，以实现pcr反应腔室的升温/降温循环。2.根据权利要求1所述的一种激光诱导石墨烯pcr检测装置，其特征在于，所述电源为低压直流电源。3.根据权利要求1所述的一种激光诱导石墨烯pcr检测装置，其特征在于，所述电源包括但不限于电池、充电电池、移动电源、手机、电源供应器、220v电源。4.根据权利要求1-3任一项所述的一种激光诱导石墨烯pcr检测装置，其特征在于，所述石墨烯加热器件为片状。5.根据权利要求1-3任一项所述的一种激光诱导石墨烯pcr检测装置，其特征在于，所述石墨烯加热器件包括激光诱导石墨烯层和基底材料层，所述激光诱导石墨烯层位于在基底材料层表层，厚度为1 μm~20 μm。6.根据权利要求5所述的一种激光诱导石墨烯pcr检测装置，其特征在于，所述激光诱导石墨烯层为采用激光诱导加工还原前体材料层的方式制备得到，所述前体材料层位于基底材料层表面，激光诱导加工开始形成的激光通量为5.5 j/cm2。7.根据权利要求6所述的一种激光诱导石墨烯pcr检测装置，其特征在于，所使用的激光包括但不限于二氧化碳激光器、飞秒激光，所述基底材料层包括但不限于聚酰亚胺材料、聚酰亚胺薄膜、聚酰亚胺胶带、酚醛树脂、聚乙烯亚胺、木质纤维素、木材。8.根据权利要求1所述的一种激光诱导石墨烯pcr检测装置，其特征在于， 所述pcr检测装置为即时快速检测装置或高通量台式检测装置。9.根据权利要求1所述的一种激光诱导石墨烯pcr检测装置，其特征在于，所述pcr反应腔室为圆盘式pcr检测芯片，所述圆盘式pcr检测芯片包括上方的进样层和下方的检测层。10.利用权利要求1-8任一项所述检测装置进行述pcr检测的方法，其特征在于，采用电源控制模块控制电源对石墨烯加热器件进行通电/断电循环，使pcr反应腔室的热循环45次。

技术总结
本发明属于酶、核酸或微生物的测定或检验技术领域，具体公开了一种激光诱导石墨烯PCR检测装置及方法，装置包括PCR反应腔室，石墨烯加热器件，电源，以及电源控制模块，石墨烯加热器件与电源相连接，电源由电源控制模块控制；所述电源控制模块控制电源对石墨烯加热器件进行通电/断电循环操作，所述石墨烯加热器件与PCR反应腔室接触，并在通电时对PCR反应腔室加热，断电时对PCR反应腔室冷却，以实现PCR反应腔室的升温/降温循环，本装置的石墨烯加热器件采用激光诱导加工方式制备，可实现超快速升温与超快速降温，无需其他辅助降温方式，可为聚合酶链式反应PCR提供理想的反应温度。为聚合酶链式反应PCR提供理想的反应温度。为聚合酶链式反应PCR提供理想的反应温度。


技术研发人员：王杨
受保护的技术使用者：北京芯畅科技有限公司
技术研发日：2023.08.30
技术公布日：2023/10/5