在使用高保真DNA聚合酶的基于RHPCR的扩增子测序中减少引物二聚体和脱靶扩增的RNA酶H2突变体的制作方法

在使用高保真dna聚合酶的基于rhpcr的扩增子测序中减少引物二聚体和脱靶扩增的rna酶h2突变体
1.相关申请的交叉引用
2.本技术根据35u.s.c.119要求于2020年12月24日提交的标题为“rnase h2 mutants that enhance mismatch discrimination and activity in high-fidelity polymerase buffer”美国临时专利申请序列号63/130,548，和于2021年11月9日提交的标题为“rnase h2mutants that reduce primer dimers and off-target amplification in rhpcr-based amplicon sequencing with high-fidelity dna polymerases”美国临时专利申请序列号63/277,273的优先权，其内容通过引用以其整体并入本文。
技术领域
3.本发明涉及ii型rna酶h(下文称为rna酶h2)杂合酶变体和切割核酸链以启动、辅助、监测或执行生物测定的方法。


背景技术：

4.rna酶h2酶家族已被广泛表征。这些酶对于切割嵌入dna序列(双链体形式)中的单个核糖核苷酸具有底物特异性(eder,等人,(1993)biochimie,75,123-126)。有趣的是，切割发生在rna残基的5'侧(参见方案i)。这些酶、它们的特性和在生物测定中的应用总结在walder等人美国专利号8,911,948b2中。
[0005][0006]
从超嗜热菌深海热球菌(pyrococcus abyssi)(p.a.)中分离出的rna酶h2酶在嵌入在其他方面完全由dna组成的核酸链中的核糖核苷酸的5'侧切割。rna酶h2依赖性pcr(rhpcr)提高了pcr的特异性，其中使用热稳定的rna酶h2酶切割在3'末端附近含有单个核糖核苷酸的引物，去除3'末端的阻断性基团(dobosy等人,2011；美国专利8,911,948b2)。该引物最初不能被dna聚合酶延伸，但在rna酶h2从3'末端去除阻断性基团后，引物能够被延伸。p.a.rna酶h2对核糖核苷酸附近dna-rna异源双链体中的单碱基错配敏感，并以大大降
低的速率切割包含错配的模板，这使得完全匹配的双链体优先被切割和延伸。这导致rhpcr反应的增加的特异性，并降低引物二聚体形成和其他脱靶扩增。
[0007]
尽管rhpcr增强了pcr的特异性，但它目前有局限性。rhpcr的明显错配辨别低于理论上应达到的水平。wt p.a.rna酶h2在很大程度上识别与rna碱基直接相对的单碱基错配，但效率因错配的性质而异。此外，天然酶在rna碱基的直接5'或3'位置的错配识别相对有限。尽管有此限制，但在这些位置放置突变可能是有利的。例如，在引物切割后的pcr扩增中，rna的直接5'的错配可用作二次选择步骤，其中使用区分性dna聚合酶(例如h784q水生栖热菌(thermus aquaticus)dna聚合酶)(参见美国专利申请序列号15/361280)。在rna的3'放置错配会降低模板转换的可能性，因为错配识别会在每个循环中发生，而不是在模板转换期间发生一次。
[0008]
尽管rhpcr的实用性，野生型p.a.rna酶h2的错配辨别可能会“渗漏”，导致引物二聚体的一些扩增。测序文库扩增过程中产生的引物二聚体存在问题，因为它们可以与illumina流通池结合并进行测序，但不提供任何有意义的数据。高水平的引物二聚体会降低映射到目的靶标的读段比例，最终降低测定灵敏度或需要显著增加测序成本以生成检测低频变异所需的中靶读段数量。低频变异检测也会受到pcr期间引入的扩增错误的影响。使用高保真dna聚合酶和优化的缓冲液条件可以降低错误率。然而，这些缓冲液条件降低了rhpcr中野生型p.a.rna酶h2的酶活性和错配敏感性。
[0009]
先前已经表明，通过野生型p.a.rna酶h2的氨基酸序列与来自其他相关物种的序列的部分重组产生的rna酶h2突变体的使用导致在高保真度dna聚合酶缓冲液中改进的rna酶h2酶活性。这些突变体中的两个，q48rsel29 rna酶h2和al07v sel29 rna酶h2在使用科达卡热球菌(kod)dna聚合酶反应缓冲液时显示具有改进的酶活性。此外，与野生型p.a rna酶h2相比，两种突变体都显示出增强的与rna碱基相对的以及rna碱基3'和5'错配的错配辨别。参见于2020年12月24日提交的标题为“rnase h2mutants that enhance mismatch discrimination and activity in high-fidelity polymerase buffer”(代理人案卷号idt01-018-pro)的美国临时专利申请序列号63/130,548，其内容通过引用以其整体并入。
[0010]
本公开涉及包含高保真dna聚合酶和缓冲液的多重rhampseq工作流程中的这些新颖杂合rna酶h2酶变体之一，q48r sel29 rna酶h2。与野生型p.a.rna酶h2相比，q48r sel29 rna酶h2减少pcr扩增过程中产生的引物二聚体，从而提高映射率和中靶率。在改进这些指标的同时，q48rsel29 rna酶h2对其他关键测序指标没有影响，包括扩增子均匀性、扩增子丢失率和扩增子均匀性分布。


技术实现要素：

[0011]
在第一方面，提供了杂合rna酶h2蛋白。杂合rna酶h2蛋白包括来自深海热球菌(pyrococcus abyssi)(p.a.)、科达卡热球菌(t.kod)和强烈火球菌(pyrococcus furiosus)生物体的氨基酸序列片段。
[0012]
在第二方面，提供了编码本文公开的任何杂合rna酶h2蛋白的重组核酸。
[0013]
在第三方面，提供了进行引物延伸的方法。该方法包括以下步骤：在适合于引物延伸方法的条件下，使本文公开的杂合rna酶h2蛋白与引物、多核苷酸模板、三磷酸核苷和dna聚合酶接触，从而产生延伸的引物。
[0014]
在第四方面，提供了一种反应混合物。反应混合物包括本文所述的杂合rna酶h2蛋白、至少一个引物、多核苷酸模板、三磷酸核苷和dna聚合酶。
[0015]
在第五方面，提供了一种用于进行rhpcr的方法。该方法包括用本文所述的杂合rna酶h2、dna聚合酶和引物进行引物延伸的步骤。
[0016]
在第六方面，提供了一种扩增靶dna序列的方法。该方法包括几个步骤。第一步骤是提供包括以下的反应混合物：(i)具有切割结构域的寡核苷酸引物，所述切割结构域可被rna酶h2酶切割，位于阻断性基团的5'，所述阻断性基团连接在所述寡核苷酸引物的3'末端处或附近，其中所述阻断性基团防止引物延伸和/或抑制寡核苷酸引物作为dna合成的模板；(ii)可以是或可以不是靶序列的样品核酸；(iii)dna聚合酶，和(iv)本文公开的杂合rna酶h2蛋白。第二步骤包括将所述寡核苷酸引物与所述靶dna序列杂交以形成双链底物。第三步骤是用所述杂合rna酶h2酶在所述切割结构域内或邻近所述切割结构域的切割位点处切割杂交的寡核苷酸引物，以从所述寡核苷酸引物除去所述阻断性基团。
[0017]
在第七方面，提供了用于产生延伸的引物的试剂盒。该试剂盒包括至少一个容器，该容器提供本文公开的杂合rna酶h2蛋白。
[0018]
在第八方面，提供了用于进行靶dna序列扩增的试剂盒。该试剂盒包括反应缓冲液，该反应缓冲液包含本文所述的rna酶h2和高保真古菌dna聚合酶。
[0019]
在第九方面，提供了一种制备模板核酸扩增子文库的方法。该方法包括几个步骤。第一步骤是形成一种混合物，其中包含核酸群体、至少阻断的可切割引物、杂合rna酶h2蛋白、dntp、dna聚合酶和缓冲液，以便在混合物中在至少所述阻断的可切割引物和所述核酸群体之间形成杂交双链体。第二步骤是用杂合rna酶h2蛋白切割所述至少一个阻断的可切割引物以产生至少一个能够通过dna聚合酶进行引物延伸的活性引物。第三步骤是在允许从所述核酸群体扩增一个或多个模板核酸的条件下，用所述dna聚合酶在所述缓冲液中延伸所述至少一个活性引物，从而生成模板核酸的扩增子。在第一方面，杂合rna酶h2蛋白选自q48r sel29(seq id no.:18)或其他。在第二方面，dna聚合酶是kod dna聚合酶，或其他高保真古菌dna聚合酶。在第三方面，缓冲液是高保真古菌dna聚合酶缓冲液。
[0020]
在第十方面，提供了一种进行大规模并行测序的方法。该方法包括几个步骤。第一步骤是在pcr方法中使用核酸群体、杂合rna酶h2突变蛋白、至少一个阻断的可切割引物、dna聚合酶、dntp和缓冲液来制备模板核酸文库群体。第二步骤是对来自所述模板核酸文库群体的多个期望模板核酸进行测序。在第一方面，杂合rna酶h2蛋白选自q48r sel29(seq id no.:18)或其他。
[0021]
在第十一方面，提供了一种从核酸模板扩增子文库中检测含snp的核酸模板的方法，所述方法包括：该方法包括几个步骤。第一步骤包括形成包含核酸模板扩增子文库的混合物；至少一个阻断的可切割引物；杂合突变体rna酶h2蛋白；dntp；dna聚合酶；和缓冲液。在混合物中的核酸模板扩增子文库中在至少阻断的可切割引物和含snp的核酸模板之间形成杂交双链体。第二步骤包括用杂合rna酶h2蛋白切割杂交双链体的至少一个阻断的可切割引物以生成至少一个能够通过dna聚合酶对杂交双链体进行引物延伸的活性引物。第三步骤包括在允许从所述核酸模板扩增子文库扩增一个或多个模板核酸的条件下，用dna聚合酶在缓冲液中延伸双链体中的至少一个活性引物，从而检测含snp的核酸模板。在第一方面，该方法包括选自q48r sel29(seq id no.:18)或其他的杂交突变体rna酶h2蛋白。在第
二方面，该方法包括缓冲液，该缓冲液是高保真古菌dna聚合酶缓冲液。
[0022]
在第十二方面，提供了一种进行环介导扩增反应的方法。该方法包括两个步骤。第一步骤包括形成包含核酸模板的混合物；四个阻断的可切割引物，其中所述阻断的可切割引物与作为rna酶h2蛋白底物的核酸模板形成双链体；rna酶h2蛋白，其中所述rna酶h2蛋白选自q48r sel29(seq idno.:18)或其他；dna聚合酶蛋白；dntp；和缓冲液。第二步骤包括用混合物进行等温扩增循环。
[0023]
在第十三方面，提供了一种进行具有减少的引物二聚体形成的rhpcr测定的方法。该方法包括用q48r sel29 rna酶h2(seq id no.:18)进行引物延伸。当与用野生型p.a.rna酶h2(seq id no.:1)进行的rhpcr测定相比时，减少的引物二聚体形成对应于在用q48r sel29 rna酶h2(seq id no.:18)进行的rhpcr测定期间减少的引物二聚体的量。
[0024]
在第十四方面，提供了一种rhpcr测定的方法，该测定对期望产物具有改进的映射率和中靶率。该方法包括用q48r sel29 rna酶h2(seq id no.:18)进行引物延伸。当与用野生型p.a.rna酶h2(seq id no.:1)进行的rhpcr测定相比时，改进的映射率和中靶率对应于在用q48r sel29rna酶h2(seq id no.:18)进行的rhpcr测定期间形成的期望产物的增加的映射和中靶扩增。
附图说明
[0025]
图1描绘了以下：示例性曲线图，其显示与野生型p.a.rna酶h2酶相比，使用突变体q48r sel29 rna酶h2酶时二聚体率在所有酶浓度下均降低(分图a)；示例性数据，其表明与野生型p.a.rna酶h2酶相比，使用突变体q48r sel29 rna酶h2酶时映射率在所有rna酶h2浓度下更高(分图b)；示例性数据，其表明与野生型p.a.rna酶h2酶相比，使用突变体q48r sel29 rna酶h2酶时中靶率在所有酶浓度下更高(分图c)。
[0026]
图2描述了每个鉴定的引物对的平均归一化二聚体计数的实例，其中与野生型p.a.rna酶h2酶相比，突变体q48r sel29 rna酶h2酶将鉴定的大多数引物二聚体减少了一半。
[0027]
图3描绘了示例性数据扩增子均匀度≥0.2x和扩增子均匀度≤0.05x(丢弃率)，其中文库的产量在突变体q48r sel29 rna酶h2酶和野生型p.a.rna酶h2酶之间在所有浓度下都相当(分图a)；在测试的不同浓度处，突变体q48r sel29 rna酶h2酶的总体扩增子均匀性≥0.2x与野生型p.a.rna酶h2酶相当(分图b)；以及在突变体q48r sel29 rna酶h2酶和野生型p.a.rna酶h2酶之间在测试的所有滴定浓度中，扩增子丢失率相似(分图c)。
[0028]
图4描绘了的示例性数据显示均匀性分布(与扩增子平均覆盖率相比，覆盖范围为0-0.1x、0.1-0.2x、0.2x-0.5x、0.5x-1.5x、1.5x-2.5x和2.5-5x的扩增子的百分比)在突变体q48r sel29 rna酶h2酶和野生型p.a.rna酶h2酶之间相当。
具体实施方式
[0029]
本发明提供了新颖的杂合rna酶h2酶变体，它们在使用某些dna聚合酶缓冲液的rhpcr期间增强酶活性，同时保留它们在双链体模板中保留或增强错配辨别的能力。rna酶h2酶杂合体组合来自深海热球菌(pyrococcus abyssi)(p.a.)、科达卡热球菌(t.kod)和强烈火球菌(pyrococcus furiosus)生物体的氨基酸序列片段。由此产生的杂合rna酶h2酶以
及基于这些酶选择的突变体显著增强错配辨别。特别地，在进行引物延伸、进行rhpcr、扩增靶dna序列、进行大规模平行测序、从核酸模板扩增子文库中检测含snp的核酸模板和进行环介导的扩增反应等方法中，q48r sel29 rna酶h2(seq id no.:18)显示产生的产物混合物相对于用野生型p.a.rna酶h2(seq id no.:1)产生的产物混合物具有减少的引物二聚体种类群体。
[0030]
定义
[0031]
为了帮助理解本发明，下面定义了几个术语。
[0032]
除非本文中另外指示或上下文明显相矛盾，否则在描述本发明的上下文中(特别是在以下权利要求的上下文中)使用术语“一个/一种(a/an)”和“该(the)”以及类似指示物将视为涵盖单数与复数两者。除非另作描述，否则术语“包含/包括”、“具有”、“包括”和“含有”将视为开放性术语(即意指“包括，但不限于”)。除非本文另外指示，否则本文有关值的范围的陈述仅意欲用作个别地提及在该范围内的每一独立值的简写方法，且每一独立值是并入说明书中，就如同在本文个别地陈述该值一般。在本文描述的所有方法能够以任何合适顺序进行，除非本文另外指明或另外与上下文明显相矛盾。本文提供的任何和所有示例或示例性语言(例如“比如”)的使用仅旨在更好地说明本发明并且除非另有声明，否则不构成对本发明范围的限制。说明书中的任何语言都不应当解释为指示任何未要求保护的要素为实践本发明所必需的。
[0033]
如本文所用，术语“核酸”和“寡核苷酸”指多聚脱氧核糖核苷酸(含有2-脱氧-d-核糖)、多聚核糖核苷酸(含有d-核糖)，以及任何其他类型的多核苷酸，其是n糖苷嘌呤或嘧啶碱基。术语“核酸”、“寡核苷酸”和“多核苷酸”之间在长度上没有意图的区别，并且这些术语将可互换使用。这些术语仅指分子的一级结构。因此，这些术语包括双链和单链dna，以及双链和单链rna。为了用于本发明，寡核苷酸还可以包含核苷酸类似物，其中碱基、糖或磷酸主链被修饰，以及非嘌呤或非嘧啶核苷酸类似物。
[0034]
寡核苷酸可以通过任何合适的方法制备，包括通过诸如narang等人,1979,meth.enzymol.68:90-99的磷酸三酯法的方法直接化学合成；brown等人1979,meth.enzymol.68:109-151的磷酸二酯法；brown等人1981,tetrahedron lett.22:1859-1862的二乙基亚磷酰胺法；和美国专利号4,458,066的固体支持方法，各自均通过引用并入本文。goodchild,1990,bioconjugate chemistry 1(3):165-187中提供了寡核苷酸和经修饰的核苷酸的缀合物的合成方法的综述，其通过引用并入本文。
[0035]
如本文所用，术语“引物”是指能够在合适条件下充当dna合成起始点的寡核苷酸。这些条件包括在适当的缓冲液中，在适当的温度下，在四种不同的三磷酸核苷和延伸剂(例如，dna聚合酶或逆转录酶)的存在下，诱导与核酸链互补的引物延伸产物的合成。引物延伸也可以在一个或多个三磷酸核苷不存在的情况下进行，在这种情况下会产生有限长度的延伸产物。如本文所用，术语“引物”旨在包括用于连接介导的反应中的寡核苷酸，其中一个寡核苷酸通过连接到在相邻位置杂交的第二寡核苷酸而“延伸”。因此，本文所用的术语“引物延伸”既指使用引物作为dna合成起始点的单个三磷酸核苷的聚合，又指连接两个寡核苷酸以形成延伸产物。
[0036]
引物优选是单链dna。引物的适当长度取决于引物的预期用途，但通常在6到50个核苷酸的范围内，优选15-35个核苷酸。短引物分子通常需要较低的温度才能与模板形成足
够稳定的杂交复合物。引物不需要反映模板核酸的确切序列，但必须充分互补以与模板杂交。用于扩增给定靶序列的合适引物的设计在本领域中是众所周知的并且在本文引用的文献中有所描述。
[0037]
引物可以包含允许检测或固定引物但不改变引物的基本特性(即充当dna合成起始点的特性)的附加特征。例如，引物可以在5’末端含有另外的核酸序列，该序列不与靶核酸杂交，但有利于扩增产物的克隆或检测。与模板充分互补以进行杂交的引物区域在本文中称为杂交区域。
[0038]
本文使用的术语“靶”、“靶序列”、“靶区域”和“靶核酸”是同义的，指待扩增、测序或检测的核酸区域或序列。
[0039]
本文所用的术语“杂交”是指由于互补碱基配对，两个单链核酸形成双链体结构。杂交可以发生在完全互补的核酸链之间或包含小错配区域的“基本上互补的”核酸链之间。强烈优选完全互补核酸链杂交的条件称为“严格杂交条件”或“序列特异性杂交条件”。在不太严格的杂交条件下，可以获得基本互补序列的稳定双链体；可以通过适当调整杂交条件来控制可容忍的错配程度。核酸技术领域的技术人员可以根据经验确定双链稳定性，其中考虑许多变量，包括例如寡核苷酸的长度和碱基对组成、离子强度和错配碱基对的发生率，遵循本领域内的指导(参见，例如，sambrook等人,1989,molecular cloning
–
a laboratory manual,cold spring harbor laboratory,cold spring harbor,new york；wetmur,1991,critical review in biochem.and mol.biol.26(3/4):227-259；和owczarzy等人,2008,biochemistry,47:5336-5353，其通过引用并入本文)。
[0040]
术语“扩增反应”是指任何化学反应，包括酶促反应，其导致模板核酸序列的拷贝增加或导致模板核酸的转录。扩增反应包括逆转录、聚合酶链式反应(pcr)，包括实时pcr(参见美国专利号4,683,195和4,683,202；pcr protocols:a guide to methods and applications(innis等人编辑，1990))和连接酶链式反应(lcr)(参见barany等人，美国专利号5,494,810)。示例性的“扩增反应条件”或“扩增条件”通常包括两步或三步循环。两步循环具有高温变性步骤，然后是杂交/延伸(或连接)步骤。三步循环包括变性步骤，然后是杂交步骤，然后是单独的延伸或连接步骤。
[0041]
如本文所用，“聚合酶”是指催化核苷酸聚合的酶。通常，酶将在与核酸模板序列退火的引物的3’末端启动合成。“dna聚合酶”催化脱氧核糖核苷酸的聚合。已知的dna聚合酶包括，例如，强烈火球菌(pfu)dna聚合酶(lundberg等人，1991，gene，108:1)、大肠杆菌dna聚合酶i(lecomte和doubleday,1983,nucleic acids res.11:7505)、t7 dna聚合酶(nordstrom等人，1981，j.biol.chem.256:3112)、嗜热栖热菌(thermus thermophilus)(tth)dna聚合酶(myers和gelfand 1991，biochemistry 30:7661)、嗜热脂肪芽孢杆菌(bacillus stearothermophilus)dna聚合酶(stenesh和mcgowan，1977，biochim biophys acta 475:32)、嗜热高温球菌(thermococcus litoralis)(tli)dna聚合酶(也称为vent dna聚合酶，cariello等人，1991，nucleic acids res，19:4193)、海栖热袍菌(thermotoga maritima)(tma)dna聚合酶(diaz和sabino，1998braz j.med.res，31:1239)、水生栖热菌(taq)dna聚合酶(chien等人，1976,j.bacteoriol，127:1550)、thermoccus/pyrococcus kodakaraensis kod dna聚合酶(takagi等人，1997，appl.environ.microbiol.63:4504)、jdf-3dna聚合酶(专利申请wo 0132887)和火球菌属(pyrococcus)gb-d(pgb-d)dna聚合酶
(juncosa-ginesta等人，1994，biotechniques，16:820)。任何上述酶的聚合酶活性可以通过本领域熟知的方法测定。
[0042]
如本文所用，如果当在足够严格的条件下用于扩增反应时，引物主要与靶核酸杂交，则引物对于靶序列是“特异性的”。通常，如果引物-靶双链体稳定性大于引物与样品中发现的任何其他序列之间形成的双链体的稳定性，则引物对靶序列具有特异性。本领域技术人员将认识到各种因素，例如盐条件以及引物的碱基组成和错配的位置，将影响引物的特异性，并且在许多情况下需要对引物特异性进行常规实验确认。可以选择杂交条件，在该条件下引物可以仅与靶序列形成稳定的双链体。因此，在适当严格的扩增条件下使用靶特异性引物能够选择性扩增那些包含靶引物结合位点的靶序列。
[0043]
如本文所用，术语“非特异性扩增”是指由引物与靶序列以外的序列杂交然后作为引物延伸的底物而引起的靶序列以外的核酸序列的扩增。引物与非靶序列的杂交被称为“非特异性杂交”，特别是在较低的温度、降低的严格性、预扩增条件下，或者在样品中存在变异等位基因的情况下，该变异等位基因具有与真正靶非常接近的序列，如单核苷酸多态性(snp)的情况。
[0044]
术语“3'-错配辨别”是指dna聚合酶的一种特性，可将完全互补序列与包含错配(几乎互补)的序列区分开来，其中待延伸的核酸(例如，引物或其它寡核苷酸)与核酸杂交的模板相比，在核酸的3’末端具有错配。在一些实施方案中，待延伸的核酸相对于完全互补序列在3’末端包含错配。
[0045]
术语“3
’‑
错配辨别测定”是指当用两个具有基本相同序列的引物对靶dna序列进行分析时，除了在其各自的3’末端处或其附近出现一个或多个具有不同碱基组成的核苷酸残基之外，辨别靶dna序列扩增中提高的特异性的存在的测定。例如，具有与靶dna序列完全互补的3'末端序列的第一引物被认为是3'匹配引物，而具有至少一个与靶dna序列不互补的核苷酸碱基的3'末端序列的第二引物被认为是3'错配引物。许多实施例(例如实施例4表10和11等)中提供了3'错配辨别测定的实例。
[0046]
如本文所用，术语“引物二聚体”是指不依赖于模板的非特异性扩增产物，其被认为是由引物延伸产生的，其中另一个引物用作模板。尽管引物二聚体经常表现为两个引物的串联体，即二聚体，但也存在多于两个引物的串联体。术语“引物二聚体”在本文中一般用于涵盖不依赖于模板的非特异性扩增产物。
[0047]
如本文所用，术语“反应混合物”是指包含进行给定反应所必需的试剂的溶液。“扩增反应混合物”是指含有进行扩增反应所必需的试剂的溶液，通常在合适的缓冲液中含有寡核苷酸引物和dna聚合酶或连接酶。“pcr反应混合物”通常在合适的缓冲液中包含寡核苷酸引物、dna聚合酶(最典型的是热稳定的dna聚合酶)、dntp和二价金属阳离子。如果反应混合物包含能够进行反应所需的所有试剂，则称为完整反应混合物，如果仅包含必要试剂的子集，则称为不完整反应混合物。本领域的技术人员应当理解，出于方便、储存稳定性的原因，或者为了允许依赖于应用的组分浓度的调整，反应组分通常作为单独的溶液储存，每个溶液包含总组分的子集，并且反应组分在反应之前合并以产生完整的反应混合物。此外，本领域技术人员将理解，反应组分被分开包装用于商业化，并且有用的商业试剂盒可以包含包括本发明的阻断的引物的反应组分的任何子集。
[0048]
出于本发明的目的，本文所用的术语“非活化的”或“失活的”是指引物或其他寡核
苷酸不能参与引物延伸反应或连接反应，因为dna聚合酶或dna连接酶不能与寡核苷酸相互作用以达到其预期目的。在一些实施方案中，当寡核苷酸是引物时，非活化状态出现，因为引物在3'末端处或附近被阻断以防止引物延伸。当特定基团结合在引物的3'末端处或附近时，dna聚合酶无法与引物结合，并且不会发生延伸。然而，非活化引物能够与基本上互补的核苷酸序列杂交。
[0049]
出于本发明的目的，本文所用的术语“活化的”是指能够参与与dna聚合酶或dna连接酶的反应的引物或其他寡核苷酸。引物或其他寡核苷酸在与基本上互补的核酸序列杂交后被活化，并被切割产生功能性的3’末端或5’末端，从而可以与dna聚合酶或dna连接酶相互作用。例如，当寡核苷酸是引物，并且引物与模板杂交时，可以通过例如切割酶从引物去除3'阻断性基团，使得dna聚合酶可以结合到引物的3'末端并促进引物延伸。
[0050]
如本文所用，术语“切割结构域”或“切割性结构域”是同义的并且指位于引物或其他寡核苷酸的5'和3'末端之间的区域，其被切割化合物例如切割酶(它将切割引物或其他寡核苷酸)识别。出于本发明的目的，设计切割结构域使得引物或其他寡核苷酸仅在其与互补核酸序列杂交时被切割，但在其为单链时不会被切割。切割结构域或其两侧的序列可包含以下部分：a)防止或抑制引物或其他寡核苷酸通过聚合酶或连接酶的延伸或连接，b)增强辨别以检测变异等位基因，或c)抑制不期望的切割反应。一个或多个这样的部分可以包括在切割结构域或其侧翼的序列中。
[0051]
如本文所用，术语“rna酶h切割结构域”是一种切割结构域，其包含一个或多个核糖核酸残基或为rna酶h提供底物的替代类似物。rna酶h切割结构域可以位于引物或寡核苷酸内的任何位置，优选位于分子的3’末端或5’末端处或附近。
[0052]“rna酶h2切割结构域”可包含一个rna残基、连续连接的rna残基的序列或由dna残基或其他化学基团分隔的rna残基。在一个实施方案中，rna酶h2切割结构域是2'-氟核苷残基。在一个更优选的实施方案中，rna酶h2可切割结构域包括两个相邻的2'-氟残基。
[0053]
本文所用术语“阻断的引物”是指至少具有适于与靶序列充分杂交的切割结构域、可切割结构域和阻止从引物3’末端延伸直至切割发生的阻断性基团的引物。在优选的实施方案中，可切割结构域是rna酶h切割结构域，而阻断性基团是丙二醇(c3)间隔子。
[0054]
如本文所用，术语“切割化合物”或“切割剂”是指可以识别引物或其他寡核苷酸内的切割结构域并根据切割结构域的存在选择性切割寡核苷酸的任何化合物。本发明中使用的切割化合物仅在与基本互补的核酸序列杂交时选择性切割包含切割结构域的引物或其他寡核苷酸，但当引物或其他寡核苷酸是单链时，不会切割引物或其他寡核苷酸。切割化合物在切割结构域内或切割结构域附近切割引物或其他寡核苷酸。术语“相邻”，如本文所用，是指切割化合物在切割结构域的5’末端或3'末端切割引物或其他寡核苷酸。本发明优选的切割反应产生5'-磷酸基团和3'-oh基团。
[0055]
在优选的实施方案中，切割化合物是“切割酶”。切割酶是一种蛋白质或核酶，当引物或其他核苷酸与基本互补的核酸序列杂交时，它能够识别切割结构域，但不会切割互补的核酸序列(即，它在双链体中提供单链断裂)。当引物或其他寡核苷酸是单链时，切割酶也不会切割包含切割结构域的引物或其他寡核苷酸。切割酶的实例是rna酶h酶和其他切口酶。
[0056]
如本文所用，术语“切口”是指完全或部分双链核酸的双链部分的仅一条链的切
割。核酸被切口的位置被称为“切口位点”(ns)。“切口剂”(na)是对部分或完全双链核酸进行切口的试剂。它可以是酶或任何其他化合物或组合物。在某些实施方案中，切口剂可识别完全或部分双链核酸的特定核苷酸序列，并且在相对于识别序列位置的特定位置(即ns)仅切割完全或部分双链核酸的一条链。此类切口剂(称为“序列特异性切口剂”)包括但不限于切口核酸内切酶(例如，n.bstnb)。
[0057]
因此，如本文所用，“切口核酸内切酶”(ne)是指识别完全或部分双链核酸分子的核苷酸序列并在相对于识别序列的特定位置仅切割核酸分子的一条链的核酸内切酶。在这种情况下，从识别位点到切割点的整个序列构成了“切割结构域”。
[0058]
如本文所用，术语“阻断性基团”是指与引物或其他寡核苷酸结合从而不发生扩增反应的化学部分。例如，引物延伸和/或dna连接不会发生。一旦阻断性基团从引物或其他寡核苷酸中去除，寡核苷酸就能够参与其设计的测定(pcr、连接、测序等)。因此，“阻断性基团”可以是任何抑制聚合酶或dna连接酶识别的化学部分。阻断性基团可以并入切割结构域，但通常位于切割结构域的5'侧或3'侧。阻断性基团可由多于一个化学部分构成。在本发明中，“阻断性基团”通常在寡核苷酸与其靶序列杂交后被去除。
[0059]
术语“荧光生成探针”是指a)具有连接的荧光团和淬灭剂以及任选的小沟结合物的寡核苷酸或b)dna结合试剂，例如绿色染料。
[0060]
术语“荧光标记”或“荧光团”是指在约350和900nm之间具有最大荧光发射的化合物。可以使用多种荧光团，包括但不限于：5-fam(也称为5-羧基荧光素；也称为螺(异苯并呋喃-1(3h),9'-(9h)氧杂蒽)-5-甲酸,3',6'-二羟基-3-氧代-6-羧基荧光素)；5-六氯-荧光素；([4,7,2',4',5',7'-六氯-(3',6'-二新戊酰基-荧光素基)-6-甲酸])；6-六氯-荧光素；([4,7,2',4',5',7'-六氯-(3',6'-二新戊酰荧光素基)-5-甲酸])；5-四氯荧光素；([4,7,2',7'-四氯-(3',6'-二新戊酰基荧光基)-5-甲酸])；6-四氯荧光素；([4,7,2',7'-四氯-(3',6'-二新戊酰基荧光素基)-6-甲酸])；5-tamra(5-羧基四甲基罗丹明)；xanthylium，9-(2,4-二羧基苯基)-3,6-双(二甲基氨基)；6-tamra(6-羧基四甲基罗丹明)；9-(2,5-二羧基苯基)-3,6-双(二甲基氨基)；edans(5-((2-氨基乙基)氨基)萘-1-磺酸)；1,5-iaedans(5-((((2-碘乙酰基)氨基)乙基)氨基)萘-1-磺酸)；cy5(吲哚二碳菁-5)；cy3(吲哚二碳菁-3)；和bodipy fl(2,6-二溴-4,4-二氟-5,7-二甲基-4-bora-3a,4a-二氮杂-s-茚满-3-丙酸)；-670染料(biosearch technologies)；cal橙染料(biosearch technologies)；rox染料；max染料(integrated dna technologies)，及其合适的衍生物。
[0061]
如本文所用，术语“淬灭剂”是指分子或化合物的一部分，其在连接到或接近供体时能够减少来自荧光供体的发射。淬灭可以通过几种机制中的任何一种发生，包括荧光共振能量转移、光诱导电子转移、系统间交叉的顺磁增强、德克斯特交换耦合和激子耦合，例如暗络合物的形成。当荧光团发出的荧光与不存在淬灭剂时的荧光相比减少至少10％，例如15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％、99.9％或更多时，荧光被“淬灭”。许多市售淬灭剂是本领域已知的，包括但不限于dabcyl、blackholetm淬灭剂(bhq-1、bhq-2和bhq-3)、iowafq和iowarq。这些是所谓的暗淬灭剂。它们没有天然荧光，几乎消除了其他淬灭剂(例如tamra，它本身具有荧光)所见的背景问题。
[0062]
如本文所用，术语“连接”是指两个多核苷酸末端的共价连接。在各种实施方案中，
连接涉及将第一多核苷酸(受体)的3’末端共价连接到第二多核苷酸(供体)的5'末端。连接导致在多核苷酸末端之间形成磷酸二酯键。在各种实施方案中，连接可由导致多核苷酸末端共价连接的任何酶、化学品或过程介导。在某些实施方案中，连接由连接酶介导。
[0063]
如本文所用，“连接酶”是指能够将一个多核苷酸的3'羟基共价连接至第二多核苷酸的5'磷酸基团的酶。连接酶的实例包括大肠杆菌dna连接酶、t4 dna连接酶等。
[0064]
连接反应可用于dna扩增方法，例如“连接酶链式反应”(lcr)，也称为“连接酶扩增反应”(lar)，参见barany,proc.natl.acad.sci.,88:189(1991)；以及wu和wallace,genomics 4:560(1989)，通过引用并入本文。在lcr中，将四个寡核苷酸、两个与靶dna的一条链独特杂交的相邻寡核苷酸以及与相对链杂交的一组互补的相邻寡核苷酸混合，并将dna连接酶添加到混合物中。在靶序列存在的情况下，dna连接酶将共价连接每组杂交分子。重要的是，在lcr中，只有当两个寡核苷酸与序列无缺口地碱基配对时，它们才会连接在一起。变性、杂交和连接的重复循环可扩增一小段dna。相邻寡核苷酸之间连接处的错配会抑制连接。与其他寡核苷酸连接测定一样，此特性允许使用lcr来区分变异等位基因，例如snp。lcr也已与pcr结合使用，以实现对单碱基变化的增强检测，参见segev,pct公开号wo9001069(1990)。
[0065]
当术语“密码子优化的”修饰编码多肽的特定核酸时，该术语是指包含在给定宿主细胞中有效表达的优选密码子，所述宿主细胞是例如给定微生物(例如大肠杆菌、酿酒酵母等)或哺乳动物细胞(例如人类细胞，例如hela、cos细胞等)。基于为多种生物开发的密码子偏倚表，此类优选密码子在本领域中是众所周知的。编码本发明的多肽的多核苷酸包括那些具有针对任何已知生物体的密码子优化的开放阅读框的多核苷酸，在这些生物体中已经开发了密码子偏倚表或对于这些生物体这样的表可以容易地从经验测定中辨别出来。
[0066]
短语“basex pcr扩增法”指的是一种高效的核酸扩增方法，它允许每个扩增循环的扩增产物增加2倍以上，因此比传统pcr具有更高的灵敏度和速度。该方法公开于2019年4月30日授予r.higuchi(申请人：cepheid)的题为“exponential base-greater-than-2nucleic acid amplification”的美国专利公开us10273534(b2)，其内容通过引用以其整体并入本文。
[0067]
短语“融合蛋白”或“融合多肽”是指包含额外氨基酸信息，该额外氨基酸信息对于该额外氨基酸信息共价连接的蛋白质而言不是天然的。这种额外氨基酸信息可以包括能够纯化或鉴定融合蛋白的标签。这种额外氨基酸信息可以包括使融合蛋白能够被转运到细胞中和/或转运到细胞内特定位置的肽。用于这些目的的标签的实例包括：avitag，其是一种允许bira酶进行生物素化的肽，因此可以通过链霉亲和素分离蛋白质；calmodulin-标签，其是一种由蛋白质钙调蛋白结合的肽；聚谷氨酸标签，其是一种能有效结合阴离子交换树脂(如mono-q)的肽；e-标签，其是一种被抗体识别的肽；flag-标签，其是一种被抗体识别的肽；ha-标签，其是一种来自血凝素的肽，可被抗体识别；his标签，其通常是5-10个由镍或钴螯合物结合的组氨酸；myc-标签，其是来源于c-myc的肽，可被抗体识别；ne-标签，其是一种新型的18氨基酸合成肽，可被单克隆igg1抗体识别，可用于广泛的应用，包括蛋白质印迹、elisa、流式细胞术、免疫细胞化学、免疫沉淀和重组蛋白的亲和纯化；s-标签，其是一种源于rna酶a的肽；sbp-标签，其是一种与链霉亲和素结合的肽；softag 1，其用于哺乳动物表达；softag 3，其用于原核表达；strep-标签，其是一种结合链霉亲和素或称为链霉菌素
(strep-标签ii)的经修饰链霉亲和素的肽；tc标签，其是一种四半胱氨酸标签，可被flash和reash双砷化合物识别；v5标签，其是一种被抗体识别的肽；vsv-标签，其是一种被抗体识别的肽；xpress标签；isopeptag，其是一种与pilin-c蛋白共价结合的肽；spytag，其是一种与spycatcher蛋白共价结合的肽；snooptag，其是一种与snoopcatcher蛋白共价结合的肽；bccp(生物素羧基载体蛋白)，其是一种被bira生物素化的蛋白质结构域，能够被链霉亲和素识别；谷胱甘肽-s-转移酶标签，其是一种与固定化谷胱甘肽结合的蛋白质；绿色荧光蛋白标签，其是一种自发荧光的蛋白，可以被抗体结合；halotag，其是一种突变的细菌卤代烷脱卤素酶，可共价连接到反应性卤代烷底物上，从而允许连接到多种底物上；麦芽糖结合蛋白标签，其是一种结合直链淀粉琼脂糖的蛋白质；nus-标签；硫氧还蛋白标签；和fc-标签，其源自免疫球蛋白fc结构域，允许二聚化和增溶，可用于在蛋白-a琼脂糖凝胶上纯化。核定位信号(nls)，例如从sv40获得的信号，允许蛋白质在进入细胞后立即被运送到细胞核。鉴于天然cas9蛋白起源于细菌，因此天然不包含nls基序，当用于靶基因组dna底物位于细胞核中的真核细胞中时，向重组cas9蛋白添加一个或多个nls基序预计会显示出改善的基因组编辑活性。本领域技术人员将理解这些不同的融合标签技术、所涉及的特定氨基酸序列，以及如何制备和使用包含它们的融合蛋白。在一个实施方案中，高度优选的融合蛋白或融合多肽包括his-标签基序，尽管本领域技术人员将理解可以包括其他标签，如上所述。本发明包括融合蛋白或融合多肽，以及缺乏另外氨基酸序列信息的相应蛋白或多肽的原始突变形式。
[0068]
通过对来自已知rna酶h2酶的氨基酸序列进行重组重改组而生成的新颖杂合rna酶h2酶变体。
[0069]
通过对三个rna酶h2酶(包括深海热球菌、科达卡热球菌和强烈火球菌)的氨基酸序列进行部分重组(“改组”)，生成了两个具有新颖有用特性的杂合rna酶h2酶。并可产生杂合rna酶h2酶。特别地，已发现两个突变体rna酶h2酶，sel28 rna酶h2(seq id no.:89)和sel29 rna酶h2(seq id no.:90)显著增强错配辨别，这两个酶组合了来自深海热球菌、科达卡热球菌和强烈火球菌生物体的氨基酸序列片段。突变体选自通过随机改组rna酶h2序列创建的文库。两种突变体酶都含有t.kod rna酶h2的氨基酸残基26-40和残基100-120的片段，但也存在其他变化。基于与已知晶体结构的结构同源性(muroya等人,2001；rychlik等人,2010)，这些残基可能与结合的dna双链体接触。不受任何特定理论的束缚，可以假设t.kod rna酶h2的残基26-40和残基100-120将改变底物双链体的酶结合口袋，从而导致结合亲和力的改变和催化核酸切割。野生型p.ab.rna酶h2蛋白(seq id no.:88)、杂合sel28 rna酶h2蛋白(seq id no.:89)和杂合sel29 rna酶h2蛋白(seq id no.:90)的氨基酸序列在表1中描述。还制备了野生型p.ab.rna酶h2蛋白(seq id no.:1)、杂合sel28 rna酶h2蛋白(seq id no.:2)和杂合sel29 rna酶h2蛋白(seq id no.:3)的相应的经(his)6标记的氨基酸序列，并且作为产生另外的突变rna酶h2蛋白的基础(参见表3)。
[0070]
表1.杂合rna酶h2蛋白的氨基酸序列。
[0071][0072]1与野生型深海热球菌rna酶h2相同的氨基酸显示为无下划线、非粗体序列。源自科达卡热球菌和强烈火球菌rna酶h2序列的氨基酸分别以粗体和下划线显示。
[0073]
当错配位于rna核苷酸处时，由seq id no.:89和90编码的所得杂合sel28和sel29 rna酶h2酶改善了错配辨别，但程度不同且具有不同的特异性。(数据未显示)。同样，由seq id no.:89和90编码sel28和sel29突变体rna酶h2酶改善了rna核苷酸5'的错配辨别。(数据未显示。)
[0074]
rhpcr也可以使用高保真dna聚合酶进行-例如来自强烈火球菌和科达卡热球菌(kod)的dna聚合酶-而不是来自水生栖热菌的dna聚合酶(taq)。然而，wt p.a.rna酶h2、sel28 rna酶h2和sel29 rna酶h2在使用高保真聚合酶和相关反应缓冲液的rhpcr中活性有限。taq dna聚合酶的最佳反应缓冲液与kod dna聚合酶的最佳反应缓冲液有很大不同。可以发现rna酶h2中的突变对kod dna聚合酶反应缓冲液中的成分具有更大的耐受性。我们显示使用kod dna聚合酶反应缓冲液，q48r、a107v和p13s/a107v在添加到杂交突变体sel28或sel29 rna酶h2时增强酶活性。
[0075]
本发明涉及在使用kod dna聚合酶及其最佳反应缓冲液的rhpcr过程中增强酶活性的突变体rna酶h2酶。sel29 rna酶h2的第48和第107氨基酸突变已显示具有这种改进的活性。对具有sel28 rna酶h2或sel29rna酶h2的背景的七个点突变体进行了筛选，并显示使用kod dna聚合酶反应缓冲液时q48r sel29 rna酶h2和a107v sel29 rna酶h2增强酶活性。这些也被证明可以保留或增强sel29 rna酶h2的错配辨别能力。
[0076]
rna酶h2介导的pcr
[0077]
本文公开的杂合rna酶h2突变蛋白可用于多种pcr应用。rna酶h2依赖性pcr是一种通过使用来自深海热球菌或相关生物体的rna酶h2和包含单个核糖核苷酸残基和3'阻断性部分的dna引物(“阻断的可切割引物”)来提高pcr特异性和消除引物二聚体的方法。当被rna酶h2酶切割时，阻断的可切割引物被活化。引物与靶dna杂交后，切割发生在rna碱基的5'侧。因为引物只有在与完全匹配的靶序列杂交后才能被切割，所以引物二聚体减少。对高靶标互补性的要求减少了密切相关序列的扩增。
[0078]
在这方面，杂合rna酶h2突变蛋白特别适于增强产生高质量基因组扩增子文库的性能，用于高通量多重测序应用，例如下一代测序应用(ngs)。特别地，q48r sel29是一种有用的rna酶h2酶，可用于rna酶h2介导的pcr应用和系统，例如申请人的rhampseq
tm
系统。
[0079]
rna酶h2介导的snp检测和稀有等位基因检测
[0080]
由于其增强的3'错配辨别属性，本文公开的杂合rna酶h2突变蛋白可用于检测单核苷酸多态性检测和稀有等位基因检测。使用仅与所期望的含snp的核酸模板形成完全双链体的阻断的可切割引物将被杂合rna酶h2突变蛋白识别和切割，从而活化引物:期望的核酸模板双链体，用于在合适的条件下通过dna聚合酶进行引物延伸。
[0081]
环介导等温扩增(lamp)中的rna酶h2
[0082]
本文还考虑了在环介导的等温扩增(lamp)中使用rna酶h2。lamp扩增方法在等温条件下进行，即在循环过程中反应温度没有变化。lamp需要设计至少四种不同的引物来识别所需扩增子的六个不同区域(notomi等人nucleic acids research,28(12)(2000))。扩增反应取决于通常来自嗜热脂肪芽孢杆菌(bst)的dna聚合酶的链置换活性。产物的结构由靶序列的反向重复长链组成。
[0083]
由于大量引物和该方法中使用嗜温dna聚合酶，lamp反应易于形成引物二聚体产物。lamp在扩增bst聚合酶中也缺乏5'-》3'核酸外切酶活性，因为这种活性会通过与必需的链置换活性竞争来破坏扩增。使用阻断的可切割引物和rna酶h2可以减少或消除lamp反应中引物二聚体信号的检测。在这方面，杂合rna酶h2突变蛋白特别适于增强lamp反应中形成的所期望的产物的性能，而不会伴随产生引物二聚体。
[0084]
应用
[0085]
在第一方面，提供了杂合rna酶h2蛋白。杂合rna酶h2蛋白包括来自深海热球菌(pyrococcus abyssi)(p.a.)、科达卡热球菌(t.kod)和强烈火球菌(pyrococcus furiosus)生物体的氨基酸序列片段。在第一方面，杂合rna酶h2蛋白包含t.kod rna酶h2的氨基酸残基26-40和残基100-120。在第二方面，杂合rna酶h2蛋白选自seq id no:2和3。在第三方面，杂合rna酶h2蛋白选自seq id no:14-20。
[0086]
在第二方面，提供了编码本文公开的任何杂合rna酶h2蛋白的重组核酸。在第一方面，编码任何杂合rna酶h2蛋白的示例性重组核酸包括表14的seq id no.:79-87。
[0087]
在第三方面，提供了进行引物延伸的方法。该方法包括以下步骤：在适合于引物延伸方法的条件下，使本文公开的杂合rna酶h2蛋白与引物、多核苷酸模板、三磷酸核苷和dna聚合酶接触，从而产生延伸的引物。在第一方面，dna聚合酶包括高保真古菌dna聚合酶。在第二方面，引物包括阻断的可切割引物。在第三方面，引物延伸方法包括进行聚合酶链式反应(pcr)的方法。在第四方面，进行pcr的方法改进了在引物和多核苷酸模板之间形成的引物:多核苷酸杂交体中的错配辨别。在第五方面，错配辨别的改进包括3'-错配辨别的改进。
[0088]
在第四方面，提供了一种反应混合物。反应混合物包括本文所述的杂合rna酶h2蛋白、至少一个引物、多核苷酸模板、三磷酸核苷和dna聚合酶。在第一方面，反应混合物包括dna聚合酶，该dna聚合酶是高保真古菌dna聚合酶。在第二方面，反应混合物包括至少一个引物，该引物是阻断的可切割引物。
[0089]
在第五方面，提供了一种用于进行rhpcr的方法。该方法包括用本文所述的杂合rna酶h2、dna聚合酶和引物进行引物延伸的步骤。在第一方面，进行rhpcr的方法包括用高保真古菌dna聚合酶进行引物延伸。在第二方面，通过化学修饰、适体或阻断性抗体可逆地失活杂合rna酶h2酶。在第三方面，阻断性基团连接到引物的3'末端核苷酸。在第四方面，阻断性基团连接在3'末端残基的5'端并且抑制引物作为dna合成的模板。在第五方面，阻断性基团包括一个或多个无碱基残基。在第六方面，一个或多个无碱基残基是c3间隔子。在第七方面，阻断性基团包括一个选自下组的成员：rddddx、rddddmx、rdxxd、rdxxdm、rddddxxd、rddddxxdm和dxxd，其中r是rna残基，d是dna残基，m是错配残基，及x是c3间隔子或其他抗降解的专有基团。在这方面，阻断性基团包括允许检测延伸扩增反应的标记。在这方面，允许检测扩增反应的标记连接到切割位点3’的寡核苷酸引物。在这方面，标记是质谱检测扩增反应的荧光团或质量标签。在进一步的方面，阻断的可切割引物的切割结构域包含以下部分中的一个或多个：dna残基、无碱基残基、经修饰的核苷或经修饰的磷酸核苷酸间连接。在另外的方面，切割结构域包括单个rna残基、两个相邻的rna残基、三个或更多个rna残基的连续序列、缺少rna残基或一个或多个2'-修饰的核苷。在那些方面，其中切割结构域包括一个或多个2'-修饰的核苷，该一个或多个2'-修饰的核苷选自由以下组成的组：2'-o-烷基rna核苷、2'-氟核苷、锁核酸、2'-亚乙基核酸残基、2'-烷基核苷、2'-氨基核苷和2'-硫代核苷。示例性的2'-修饰的核苷包括2'-o-甲基rna核苷和2'-氟核苷。
[0090]
在第六方面，提供了一种扩增靶dna序列的方法。该方法包括几个步骤。第一步骤是提供包括以下的反应混合物：(i)具有切割结构域的寡核苷酸引物，所述切割结构域可被rna酶h2酶切割，位于阻断性基团的5'，所述阻断性基团连接在所述寡核苷酸引物的3'末端处或附近，其中所述阻断性基团防止引物延伸和/或抑制寡核苷酸引物作为dna合成的模板；(ii)可以是或可以不是靶序列的样品核酸；(iii)dna聚合酶，和(iv)本文公开的杂合rna酶h2蛋白。第二步骤是将所述寡核苷酸引物与所述靶dna序列杂交以形成双链底物。第三步骤是用所述杂合rna酶h2酶在所述切割结构域内或邻近所述切割结构域的切割位点处切割杂交的寡核苷酸引物，以从所述寡核苷酸引物除去所述阻断性基团。在该方法的第一方面，dna聚合酶是古菌高保真dna聚合酶。另一方面，通过化学修饰或阻断性抗体可逆地失活rna酶h2蛋白。在该方法的另外方面，阻断性基团连接到寡核苷酸引物的3'末端核苷酸。在该方法的其他方面，阻断性基团连接在3'末端残基的5'端并且抑制寡核苷酸引物作为dna合成的模板。在该方法的另外方面，阻断性基团包括一个或多个无碱基残基。在该方法的另外方面，一个或多个无碱基残基是c3间隔子或其他抗降解的专有基团。在该方法的其他方面，阻断性基团包括一个选自下组的成员：rddddx、rddddmx、rdxxd、rdxxdm、rddddxxd、rddddxxdm和dxxd，其中r是rna残基，d是dna残基，m是错配残基，及x是c3间隔子或其他抗降解的专有基团。在该方法的另外方面，阻断性基团包括允许检测延伸扩增反应的标记。在该方法的另外方面，该方法进一步包括允许检测扩增反应的标记，其中所述标记连接到切割位点3’的寡核苷酸引物。在这些方面，标记是用于通过质谱检测扩增反应的荧光团或质量
标签。在该方法的其他方面，切割结构域包括以下部分中的一个或多个：dna残基、无碱基残基、经修饰的核苷或经修饰的磷酸核苷酸间连接。在该方法的另外方面，切割结构域包括单个rna残基、两个相邻的rna残基、三个或更多个rna残基的连续序列、或一个或多个2'-修饰的核苷。在切割结构域包括一个或多个2'-修饰的核苷的方法方面，那些2'-修饰的核苷选自由以下组成的组：2'-o-烷基rna核苷、2'-氟核苷、锁核酸、2'-亚乙基核酸残基、2'-烷基核苷、2'-氨基核苷和2'-硫代核苷。示例性的2'-修饰的核苷包括2'-o-甲基rna核苷和2'-氟核苷。
[0091]
在第七方面，提供了用于产生延伸的引物的试剂盒。该试剂盒包括至少一个容器，该容器提供本文公开的杂合rna酶h2蛋白。在第一方面，试剂盒进一步包括一个或多个另外的容器，该容器选自由以下组成的组：(a)提供引物的容器，所述引物在引物延伸条件下可与预先确定的多核苷酸模板杂交；(b)提供三磷酸核苷的容器；(c)提供适合引物延伸的缓冲液的容器和(d)dna聚合酶。在第二方面，dna聚合酶包括高保真古菌dna聚合酶。在第三方面，上述试剂盒包括一个或多个另外的含有阻断的可切割引物的容器。
[0092]
在第八方面，提供了用于进行靶dna序列扩增的试剂盒。该试剂盒包括反应缓冲液，该反应缓冲液包含本文所述的rna酶h2和高保真古菌dna聚合酶。在第一方面，试剂盒进一步包括一个或多个寡核苷酸引物，其中至少一个寡核苷酸引物具有切割结构域，所述切割结构域可被rna酶h2酶切割，位于阻断性基团的5'，所述阻断性基团连接在所述寡核苷酸引物的3'末端处或附近，其中所述阻断性基团防止引物延伸和/或抑制寡核苷酸引物作为dna合成的模板。在第二方面，试剂盒包括阻断性基团，所述阻断性基团是一个选自下组的成员：rddddx、rddddmx、rdxxd、rdxxdm、rddddxxd、rddddxxdm和dxxd，其中r是rna残基，d是dna残基，m是错配残基，及x是c3间隔子或其他抗降解的专有基团。
[0093]
在第九方面，提供了一种制备模板核酸扩增子文库的方法。该方法包括几个步骤。第一步骤是形成一种混合物，其中包含核酸群体、至少阻断的可切割引物、杂合rna酶h2蛋白、dntp、dna聚合酶和缓冲液，以便在混合物中在至少所述阻断的可切割引物和所述核酸群体之间形成杂交双链体。第二步骤是用杂合rna酶h2蛋白切割所述至少一个阻断的可切割引物以产生至少一个能够通过dna聚合酶进行引物延伸的活性引物。第三步骤是在允许从所述核酸群体扩增一个或多个模板核酸的条件下，用所述dna聚合酶在所述缓冲液中延伸所述至少一个活性引物，从而生成模板核酸的扩增子。在第一方面，杂合rna酶h2蛋白选自q48r sel29(seq id no.:18)或其他。在第二方面，dna聚合酶是高保真古菌dna聚合酶或其他。在第三方面，缓冲液是高保真古菌dna聚合酶缓冲液。
[0094]
在第十方面，提供了一种进行大规模并行测序的方法。该方法包括几个步骤。第一步骤是在pcr方法中使用核酸群体、杂合rna酶h2突变蛋白、至少一个阻断的可切割引物、dna聚合酶、dntp和缓冲液来制备模板核酸文库群体。第二步骤是对来自所述模板核酸文库群体的多个期望模板核酸进行测序。在第一方面，杂合rna酶h2蛋白选自q48r sel29(seq id no.:18)或其他。
[0095]
在第十一方面，提供了一种从核酸模板扩增子文库中检测含snp的核酸模板的方法，所述方法包括：该方法包括几个步骤。第一步骤包括形成包含核酸模板扩增子文库的混合物；至少一个阻断的可切割引物；杂合突变体rna酶h2蛋白；dntp；dna聚合酶；和缓冲液。在混合物中的核酸模板扩增子文库中在至少阻断的可切割引物和含snp的核酸模板之间形
成杂交双链体。第二步骤包括用杂合rna酶h2蛋白切割杂交双链体的至少一个阻断的可切割引物以生成至少一个能够通过dna聚合酶对杂交双链体进行引物延伸的活性引物。第三步骤包括在允许从所述核酸模板扩增子文库扩增一个或多个模板核酸的条件下，用dna聚合酶在缓冲液中延伸双链体中的至少一个活性引物，从而检测含snp的核酸模板。在第一方面，该方法包括选自q48r sel29(seq id no.:18)或其他的杂交突变体rna酶h2蛋白。在第二方面，该方法包括缓冲液，该缓冲液是高保真古菌dna聚合酶缓冲液。
[0096]
在第十二方面，提供了一种进行环介导扩增反应的方法。该方法包括两个步骤。第一步骤包括形成包含核酸模板的混合物；四个阻断的可切割引物，其中所述阻断的可切割引物与作为rna酶h2蛋白底物的核酸模板形成双链体；rna酶h2蛋白，其中所述rna酶h2蛋白选自q48r sel29(seq id no.:18)或其他；dna聚合酶蛋白；dntp；和缓冲液。第二步骤包括用混合物进行等温扩增循环。
[0097]
在第十三方面，提供了一种具有减少的引物二聚体形成的rhpcr测定的方法。该方法包括用q48r sel29 rna酶h2(seq id no:18)进行引物延伸。当与用野生型p.a.rna酶h2(seq id no:1)进行的rhpcr测定相比时，减少的引物二聚体形成对应于在用q48r sel29 rna酶h2(seq id no:18)进行的rhpcr测定期间减少的引物二聚体的量。
[0098]
在第十四方面，提供了一种rhpcr测定的方法，该测定对期望产物具有改进的映射率和中靶率。该方法包括用q48r sel29 rna酶h2(seq id no:18)进行引物延伸。当与用野生型p.a.rna酶h2(seq id no:1)进行的rhpcr测定相比时，改进的映射率和中靶率对应于在用q48r sel29 rna酶h2(seq id no:18)进行的rhpcr测定期间形成的期望产物的增加的映射和中靶扩增。
[0099]
最后，本发明的rna酶h2多肽适用于basex pcr扩增方法，这是美国专利公开us10273534(b2)中公开的一种高效扩增方法，其内容通过引用以其整体并入本文。
[0100]
实施例
[0101]
参考以下实施例进一步说明本发明。然而，应当注意，与上述实施方案一样，这些实施例是说明性的，不应被解释为以任何方式限制本发明的可实施范围。
[0102]
实施例1.通过重组改组生成sel28和sel29杂合rna酶h2蛋白。
[0103]
使用体外dna重组和定向分子进化技术合成突变体rna酶h2蛋白。altravax
tm inc.(sunnyvale,ca)根据与integrated dna technologies的合同协议生成了包含5,500个突变体的文库。在idt中进行的初步筛选中选择sel28和sel29突变体，其中突变体在rna酶h2切割反应中表现出增加的错配辨别。突变体是在大肠杆菌(e.coli)bl21(de3)内的pet-27b(+)质粒载体中产生的。基于t7系统表达的蛋白质含有n-末端pelb信号序列、突变的rna酶h2基因、人单纯疱疹病毒2表位标签和c-末端六组氨酸标签。使用50ml tpp生物反应器(techno plastic products ag,trasadingen,switzerland)在含有50μg/ml卡那霉素(teknova
tm
,hollister,ca)的12ml lb也培养基中使大肠杆菌细胞生长。使用overnight express
tm
自诱导系统1(milliporesigma
tm
，burlington，ma)在37℃下诱导rna酶h2的表达20小时。使用maxq
tm 4000轨道摇床(thermofisher scientific
tm
，grand island，ny)使细菌表达菌株生长伴随250rpm振荡。细胞在thermoscientific sorvall
tm legend xtr离心机中以7,500x g离心10分钟，弃去上清液。细胞糊储存在-80℃，并重悬于0.6ml裂解液中，该裂解液由以下细胞重悬缓冲液组成，该细胞重悬缓冲液含有50mm nacl、
40mm tris-hcl ph 8.0、2.5mm mgcl2、0.5mm cacl2、1x提取试剂(milliporesigma
tm
，burlington，ma)、1x complete
tm
，不含edta的蛋白酶抑制剂混合物(milliporesigmatm，burlington，ma)、0.1mg/ml溶菌酶(～600单位，thermofisher
tm scientific，grand island，ny)和4u/ml ambion
tm dna酶i(thermofisher
tm scientific，grand island，ny)。在25℃下裂解需要15分钟，同时以120rpm振荡细胞。通过以16,000x g离心20分钟去除不溶性物质。dna酶i和天然大肠杆菌蛋白在75℃下变性15分钟。通过以16,000x g离心15分钟再次去除不溶性变性蛋白质。capturem
tm his-tagged miniprep试剂盒(takara bio
tm
，mountain view，ca)用于蛋白质纯化。用细胞重悬缓冲液清洗试剂盒中的结合柱，并将含有rna酶h2的上清液加载到柱上。通过以11,000x g离心1分钟将溶液拉过柱。使用添加了20mm咪唑的200μl洗涤缓冲液(20mm na3po4、150mm nacl、ph 7.6)洗涤柱两次。用200μl洗脱缓冲液(20mm na3po4、500mm nacl、500mm咪唑，ph 7.6)洗脱rna酶h2酶，并用1l 2x储存缓冲液f(ph 8.4，40mm tris-hcl，0.2mm edta，200mm kcl)使用d-tube
tm dialyzer midi,mwco 6-8kda(milliporesigmatm，burlington，ma)进行透析过夜。罐中的透析缓冲液至少更换一次。从透析中回收样品，并以1:1的体积比与99.8％(v/v)甘油和0.2％(v/v)triton x-100的混合物混合。这些纯化和浓缩的rna酶h2溶液储存在-20℃。使用any kd
tm mini-tgx stain-free
tm
蛋白质凝胶(bio-hercules，ca)，通过sds凝胶电泳估计它们的纯度。与precision plus protein
tm
未染色的标准品(bio-hercules，ca)相比，rna酶h2酶在所有纯化的样品中显示优势蛋白带(》75％)，其位置对应于28.9kg/mol的预期分子量。
[0104]
突变蛋白的氨基酸序列见表1，seq id no：89和90。使用applied biosystems bigdye terminators v3.1试剂盒完成测序。按照制造商的方案，使用plus sv minipreps dna纯化系统(promega，madison，wi)从细菌菌株中分离质粒dna。测序数据由applied biosystems 3130遗传分析仪收集。
[0105]
实施例2.与sel29 rna酶h2相比，sel29 rna酶h2中的q48r和a107v sdm突变体增加了科达卡热球菌dna聚合酶反应缓冲液中的酶活性。
[0106]
通过定点诱变(sdm)技术生成经(his)6标记的突变体sel28和sel29rna酶h2蛋白(参见，例如，weiner m.等人,gene,151:119-123(1994))。用于sel28和sel29 rna酶h2 sdm的引物见表2，seq id no:4-13。突变体经过序列验证，并使用标准方法在大肠杆菌中表达蛋白质。如前所述(dobosy等人,2011,and us patent 8,911,948b2)，通过带电ni
2+
柱的亲和纯化完成纯化。突变蛋白的氨基酸序列见表3，seq id no:2-3、14-20。
[0107]
表2.用于rna酶h2酶的诱变的sdm引物。
[0108][0109][0110]1所有碱基都是dna。以粗体和下划线显示的字符是诱变核苷酸。
[0111]
表3.rna酶h2蛋白的氨基酸序列。
[0112]
[0113]
[0114][0115]1突变的位置以粗体和下划线显示。结束延伸和(his)
6-标签以斜体显示。
[0116]
为了确定p13s、a107v和p13s/a107v sel28 rna酶h2或p13s、q48r、a107v或p13s/a107v sel29 rna酶h2与wt p.a rna酶h2相比在使用rhpcr的kod dna聚合酶反应缓冲液中是否具有增加的活性，设计了靶向smad7中rs4939827snp的定量rhpcr检测。该snp过去曾被用于(dobosy等人,2011和美国专利8,911,948b2)来表征rhpcr的效率和特异性，并且其在不同条件下的反应已广为人知。表4，seq 21-23中显示了该测定中使用的引物。测定在10μl反应体积进行。热循环和数据收集在实时系统(bio-hercules,ca)上运行。简而言之，将200nm(2pmol)阻断的正向引物(seq id no.:22)和200nm(2pmol)未阻断的反向引物(seq id no.:23)，或200nm(2pmol)未阻断的正向引物(seq id no.:21)和200nm(2pmol)未阻断的反向引物(seq id no.:23)与2.5mm(总)mgso4、0.2mm(每个)dntp(milliporesigma
tm
，burlington，ma)和0.5x染料(biotium inc.，fremont，ca)混合到1x内部kod缓冲液(rokstar缓冲液v2.0或v1.66)(idt，coralville，ia)中。将rna酶h2稀释缓冲液(idt，coralville，ia)或21fmol wt p.a.(seq id no.:1)、sel28(seq id no.:2)、sel29(seq id no.:3)、p13s sel28(seq id no.:14)、a107vsel28(seq id no.:
15)、p13s/a107v sel28(seq id no.:16)、p13s sel29(seq id no.:17)、q48r sel29(seq id no.:18)、a107v sel29(seq id no.:19)或p13s/a107v sel29(seq id no.:20)rna酶h2酶添加到每个反应中。将代表rs4939827snp的纯合基因型的10ng基因组细胞系dna(细胞系na12878，coriell institute for medical research，camden，nj)添加到每个反应中。反应一式三份进行，结果取平均值。反应在以下条件下循环：95℃
3:00-》(95℃
0:10-》60℃
0:30
)x 75。在每个延伸时间点后收集嵌入的的荧光数据。测定完成后，对数据进行分析，利用bio-rad cfx软件的自动调用功能计算cq值。结果呈现在表5中。
[0117]
表4.实施例2中描述的实验中使用的引物的序列和seq id。
[0118][0119]1dna大写，rna小写。x＝对核酸外切酶具有抗性的专有阻断剂基团。
[0120]
表5.实施例2中实验的cq、δcq和δδcq值。
[0121][0122]
表5(续)
[0123]
[0124][0125]1δcq值计算为阻断的引物(seq id no.:22)的cq值与未阻断的引物(seq id no.:21)cq值之间的差异。2δδcq值计算为背景sel28或sel29rna酶h2的δcq值与突变体sel28或sel29 rna酶h2的δcq值之间的差异。
[0126]
这些数据表明，与背景sel29 rna酶h2相比，q48r sel29和a107vsel29 rna酶h2在科达卡热球菌dna聚合酶反应缓冲液中具有增加的酶活性，但p13s sel29 rna酶h2和p13s/a107v rna酶h2没有。此外，与背景sel28 rna酶h2相比，p13s sel28、a107v sel28和p13s/a107v rna酶h2不会增加科达卡热球菌dna聚合酶反应缓冲液中的酶活性。在不添加任何rna酶h2的情况下，阻断的引物不会被切割，因此无法支持pcr。使用专有的抗核酸外切酶的阻断的引物对于防止引物被高保真dna聚合酶解阻断是必要的。wt(p.a.)与未阻断的引物相比，rna酶h2能够切割阻断的引物，但扩增延迟，导致δcq在rokstar buffer v2.0中为12.4个循环，在rokstar buffer v1.66中为21.1个循环。扩增延迟的δcq量化增加到rokstar缓冲液v2.0中sel28 rna酶h2的17.1个循环和sel29 rna酶h2的24.6个循环，增加到rokstar缓冲液v1.66中sel28 rna酶h2的30.6个循环和sel29 rna酶h2的30.3个循环。扩增延迟的δcq量化随q48r sel29 rna酶h2(rokstar缓冲液v2.0中为17.2个循环，rokstar缓冲液v1.66中为25.4个循环)和a107v rna酶h2(在rokstar缓冲液v2.0中为13.9个循环和rokstar缓冲液v1.66中为21.9循环)而降低。p13s/a107v sel29 rna酶h2将扩增延迟的δcq量化增加到rokstar缓冲液v2.0中的26.9个循环和rokstar缓冲液v1.66中的32.8个循环。p13s sel28和p13s sel29 rna酶h2在rokstar缓冲液v2.0或v1.66中都没有明显的活性。此外，p13s/a107vsel28 rna酶h2将扩增延迟的δcq量化增加到rokstar缓冲液v2.0中的21.5个循环和rokstar缓冲液v1.66中的31.8个循环。a107v sel28 rna酶h2将扩增延迟的δcq量化增加到rokstar缓冲液v2.0中的20.0个循环和rokstar缓冲液v1.66中的35.8个循环。这些结果与p.a.rna酶h2的突变形成对比，因为q48r、a107v和p13s/a107v p.a.rna酶h2在科达卡热球菌dna聚合酶反应缓冲液中都具有增加的酶活性，并且p13s p.a.rna酶h2在科达卡热球菌dna聚合酶反应缓冲液中具有较低但可测量的酶活性。当与科达卡热球菌dna聚合酶反应缓冲液一起使用时，q48r sel29和a107v sel29 rna酶h2提高酶活性-尽管程度不同。
[0127]
实施例3.当错配与rna位置相对时，q48r sel29和a107v sel29rna酶h2与wt rna酶h2相比增加了错配辨别。
[0128]
使用基于荧光的动力学测定法测定酶的比活性。表6，seq id no.:24-25中显示了dna底物的序列。底物是dna发夹，在双链区域内具有匹配的rna碱基。连接到探针3’末端的是6-fam(6-羧基荧光素)；连接到探针5'末端的是iowafq(seq id no.:24)。6-fam
的荧光被完整发夹探针中的iowafq部分淬灭。rna酶h2切割rna碱基的5'并释放带有6-fam的探针的3’末端。因此，6-fam的荧光不再被淬灭，可以发出荧光。具有rna碱基但没有荧光团或淬灭剂的dna发夹用作竞争物(seq id no.:25)。在10μl反应体积中进行测定。使用480ii(roche life science,indianapolis,in)进行数据收集。简而言之，将1x rhamp
tm
主链v3与200nm(2pmol)经标记的发夹(seq id no.:24)和10μm(100pmol)竞争发夹(seq id no.:25)组合使用。0.5、1.0、2.0或5.0fmol的wt p.a.rna酶h2(seq id no.:1)或突变体rna酶h2(seq id no.:18-19)添加到每个反应中。反应最初保持在4℃，以防止在开始测定之前底物切割。样品在65℃下运行。荧光激发波长为483nm；荧光发射波长为533nm。每13.75秒收集一次荧光强度，持续135分钟。计算每个反应的初始速度和每飞摩尔的速度。将每个突变体的每飞摩尔速度标相对于wt p.a rna酶h2(之前确定其比活性为17单位/μg酶)的值进行归一化。q48r sel29 rna酶h2的比活性为46.03单位/μg酶，a107v sel29 rna酶h2的比活性为7.77单位/μg酶。
[0129]
表6.用于确定rna酶h2单位活性的dna发夹的序列和seq id。
[0130][0131]1dna大写，rna小写。q＝iowafq。f＝6-fam(荧光素)。
[0132]
为了完全确定这些突变的rna酶h2酶是否可以改善与rna碱基直接相对的错配的错配辨别，如前所述使用合成的定量rhpcr测定(dobosy等人,2011和美国专利8,911,948b2)。该测定可以与完全匹配相比直接比较每个特定单碱基错配的影响。表7，seq id nos.:26-31中显示了该测定中使用的引物。测定在10μl反应体积进行。热循环和数据收集在实时系统(bio-hercules，ca)上运行。简而言之，将200nm(2pmol)阻断的反向引物(seq id no：28-31)和200nm(2pmol)未阻断的正向引物(seq id no：26)，或200nm(2pmol)未阻断的反向引物(seq id no.:27)和200nm(2pmol)未阻断的正向引物(seq id no.:26)混合到1x iq
tm
green(bio-hercules，ca)中。将5mu的wt p.a.(seq id no.:1)、40mu q48r sel29(seq id no.:18)或5mu a107v sel29(seq id no.:19)rna酶h2酶添加到每个反应中。将每个合成的靶序列(seq id no：32-35)的20,000个拷贝添加到每个反应中，每个合成的靶序列具有与rna碱基直接相对的不同核苷酸。反应一式三份进行，结果取平均值。反应在以下条件下循环：95℃
3:00
→
(95℃
0:10
→
60℃
0:30
)x 75。在每个延伸时间点后收集嵌入的green的荧光数据。测定完成后，分析数据，并计算每个配对组合的平均cq和δcq值。表8和9中提供了结果。
[0133]
表7.实施例2中描述的实验中使用的引物和模板的序列和seq id。
[0134][0135][0136]1dna大写，rna小写。x＝c3间隔子(丙二醇)阻断性基团。错配的位置在合成模板中以粗体和下划线显示。
[0137]
表8.实施例2中描述的实验的cq值。
[0138][0139][0140]
表8(续)
[0141][0142][0143]
表8(续)
[0144][0145]
表9.实施例2中描述的实验的δcq值。
[0146][0147]
表9(续)
[0148]
[0149][0150]
表9(续)
[0151][0152]
来自表9的δcq值计算为每个模板的核苷酸特异性引物的cq值与完美匹配模板的cq
值之间的差异。
[0153]
这些数据表明，当错配与q48r sel29和a107v sel29 rna酶h2的rc相对时，错配辨别会大幅增加(分别为约14.0个循环和约13.5个循环)。特别是，对于q48r sel29和a107v sel29 rna酶h2(分别为21.9个循环和15.2个循环)的rc:c对，错配辨别有很大的增加。当错配与ru相对时，q48rsel29 rna酶h2的错配辨别显著增加(约11.2个循环)，但a107v sel29rna酶h2(约4.3个循环)的增加不太显著。当错配与ra相对时，q48r sel29和a107v sel29 rna酶h2的错配辨别会发生显著变化(分别为约8.5个循环和约6.0个循环)。当错配与rg相对时，错配辨别变化不大；错配辨别的这种缺乏变化并不那么重要，因为错配辨别对于使用wt rna酶h2时的rg错配已经相当不错了。q48r sel29和a107v sel29 rna酶h2的错配辨别力的这些增加与背景sel29 rna酶h2所示的相似。当错配与rna碱基直接相对时，两个突变都会改善错配辨别，但程度和特异性不同。
[0154]
实施例4.当错配位于rna的5'时，与wt rna酶h2相比，q48r sel29和a107v sel29 rna酶h2增加了错配辨别。
[0155]
为了使用q48r sel29和a107v sel29 rna酶h2酶确定错配位于rna核苷酸5'时的错配辨别程度，设计了一种靶向rs113488022(人braf基因中的v600e snp)的测定，其中snp位于紧邻rna的5'。表10，seq id no.:36-39中显示了该测定中使用的引物。测定在10μl反应体积进行。热循环和数据收集在实时系统(bio-hercules，ca)上运行。简而言之，200nm(2pmol)阻断的正向引物(seq id no：38或39)和200nm(2pmol)未阻断的反向引物(seq id no：37)，或200nm(2pmol)未阻断的正向引物(seq id no.:36)和200nm(2pmol)未阻断的反向引物(seq id no.:37)混合到1x iq
tm
green中。将5mu或10mu的wt(seq id no.:1)p.a.rna酶h2酶、5mu或10mu sel29(seq id no.:3)rna酶h2酶、20mu或40mu q48r sel29(seq id no.:18)rna酶h2酶、或5mu或10mu a107v sel29(seq id no.:19)rna酶h2添加到每个反应中。将合成双链(idt，coralville，ia)模板的2,000个拷贝添加到每个反应中，每个模板对应于rs113488022snp(seq id no：40或41)处的纯合基因型。反应一式三份进行。反应在以下条件下循环：95℃
3:00
→
(95℃
0:10
→
60℃
0:30
)x 65。在每个延伸时间点后收集嵌入的green的荧光数据。测定完成后，分析数据，并计算每个配对组合的平均cq和δcq值。结果呈现在表11中。
[0156]
表10.实施例4中描述的实验中使用的引物和模板的序列和seq id。
[0157]
[0158][0159]1dna大写，rna小写。x＝c3间隔子(丙二醇)阻断性基团。错配的位置在中以粗体和下划线显示。
[0160]
表11.实施例4中实验的cq和δcq值。
[0161][0162]
表11.(续)
[0163]
[0164][0165]
这些数据表明，q48r sel29和a107v sel29 rna酶h2显著提高了rna核苷酸5'的错配辨别。trg引物的δcq量化从使用wt p.a rna酶h2时的3.8个循环增加至使用a107v sel29 rna酶h2时的5.9个循环(对于5mu的wt rna酶h2和a107v sel29 rna酶h2)，以及从使用wtp.a.rna酶h2时的4.5个循环增加至使用q48r sel29 rna酶h2时的6.9个循环(对于5mu的wt rna酶h2和40mu的q48r sel29 rna酶h2)。arg引物的δcq量化从使用wt p.a rna酶h2时的10.1个循环增加至使用a107v sel29 rna酶h2时的11.2个循环(对于5mu的wt rna酶h2和a107v sel29 rna酶h2)，但是从使用wtp.a.rna酶h2时的10.9个循环降低至使用q48r sel29 rna酶h2时的10.2个循环(对于5mu的wt rna酶h2和40mu的q48r sel29 rna酶h2)。用arg引物时的错配辨别的变化不太重要，因为使用wt酶时δcq对于该引物已经相当有效。q48r sel29和a107v sel29 rna酶h2的错配辨别力的这些增加与背景sel29 rna酶h2所示的相似。因此，当错配位于rna碱基的5'时，q48r sel29和a107vsel29 rna酶h2可提高错配辨别。
[0166]
实施例5.当错配位于rna的3'时，与wt rna酶h2相比，q48r sel29和a107v sel29 rna酶h2增加了错配辨别。
[0167]
为了确定当错配位于rna核苷酸的3'时q48r sel29和a107v sel29rna酶h2酶是否可以提高错配辨别，设计了一种针对rs7583169和rs3117947snp的测定，其中错配位于rna的3'。表12，seq no:42-47中显示了该测定中使用的引物。测定在10μl反应体积进行。热循环和数据收集在实时系统(bio-hercules,ca)上运行。简而言之，将200nm(2pmol)阻断的正向引物(seq id no：43或46)和200nm(2pmol)未阻断的反向引物(seq id no：44或47)，或200nm(2pmol)未阻断的正向引物(seq id nos.:42或45)和200nm(2pmol)未阻断的反向引物(seq id nos.:44或47)混合到1x基因表达预混液(idt，coralville，ia)中，该预混液含3.0mm(总)mgcl2和0.5x染料(biotium inc.，fremont，ca)。将5mu或10mu的wt(seq id no.:1)p.a.rna酶h2酶、50mu或100mu q48r sel29(seq id no.:18)rna酶h2酶或20mu或40mu a107v sel29(seq id no.:19)rna酶h2酶添加到每个反应中。将20ng基因组细胞系dna(细胞系na12878和na24385，coriell institute for medical research,camden,nj)添加到每个反应中，细胞系na12878和na24385代表rs7583169和rs3117947snp处的两个纯合基因型。反应一式三份进行，结果取平均值。反应在以下条件下循环：95℃
3:00-》(95℃
0:10-》60℃
0:30
)x 65。在每个延伸时间点后收集嵌入的的荧光数据。测定完成后，分析数据，并计算每个配对组合的平均cq和δcq值。结果呈现在表13中。
[0168]
表12.实施例5中描述的实验中使用的引物的序列和seq id。
[0169][0170]1dna大写，rna小写。x＝c3间隔子(丙二醇)阻断性基团。错配的位置在中以粗体和下划线显示。
[0171]
表13.实施例5中实验的cq和δcq值。
sel29和a107v sel29 rna酶h2可提高错配辨别。
[0175]
实施例6.在lamp反应中使用q48r sel29和a107v sel29杂合rna酶h2蛋白。
[0176]
本实施例概述了一种方法，用于展示在lamp反应中使用杂合rna酶h2蛋白来减少引物二聚体的形成。
[0177]
为了评估rhprimers对包含不同rna酶h2蛋白(wt或杂合rna酶h2蛋白)的lamp方案的功能，可以使用以下来设计三个测定：(1)未修饰的对照引物；“gen1”rddddmx引物，其中“r”是rna碱基，“d”是dna碱基，“m”是错配，“x”是c3间隔子；和“gen2”rdxxdm引物。表14、15和16中详述了用于评估的测定的详细信息。使用每种类型的引物的lamp反应在测试前将在25℃(室温)下保持0或2小时。这将允许形成引物二聚体产物。保持室温后，所有反应将在biorad cfx384或roche lightcycler480中在65℃运行2小时。所有这些反应中的信号生成都将使用添加到反应中的1x evagreen进行(参见：biotechnology letters，2007年12月，第29卷，第12期，第1939-1946页)。
[0178]
表14：受控的未修饰的引物设计。
[0179][0180][0181]
dna碱基是大写的；rna碱基是小写的。f＝6-羧基荧光素；q＝iowa black
tm fq荧光
淬灭剂。
[0182]
表15：gen1引物设计。
[0183][0184][0185]
dna碱基是大写的；rna碱基是小写的。f＝6-羧基荧光素；q＝iowa black
tm fq荧光淬灭剂。x＝c3间隔子。
[0186]
表16：gen2引物设计。
[0187][0188]
dna碱基是大写的；rna碱基是小写的。f＝6-羧基荧光素；q＝iowa black
tm fq荧光淬灭剂。x＝c3间隔子
[0189]
每个测定可以如下进行：样品将是coriell gdna或λ噬菌基因组dna。每个测定条件可以一式三份运行，样品输入为5ngλ噬菌体基因组dna或20ng人基因组dna。对于每个测定，反应可以使用未修饰的带有嵌入染料(例如evagreen)的引物和带有嵌入染料的可切割、阻断的引物运行。对于每个测定，将使用零或滴定水平的rna酶h2(wt或混合rna酶h2蛋白)运行反应。
[0190]
每个测定将一式三份运行。通过比较信号生成产物形成所需的时间长度，将对未修改的lamp测定和修改后的lamp测定进行比较。预计lamp反应中的杂合rna酶h2蛋白产生这些产物的时间将明显晚于含有常规野生型rna酶h2蛋白的反应。
[0191]
25μl evagreen反应混合物将包括：
[0192]
12.5μl的2x主混合物(1x是20mm tris ph 8.8@25℃，10mm kcl，10mm(nh4)2so4，8mm mgso4，0.01％ tween-20，1.4mm dntp)
[0193]
1.6μm fip引物
[0194]
1.6μm bip引物
[0195]
1x evagreen染料
[0196]
0.2μm f3引物
[0197]
0.2μm b3引物
[0198]
8u bst dna聚合酶(new england biolabs：https://www.neb.com/products/m0275-bst-dna-polymerase-large-fragment)
[0199]
1μl杂合rna酶h2蛋白(对于无rna酶h2对照，将使用缓冲液d)
[0200]
无核酸酶水至25ul
[0201]
2μl样品(10ng/μl人gdna或2.5ng/ulλ基因组dna)
[0202]
实施例7.与野生型p.a.rna酶h2相比，q48r sel29 rna酶h2在使用177-plex检测组的多重rhpcr扩增子测序工作流程中提高了ngs文库的质量。
[0203]
修改后的rhampseq方案适用于低频变异检测。该方案既使用高保真dna聚合酶来减少扩增错误，又使用独特的分子标识符(umi)进行错误校正。将q48r sel29 rna酶h2与该系统中的野生型p.a rna酶h2进行比较以确定二聚体形成是否减少。
[0204]
有两个pcr循环步骤，每个步骤后都有spri(固相可逆固定(solid phase reversible immobilization)，beckman coulter life sciences，indianapolis，in)清理。第一pcr步骤(pcr 1)的目的是在靶扩增子的每一侧掺入6核苷酸简并umi。此步骤还包括使用3'-阻断的引物，并需要rna酶h2切割阻断剂并允许高保真dna聚合酶延伸和扩增每个靶标。靶特异性测定组包含177个专有引物对，当野生型p.arna酶h2存在于pcr1中时，总读数的大约20％是引物二聚体。该组生成大量引物二聚体，使其成为测试q48r sel29 rna酶h2的最佳选择。
[0205]
在rna酶h2储存缓冲液(integrated dnatechnologies，coralville，ia)中制备q48r sel29 rna酶h2和野生型p.a.rna酶h2(87.5mu/ul、175mu/ul和350mu/ul)的各种10x滴定。每个pcr 1反应的最终体积为20μl，包含10nm(200fmol)的每个正向和反向引物、0.03u/μl phusion hot start iidna聚合酶(thermo fisher scientific，waltham，ma)、20ng基因组细胞系dna(细胞系na24385，coriell institute for medical research，camden，nj)和专有的高保真聚合酶缓冲液中1x终浓度的rna酶h2。热循环在t100热循环仪(bio-hercules，ca)上进行，循环条件列于表17中。pcr1热循环后立即进行spri清理。将1.25x(25μl)ampure磁珠(beckman coulter life sciences，indianapolis，in)添加到每个孔中并充分混合。将板在室温下在工作台上孵育5分钟，然后在磁铁上孵育5分钟。弃去上清液，并且将文库用80％乙醇洗涤两次。在22μl idte ph 7.5(idt，coralville，ia)中洗脱样品。将20μl洗脱产物作为pcr2的输入。
[0206]
表17.pcr 1循环条件。
[0207][0208]
第二pcr步骤(pcr 2)的目的是扩增pcr 1产物并添加独特的样品索引序列以用于汇集和测序目的。pcr 2不需要使用rna酶h2。pcr 2反应以50μl的最终体积进行。将pcr 1中使用的2x高保真聚合酶缓冲液添加到pcr 1的每个洗脱样品中，最终浓度为1x。每个反应还具有i5和i7rhampseq索引引物(idt)的独特组合，每个500nm。热循环在t100热循环仪(bio-hercules，ca)上进行，循环条件列于表18中。spri清理在pcr 2之后立即进行，与上面列出的方法相同，除了ampure微珠浓度不同，它在pcr 2之后以0.9x使用。在22μl idte ph 7.5(idt，coralville，ia)中洗脱样品。取20μl洗脱产物并储存在-20℃直至测序。
[0209]
表18.pcr 2循环条件。
[0210][0211]
将生成的文库以等体积汇集用于测序(5ul)。使用qubit dsdnahs测定试剂盒(thermo fisher)对该池进行量化，并稀释至4nm最终浓度。将等量的文库池与0.2n naoh混合使文库变性。随后将该反应稀释至8pm的终浓度，其中包含2.5％ phix(illumina，san diego，ca)掺入。将该反应加载到miseq 300循环试剂盒(illumina，san diego，ca)上并运行(簇密度：1002
±
34；q30：93.13％)。将结果通过内部专有的idt rhampseq vii生物信息学分析管道运行。
[0212]
出于本披露的目的，此处列出了与以下结果相关的计算和术语。测序文库扩增过程中产生的引物二聚体量由二聚体率定义。rhampseq vii管道通过将已鉴定的二聚体的总计数除以通过qc的读段数(通过纯度过滤器的读段总数)来计算二聚体率。通过以下计算映射率：将映射的读段的总数除以qc通过的读段数。通过以下计算中靶率：将中靶的读段的总数除以qc通过的读段数。总体扩增子均匀性或扩增子均匀性≥0.2x计算为具有大于或等于扩增子平均覆盖率的0.2倍的正常扩增子的百分比。丢失率或均匀性≤0.05x计算为小于扩增子平均覆盖率的0.05倍的正常扩增子的百分比。扩增子均匀性分布将每个扩增子的覆盖度与给定样品的平均扩增子覆盖度进行比较，并在以下范围内绘制：0.1-0.2x、0.2-0.5x、0.5-1.5x、1.5-2.5x和2.5-5x。
[0213]
rhampseq vii管道还鉴定有助于形成每个引物二聚体的引物。归一化的二聚体计数反映每个引物二聚体占总二聚体率的百分比，并且使用以下公式计算：
[0214][0215]
对于所有测试的浓度，与野生型p.a rna酶h2相比，q48r sel29 rna酶h2降低了二聚体率，同时还提高了映射率和中靶率。与产生11％二聚体的对照野生型p.a rna酶h2相比，在最低浓度(8.75mu/μl)q48r sel29rna酶h2生成的文库具有4％二聚体(图1，分图a)。
[0216]
使用最低浓度的q48r sel29 rna酶h2(8.75mu/μl)生成的文库的映射率和中靶率增加到96％，相比之下对于野生型p.a rna酶h2为88％(图1，分图b和c)。
[0217]
二聚体率可以分解为产生的单个引物二聚体，然后归一化以确定每个引物二聚体对总二聚体率的贡献，如上所述(归一化的二聚体计数)。q48rsel29 rna酶h2将大多数引物二聚体的数量减少一半。例如，在使用最低浓度的q48r mut 29rna酶h2(8.75mu/μl)生成的文库中，在所有样品文库中鉴定的靠前二聚体(notch1_19.gap95.9623.relax.t0_for:notch1_9.gap104.1246.relax.t0_rev)仅占总二聚体率的1.23％，相比之下，野生型p.a rna酶h2情况下是2.83％。在以下情况下一些二聚体减少了一半以上：未确定:tert_15.gap27.511.relax.t0_rev q48r sel29 rna酶h2文库生成的二聚体与野生型p.a rna酶
h2相比减少了75％，为0.11％，其中该二聚体占总二聚体率的0.47％(表19和图2)。
[0218]
表19.实施例1中描述的经鉴定的归一化二聚体计数/每个引物对。
[0219]
[0220]
[0221]
[0222][0223]
q48r sel29 rna酶h2降低二聚体率的能力不会影响文库产量、整体均匀性和丢失率或均匀分布指标。与野生型p.a rna酶h2酶相比，如由扩增子平均覆盖率证明，q48r sel29 rna酶h2在测试的所有滴定浓度下产生相似的文库产量(图3，分图a)。此外，总体扩增子均匀性≥0.2x和扩增子丢失率(扩增子均匀性≤0.05x)在所有测试的滴定浓度中在q48r sel29rna酶h2和野生型p.a.酶之间具有可比性(图3，分图b和c)。此外，q48rsel29和野生型p.a rna酶h2之间的均匀性分布显得相似(图4)。在rhampseq工作流程的文库生成过程中，与标准野生型p.a.rna酶h2相比，q48r sel29 rna酶h2减少了引物二聚体的形成，而不改变其他重要的测序指标。
[0224]
总之，这些数据表明q48r sel29 rna酶h2使用高保真dna聚合酶在高保真缓冲液中改进了多重下一代测序文库的生成。
[0225]
实施例8.编码rna酶h2蛋白的示例性氨基酸和核酸序列。
[0226]
编码rna酶h2蛋白的示例性氨基酸和核酸序列如下所示。
[0227]
表20.先前描述的编码rna酶h2蛋白的核酸序列。
[0228]
[0229]
[0230]
[0231]
[0232]
[0233]
[0234]
[0235][0236]1突变的位置以粗体和下划线显示。质粒延伸和(his)6标签以斜体显示，包括终止密码子。
[0237]
表21.缺少c末端延伸序列的rna酶h2蛋白的氨基酸序列。
[0238]
[0239]
[0240][0241]1突变的位置以粗体和下划线显示。
[0242]
表22.编码缺少另外的c末端延伸序列的rna酶h2蛋白的核酸序列。
[0243]
[0244]
[0245]
[0246]
[0247]
[0248][0249]1突变的位置以粗体和下划线显示。终止密码子以斜体显示。
[0250]
引用的参考文献
[0251]
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[0254]
本文引用的所有参考文献，包括出版物、专利申请和专利，均以与如下相同的程度通过引用并入本文：每个参考文献单独且具体地指示通过引用并入并在本文中全文阐述。
[0255]
本文描述了本发明的优选实施方案，包括发明人已知的用于实施本发明的最佳方式。在阅读前述说明之后，那些优选实施方案的变型对于本领域普通技术人员而言将变得显而易见。发明人期望熟练的技术人员适当地采用这样的变型，并且诸位发明人打算以不同于本文具体描述的方式来实践本发明。因此，在适用法律允许的情况下，本发明包括对所附权利要求书所引用的主题的所有修改和等效物。此外，本发明涵盖以上描述的要素以其所有可能的变型的任意组合，除非另外在本文中指出或另外明确地与上下文相矛盾。

技术特征：
1.一种杂合rna酶h2蛋白，所述杂合rna酶h2蛋白包含来自深海热球菌(p.a.)、科达卡热球菌(t.kod)和强烈火球菌生物体的氨基酸序列片段。2.如权利要求1所述的杂合rna酶h2蛋白，其中所述杂合rna酶h2蛋白包含t.kod rna酶h2的氨基酸残基26-40和残基100-120。3.如权利要求1所述的杂合rna酶h2蛋白，其中所述杂合rna酶h2蛋白选自seq id no:2和3。4.如权利要求1所述的杂合rna酶h2蛋白，其中所述杂合rna酶h2蛋白选自seq id no:14-20。5.一种重组核酸，其编码如权利要求1-4所述的任何杂合rna酶h2蛋白。6.一种进行引物延伸的方法，所述方法包括：在适合于引物延伸方法的条件下，使如权利要求1-4之一所述的杂合rna酶h2蛋白与引物、多核苷酸模板、三磷酸核苷和dna聚合酶接触，从而产生延伸的引物。7.如权利要求6所述的方法，其中所述dna聚合酶包含高保真古菌dna聚合酶。8.如权利要求6所述的方法，其中所述引物包含阻断的可切割引物。9.如权利要求8所述的方法，其中所述引物延伸方法包括进行聚合酶链式反应(pcr)的方法。10.如权利要求9所述的方法，其中所述进行pcr的方法改进了在所述引物和所述多核苷酸模板之间形成的引物:多核苷酸杂交体中的错配辨别。11.如权利要求10所述的方法，其中所述错配辨别的改进包括3'-错配辨别的改进。12.一种反应混合物，其包含如权利要求1-4所述的杂合rna酶h2蛋白、至少一个引物、多核苷酸模板、三磷酸核苷和dna聚合酶。13.如权利要求12所述的反应混合物，其中所述dna聚合酶包含高保真古菌dna聚合酶。14.如权利要求12或13所述的反应混合物，其中所述至少一个引物包含阻断的可切割引物。15.一种进行rhpcr的方法，所述方法包括用如权利要求1-4之一所述的杂合rna酶h2和引物进行引物延伸。16.如权利要求15所述的进行rhpcr的方法，所述方法包括使用高保真古菌dna聚合酶进行引物延伸。17.如权利要求15或16所述的方法，其中通过化学修饰、适体或阻断性抗体可逆地失活所述杂合rna酶h2酶。18.如权利要求17所述的方法，其中阻断性基团连接到所述引物的3'末端核苷酸。19.如权利要求18所述的方法，其中所述阻断性基团连接在3'末端残基的5'端并且抑制所述引物作为dna合成的模板。20.如权利要求19所述的方法，其中所述阻断性基团包括一个或多个无碱基残基。21.如权利要求24所述的方法，其中所述一个或多个无碱基残基是c3间隔子。22.如权利要求18-21中任一项所述的方法，其中所述阻断性基团包括一个选自下组的成员：rddddx、rddddmx、rdxxd、rdxxdm、rddddxxd、rddddxxdm和dxxd，其中r是rna残基，d是dna残基，m是错配残基，及x是c3间隔子或其他防止dna聚合酶延伸的方法。23.如权利要求18-22中任一项所述的方法，其中所述阻断性基团包括允许检测延伸扩
增反应的标记。24.如权利要求23所述的方法，其中允许检测扩增反应的标记连接到切割位点3’的寡核苷酸引物。25.如权利要求24所述的方法，其中所述标记是荧光团。26.如权利要求23所述的方法，其中所述标记是用于通过质谱检测扩增反应的质量标签。27.如权利要求14-26中任一项所述的方法，其中所述阻断的可切割引物的切割结构域包含以下部分中的一个或多个：dna残基、无碱基残基、经修饰的核苷或经修饰的磷酸核苷酸间连接。28.如权利要求14-26中任一项所述的方法，其中所述切割结构域包含单个rna残基。29.如权利要求14-26中任一项所述的方法，其中所述切割结构域包含两个相邻的rna残基。30.如权利要求14-26中任一项所述的方法，其中所述切割结构域包含三个或更多个rna残基的连续序列。31.如权利要求14-26中任一项所述的方法，其中所述切割结构域缺少rna残基。32.如权利要求14-26中任一项所述的方法，其中所述切割结构域包含一个或多个2'-修饰的核苷。33.如权利要求32所述的方法，其中所述一个或多个2'-修饰的核苷选自由以下组成的组：2'-o-烷基rna核苷、2'-氟核苷、锁核酸、2'-亚乙基核酸残基、2'-烷基核苷、2'-氨基核苷和2'-硫代核苷。34.如权利要求32所述的方法，其中所述一个或多个2'-修饰的核苷是2'-o-甲基rna核苷。35.如权利要求32所述的方法，其中所述一个或多个2'-修饰的核苷是2'-氟核苷。36.一种扩增靶dna序列的方法，所述方法包括：(a)提供包含以下的反应混合物：(i)具有切割结构域的寡核苷酸引物，所述切割结构域可被rna酶h2酶切割，位于阻断性基团的5'，所述阻断性基团连接在所述寡核苷酸引物的3'末端处或附近，其中所述阻断性基团防止引物延伸和/或抑制所述寡核苷酸引物作为dna合成的模板，(ii)可以是或可以不是靶序列的样品核酸，(iii)dna聚合酶，和(iv)如权利要求1-4所述的杂合rna酶h2蛋白；(b)将所述寡核苷酸引物与所述靶dna序列杂交以形成双链底物；(c)用所述杂合rna酶h2酶在所述切割结构域内或邻近所述切割结构域的切割位点处切割杂交的寡核苷酸引物，以从所述寡核苷酸引物除去所述阻断性基团。37.如权利要求36所述的方法，其中所述dna聚合酶是高保真古菌dna聚合酶。38.如权利要求36或37中任一项所述的方法，其中通过化学修饰、适体或阻断性抗体可逆地失活所述rna酶h2蛋白。39.如权利要求36-38中任一项所述的方法，其中所述阻断性基团连接到所述寡核苷酸引物的3'末端核苷酸。
40.如权利要求36-38中任一项所述的方法，其中所述阻断性基团连接在3'末端残基的5'端并且抑制所述寡核苷酸引物作为dna合成的模板。41.如权利要求36-40中任一项所述的方法，其中所述阻断性基团包括一个或多个无碱基残基。42.如权利要求41所述的方法，其中所述一个或多个无碱基残基是c3间隔子。43.如权利要求40或41中任一项所述的方法，其中所述阻断性基团包括一个选自下组的成员：rddddx、rddddmx、rdxxd、rdxxdm、rddddxxd、rddddxxdm和dxxd，其中r是rna残基，d是dna残基，m是错配残基，及x是c3间隔子或其他阻断dna聚合酶延伸的方法。44.如权利要求36-43中任一项所述的方法，其中所述阻断性基团包括允许检测延伸扩增反应的标记。45.如权利要求36-44中任一项所述的方法，其进一步包括允许检测扩增反应的标记，其中所述标记连接到所述切割位点3’的寡核苷酸引物。46.如权利要求45所述的方法，其中所述标记是荧光团。47.如权利要求45所述的方法，其中所述标记是用于通过质谱检测扩增反应的质量标签。48.如权利要求36-47中任一项所述的方法，其中所述切割结构域包含以下部分中的一个或多个：dna残基、无碱基残基、经修饰的核苷或经修饰的磷酸核苷酸间连接。49.如权利要求36-48中任一项所述的方法，其中所述切割结构域包含单个rna残基。50.如权利要求36-48中任一项所述的方法，其中所述切割结构域包含两个相邻的rna残基。51.如权利要求36-48中任一项所述的方法，其中所述切割结构域包含三个或更多个rna残基的连续序列。52.如权利要求36-48中任一项所述的方法，其中所述切割结构域包含一个或多个2'-修饰的核苷。53.如权利要求52所述的方法，其中所述一个或多个2'-修饰的核苷选自由以下组成的组：2'-o-烷基rna核苷、2'-氟核苷、锁核酸、2'-亚乙基核酸残基、2'-烷基核苷、2'-氨基核苷和2'-硫代核苷。54.如权利要求52所述的方法，其中所述一个或多个2'-修饰的核苷是2'-o-甲基rna核苷。55.如权利要求52所述的方法，其中所述一个或多个2'-修饰的核苷是2'-氟核苷。56.如权利要求36-55中任一项所述的方法，其中所述切割位点侧翼的序列包含一个或多个耐核酸酶切割的核苷酸间连接。57.如权利要求56所述的方法，其中所述耐核酸酶的连接是硫代磷酸酯。58.一种用于产生延伸的引物的试剂盒，所述试剂盒包括至少一个容器，所述容器提供如权利要求1-4所述的杂合rna酶h2蛋白。59.如权利要求58所述的试剂盒，其进一步包括一个或多个选自下组另外的容器，该组由以下组成：(a)提供引物的容器，所述引物在引物延伸条件下可与预先确定的多核苷酸模板杂交；(b)提供三磷酸核苷的容器；(c)提供适合引物延伸的缓冲液的容器和(d)dna聚合酶。
60.如权利要求59所述的试剂盒，其中所述dna聚合酶包含高保真古菌dna聚合酶。61.如权利要求58-60中任一项所述的试剂盒，其进一步包括一个或多个选自下组的另外的容器，该组由以下组成：包含阻断的可裂解引物的容器。62.一种用于进行靶dna序列扩增的试剂盒，所述试剂盒包括反应缓冲液，所述反应缓冲液包括如权利要求1-4所述的rna酶h2和高保真古菌dna聚合酶。63.如权利要求62所述的试剂盒，其进一步包括一个或多个寡核苷酸引物，其中至少一个寡核苷酸引物具有切割结构域，所述切割结构域可被rna酶h2酶切割，位于阻断性基团的5'，所述阻断性基团连接在所述寡核苷酸引物的3'末端处或附近，其中所述阻断性基团防止引物延伸和/或抑制所述寡核苷酸引物作为dna合成的模板。64.如权利要求63所述的试剂盒，其中所述阻断性基团包括一个选自下组的成员：rddddx、rddddmx、rdxxd、rdxxdm、rddddxxd、rddddxxdm和dxxd，其中r是rna残基，d是dna残基，m是错配残基，及x是c3间隔子或其他阻断dna聚合酶延伸的部分。65.一种制备模板核酸的扩增子文库的方法，所述方法包括：形成混合物，所述混合物包含：核酸群体；至少阻断的可裂解引物；杂合rna酶h2蛋白；dntp；dna聚合酶；和缓冲液，其中在所述混合物中在所述至少阻断的可切割引物和所述核酸群体之间形成杂交双链体；用杂合突变体rna酶h2蛋白切割至少一个阻断的可切割引物以产生至少一个能够通过所述dna聚合酶进行引物延伸的活性引物；和在允许从所述核酸群体扩增一个或多个模板核酸的条件下，用所述dna聚合酶在所述缓冲液中延伸所述至少一个活性引物，从而生成所述模板核酸的扩增子。66.如权利要求65所述的方法，其中所述杂合rna酶h2蛋白选自q48rsel29(seq id no.:18)或其他。67.如权利要求65所述的方法，其中所述dna聚合酶是kod dna聚合酶，或其他高保真古菌dna聚合酶。68.如权利要求65所述的方法，其中所述缓冲液是kod dna聚合酶缓冲液，或另一种高保真古菌dna聚合酶缓冲液。69.一种进行大规模并行测序的方法，所述方法包括：制备模板核酸文库群体，包括：用包含以下的混合物进行pcr：核酸群体：杂合rna酶h2突变蛋白：至少一个阻断的可切割引物：dna聚合酶：
dntp；和缓冲液；和对来自所述模板核酸文库群体的多个期望模板核酸进行测序。70.如权利要求69所述的方法，其中所述杂合rna酶h2蛋白选自q48rsel29(seq id no.:18)或其他。71.一种从核酸模板扩增子文库中检测含snp的核酸模板的方法，所述方法包括：形成混合物，所述混合物包含：核酸模板扩增子文库；至少阻断的可裂解引物；杂合rna酶h2蛋白；dntp；dna聚合酶；和缓冲液，其中在所述混合物中的核酸模板扩增子文库中在所述至少阻断的可切割引物和所述含snp的核酸模板之间形成杂交双链体；用所述杂合rna酶h2蛋白切割所述杂交双链体的至少一个阻断的可切割引物以生成至少一个能够通过所述dna聚合酶对所述杂交双链体进行引物延伸的活性引物；和在允许从所述核酸模板扩增子文库扩增一个或多个模板核酸的条件下，用所述dna聚合酶在所述缓冲液中延伸所述杂交双链体中的所述至少一个活性引物，从而检测所述含snp的核酸模板。72.如权利要求71所述的方法，其中所述杂合rna酶h2蛋白选自q48rsel29(seq id no.:18)或其他。73.一种进行环介导扩增反应的方法，所述方法包括：形成混合物，所述混合物包含：核酸模板；四个阻断的可切割引物，其中所述阻断的可切割引物与作为rna酶h2蛋白底物的核酸模板形成双链体；rna酶h2蛋白，其中所述rna酶h2蛋白选自q48r sel29(seq id no.:18)或其他；dna聚合酶蛋白；dntp；和缓冲液；和用所述混合物进行等温扩增循环。74.一种使用如权利要求6、15、36、69、71和73中任一项所述的方法与q48r sel29 rna酶h2(seq id no:18)产生的产物混合物，其中由其产生的产物混合物相对于用野生型p.a.rna酶h2(seq id no:1)产生的产物混合物包含减少的引物二聚体种类群体。75.一种具有减少的引物二聚体形成的rhpcr测定的方法，所述方法包括用q48r sel29 rna酶h2(seq id no:18)进行引物延伸，其中当与用野生型p.a.rna酶h2(seq id no:1)进行的rhpcr测定相比时，减少的引物二聚体形成对应于在用q48r sel29 rna酶h2(seq id no:18)进行的rhpcr测定期间减少的引物二聚体的量。
76.一种对期望产物具有改进的映射率和中靶率的rhpcr测定的方法，所述方法包括用q48r sel29 rna酶h2(seq id no:18)进行引物延伸，其中当与用野生型p.a.rna酶h2(seq id no:1)进行的rhpcr测定相比时，改进的映射率和中靶率对应于在用q48r sel29 rna酶h2(seq id no:18)进行的rhpcr测定期间形成的期望产物的增加的映射和中靶扩增。

技术总结
本发明涉及杂合RNA酶H2蛋白，其包括来自深海热球菌(P.a.)、科达卡热球菌(T.kod)和强烈火球菌生物体的氨基酸序列的片段，以及使用其来提高高保真DNA聚合酶缓冲液中的错配辨别和活性的方法。和活性的方法。


技术研发人员：J
受保护的技术使用者：综合DNA技术公司
技术研发日：2021.12.22
技术公布日：2023/10/5