治疗患有II级心力衰竭的受试者的进行性心力衰竭的方法与流程

治疗患有ii级心力衰竭的受试者的进行性心力衰竭的方法
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求于2020年12月15日提交的澳大利亚申请第2020904675号、于2021年1月12日提交的澳大利亚申请第2021900059号、于2021年9月10日提交的澳大利亚申请第2021902941号、于2021年10月20日提交的澳大利亚申请第2021903365号和于2021年12月15日提交的美国申请第63/289,868号的优先权权益，所述申请中的每一个申请通过引用的方式整体并入本文。
技术领域
3.本公开涉及用于治疗和/或预防患有早期心力衰竭的受试者的进行性心力衰竭的方法。此类方法可以用于治疗或预防根据纽约心脏协会(nyha)分级量表患有ii级心力衰竭的受试者的进行性心力衰竭。


背景技术：

4.心肌梗死(mi)仍然是发达国家死亡和发病的主要原因之一。公布了美国医疗保险记录的更新，所述更新评估了涉及350,509个》65岁患者的急性mi住院治疗的数据，所述患者在事件发生后存活出院(schuster等人(2004)《生理学-心脏与循环生理学(physiol heart circa physiol.)》,287(2):525-32)。在指标事件后的第一年内，25.9％的mi患者死亡，50.5％的患者再次住院。在mi后的一个月内，死亡的可能性是普通医疗保险年龄人群的21倍，并且住院的可能性是普通医疗保险年龄人群的12倍。
5.在过去的十年中，许多评估新型药物疗法的临床试验已经在患有晚期心力衰竭(hf)的患者中进行。尽管在降低患有hf的患者的发病率和死亡率方面取得了进展，但患有晚期疾病的患者会继续经历特征在于频繁住院和过早死亡的不利的临床病程。
6.很明显，在本领域中有治疗或预防进行性心力衰竭的需要。


技术实现要素：

7.本发明人令人惊讶地发现，细胞疗法对患有早期进行性心力衰竭的受试者特别有效。因此，在一实例中，本公开涉及一种用于治疗或预防受试者的进行性心力衰竭的方法，所述方法包括向所述受试者施用包括细胞的组合物。在一实例中，所述受试者根据纽约心脏协会(nyha)分级量表患有ii级或iii级心力衰竭。在一实例中，所述受试者根据纽约心脏协会(nyha)分级量表可能患有小于iii级的心力衰竭。在一实例中，所述受试者根据纽约心脏协会(nyha)分级量表患有ii级心力衰竭。因此，在一实例中，本公开涉及一种用于治疗或预防受试者的进行性心力衰竭的方法，所述方法包括向所述受试者施用包括细胞的组合物，其中所述受试者根据纽约心脏协会(nyha)分级量表患有ii级心力衰竭。
8.在另一实例中，本公开涉及一种减少受试者的心力衰竭的进展的方法，所述方法包括向所述受试者施用包括细胞的组合物，其中所述受试者根据纽约心脏协会(nyha)分级量表患有ii级心力衰竭。
9.在另一实例中，本公开涉及一种减少根据纽约心脏协会(nyha)分级量表患有ii级心力衰竭的受试者的心脏性死亡的方法，所述方法包括向所述受试者施用包括细胞的组合物。
10.在另一实例中，本公开涉及一种选择要用细胞疗法治疗的心力衰竭患者的方法，所述方法包括：i)根据纽约心脏协会(nyha)分级量表评估心力衰竭；以及ii)选择根据nyha患有ii级心力衰竭的受试者。在一实例中，所述方法进一步包括施用包括细胞的组合物。
11.在一实例中，所述细胞诱导靶组织中的新血管形成。在一实例中，所述细胞促进动脉生成。在一实例中，所述细胞分泌保护处于危险中的心肌的因子。因此，在一实例中，本公开涉及一种用于治疗或预防受试者的进行性心力衰竭的方法，所述方法包括向所述受试者施用包括细胞的组合物，其中所述受试者根据纽约心脏协会(nyha)分级量表患有ii级心力衰竭，并且其中所述细胞诱导靶组织中的新血管形成和/或分泌保护处于危险中的心肌的因子。
12.在一实例中，所述细胞是间充质谱系前体或干细胞(mlpsc)。在一实例中，所述mlpsc是stro-1+。在一实例中，所述mlpsc是间充质干细胞(msc)。在一实例中，所述mlpsc是同种异体的。在一实例中，所述细胞被培养扩增。在此实例中，所述细胞在培养扩增之前可以是tnap+。在一实例中，所述细胞已被冷冻保存。
13.在另一实例中，本公开的方法包括以下步骤：i)选择根据纽约心脏协会(nyha)分级量表患有ii级心力衰竭的受试者；以及ii)向所述受试者施用包括诱导靶组织中的新血管形成的细胞的组合物。
14.在另一实例中，施用所述组合物抑制所述受试者的向nyha iii级进行性心力衰竭的进展。
15.在一实例中，所述受试者的n端前b型利钠肽(nt-probnp)水平小于2200pg/ml。在另一实例中，在施用所述细胞之前，所述受试者的nt-probnp小于2000pg/ml。在另一实例中，在施用所述细胞之前，所述受试者的nt-probnp水平介于1000pg/ml与2000pg/ml之间。
16.本发明人还令人惊讶地发现，细胞疗法对c反应性蛋白(crp)水平升高的患有早期进行性心力衰竭的受试者特别有效。因此，在一实例中，所述受试者的crp水平升高。在一实例中，所述受试者的crp水平》1mg/l。在一实例中，所述受试者的crp水平》1.5mg/l。在一实例中，所述受试者的crp水平≥2mg/l。在一实例中，所述受试者的crp水平》2mg/l。在另一实例中，所述受试者的crp水平介于1.5mg/l与5mg/l之间。在另一实例中，所述受试者c反应性蛋白(crp)水平《5mg/l，优选地《4mg/l。在另一实例中，所述受试者的crp水平介于1mg/l与5mg/l之间。在另一实例中，所述受试者的crp水平介于1.5mg/l与5mg/l之间。
17.在另一实例中，所述受试者在先前9个月内具有心力衰竭住院事件。
18.在另一实例中，所述受试者的lvef小于约45％，优选地小于40％。在另一实例中，所述受试者患有持续性左心室功能障碍。
19.在另一实例中，所述受试者的心力衰竭是由缺血性事件引起的。
20.在另一实例中，所述受试者的心力衰竭是由非缺血性事件引起的。
21.在一实例中，所述受试者在治疗后的心脏性死亡的风险降低。在一实例中，所述风险降低是相对于患有nyha iii级进行性心力衰竭的受试者的心脏性死亡风险而言的。在另一实例中，所述受试者在治疗后的缺血性mace(mi或中风)的风险降低。
22.在一实例中，iii级心力衰竭受试者的缺血性mace(非致死性mi或非致死性中风)的风险降低。在另一实例中，iii级心力衰竭受试者在治疗后的心脏性死亡的风险降低。在另一实例中，iii级心力衰竭受试者在治疗后的缺血性mace和心脏性死亡的风险降低。在一实例中，所述iii级心力衰竭受试者的crp水平≥2mg/l。
23.在一实例中，所述组合物经心内膜和/或静脉内地施用。在一实例中，所述组合物经心内膜施用。
24.本发明人还令人惊讶地发现，细胞疗法降低了患有心肌病的受试者的缺血性事件的风险。因此，在一实例中，本公开还涵盖一种降低受试者的缺血性事件的风险的方法，所述方法包括向所述受试者施用包括细胞的组合物。在一实例中，所述受试者患有心肌病。在一实例中，所述缺血性事件是脑血管或心脏闭塞的形成。在一实例中，所述缺血性事件是中风或心肌梗死。在一实例中，所述受试者患有非缺血性心肌病。在一实例中，所述细胞经心内膜施用。在一实例中，所述受试者根据纽约心脏协会(nyha)分级量表患有ii级或iii级心力衰竭。在一实例中，所述受试者具有活动性炎症。令人惊讶的是，就此实例而言，本发明人确定施用本公开的组合物可以治疗更广泛的患者，如患有ii级或iii级心力衰竭的患者。
25.在一实例中，本公开涉及一种用于治疗或预防受试者的进行性心力衰竭的方法，所述方法包括向所述受试者施用包括间充质前体谱系或干细胞的组合物，其中所述受试者根据纽约心脏协会(nyha)分级量表患有ii级或iii级心力衰竭并具有活动性炎症。在另一实例中，本公开涉及一种减少受试者的心力衰竭的进展的方法，所述方法包括向所述受试者施用包括间充质前体谱系或干细胞的组合物，其中所述受试者根据纽约心脏协会(nyha)分级量表患有ii级或iii级心力衰竭并具有活动性炎症。在另一实例中，本公开涉及一种减少根据纽约心脏协会(nyha)分级量表活动性炎症患有ii级或iii级心力衰竭的受试者的心脏性死亡的方法，所述方法包括向所述受试者施用包括间充质前体谱系或干细胞的组合物。在另一实例中，本公开涉及一种选择要用细胞疗法治疗的心力衰竭患者的方法，所述方法包括：i)评估crp水平并根据纽约心脏协会(nyha)分级量表评估心力衰竭；以及ii)选择根据nyha患有ii级或iii级心力衰竭并具有活动性炎症的受试者，优选地，其中所述方法包括施用包括间充质前体谱系或干细胞的组合物。在一实例中，活动性炎症是基于所述受试者的crp水平来确定的。在一实例中，所述受试者患有ii级心力衰竭并具有“活动性炎症”。在一实例中，所述活动性炎症的特征在于crp的水平》1.5mg/l。在另一实例中，活动性炎症的特征在于crp的水平》2mg/l。示例性细胞在上面和整个本公开中讨论。在一实例中，所述细胞诱导靶组织中的新血管形成。在一实例中，所述细胞促进动脉生成。在一实例中，所述细胞分泌保护处于危险中的心肌的因子。在一实例中，所述细胞是mlpsc。在一实例中，所述mlpsc是stro-1+。在一实例中，所述mlpsc是间充质干细胞(msc)。在一实例中，所述mlpsc是同种异体的。在一实例中，所述细胞被培养扩增。在此实例中，所述细胞在培养扩增之前可以是tnap+。在一实例中，所述细胞已被冷冻保存。
26.在一实例中，所述受试者的n端前b型利钠肽(nt-probnp)水平在施用所述细胞之前介于1000pg/ml与2000pg/ml之间。在另一实例中，所述受试者的c反应性蛋白(crp)水平升高。在另一实例中，所述受试者的crp水平≥1mg/l。在另一实例中，所述受试者的crp水平≥2mg/l。在另一实例中，所述受试者的crp水平介于2mg/l与5mg/l之间。在另一实例中，所述受试者的crp水平介于3mg/l与5mg/l之间。
27.在上述实例的实施例中，本公开的方法包括施用1
×
107至2
×
108个细胞。
28.在另一实例中，所施用的组合物进一步包括plasma-lyte a、二甲亚砜(dmso)、人血清白蛋白(hsa)。在一实例中，所施用的组合物进一步包括plasma-lyte a(70％)、dmso(10％)、hsa(25％)溶液，所述hsa溶液包括5％ hsa和15％缓冲液。在一实例中，所述组合物包括大于6.68
×
106个活细胞/ml。
29.在另一实例中，所述组合物包括利用抗stro-3抗体从骨单核细胞中分离、离体扩增并冷冻保存的人骨髓源性同种异体间充质前体细胞(mpc)。
30.在一实例中，所述缺血性事件是心肌梗死、中风或心脏性死亡中的一者或多者。在一实例中，所述方法降低了3点mace的风险。
31.本发明人还令人惊讶地确定，crp水平的升高与心脏性死亡风险、心肌梗死或中风增加相关。因此，在一实例中，本公开涉及一种用于确定受试者的心脏性死亡、心肌梗死或中风中的一者或多者的风险升高的方法，所述方法包括测量从受试者获得的样品中的crp水平，其中crp升高表明心脏性死亡、心肌梗死或中风的风险升高。在一实例中，所述受试者患有进行性心力衰竭。在一实例中，所述受试者的心力衰竭是nyha ii级心力衰竭。在另一实例中，crp的水平》1mg/l表明心脏性死亡、心肌梗死或中风的风险升高。在另一实例中，crp的水平》1.5mg/l表明心脏性死亡、心肌梗死或中风的风险升高。在另一实例中，crp的水平≥2mg/l表明心脏性死亡、心肌梗死或中风的风险升高。在一实例中，所述方法确定心脏性死亡的风险升高。
附图说明
32.图1：缺血性mace(mi，中风)的发生率降低。
33.图2：缺血性mace(mi，中风)的发生率降低；nyha ii级和iii级。
34.图3：缺血性mace(mi，中风)的发生率降低；缺血性和非缺血性。
35.图4：所有经治疗的患者(n＝537)；ii级患者(n＝206)；iii级患者(n＝331)的心脏性死亡。
36.图5：nyha ii级患者的心脏性死亡；缺血性和非缺血性。
37.图6：试验患者的心脏性死亡。
38.图7：a)ttfe复合imm mace；b)比率归一化的复合imm mace；c)基线crp≥2mg/l与crp≤2mg/ml的所有经治疗的患者的曲线。针对非致死性mi或非致死性中风示出的曲线；针对cv死亡或非致死性mi或非致死性中风的3点ttfe复合imm mace。
39.图8：a)ttfe不可逆发病率；b)比率归一化的不可逆发病率；c)所有经治疗的患者(n＝537)；ii级患者(n＝206)；iii级患者(n＝331)的不可逆发病率ttfe mace(非致死性mi或非致死性中风)的曲线。
40.图9：复合心脏性死亡或缺血性mace(mi，中风)的发生率降低；所有经治疗患者(n＝537)；ii级患者(n＝206)；iii级患者(n＝331)。
41.图10：nyha ii级患者的心脏性死亡-多年随访。
42.图11：基线hscrp≥2mg/l的nyha ii级患者进展为心脏性死亡的风险显著增加。
43.图12：基线hscrp≥2mg/l的nyha ii级患者发生3点mace(心脏性死亡/mi/中风)的风险显著增加。
具体实施方式
44.一般技术和定义
45.除非另外特别说明，否则本文所使用的所有技术和科学术语应被视为具有与本领域(例如，在细胞培养、分子生物学、干细胞培养、免疫学、临床试验、医学和生物化学)的普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。
46.除非另有说明，否则本公开中使用的细胞培养技术和测定是本领域的技术人员熟知的标准程序。此类技术在以下来源的文献中进行了描述和解释：如j.perbal,《分子克隆实用指南(a practical guide to molecular cloning)》,约翰威利父子出版公司(john wiley and sons)(1984)；j.sambrook等人,《分子克隆：实验室手册(molecular cloning:a laboratory manual)》,冷泉港实验室出版社(cold spring harbour laboratory press)(1989)；t.a.brown(编辑),《基本分子生物学：实用方法(essential molecular biology:a practical approach)》,第1卷和第2卷,irl出版社(irl press)(1991)；d.m.glover和b.d.hames(编辑)，和f.m.ausubel等人(编辑),《当代分子生物学实验指南(current protocols in molecular biology)》,格林出版协会(greene pub.associates)和威利国际科学出版公司(wiley-interscience)(1988，包含迄今为止的所有更新)；ed harlow和david lane(编辑)《抗体：实验室手册(antibodies:a laboratory manual)》,冷泉港实验室,(1988)；以及j.e.coligan等人(编辑),《当代免疫学指南(current protocols in immunology)》,约翰威利父子出版公司(包含迄今为止的所有更新)。
47.术语“和/或”，例如“x和/或y”应理解为意指“x和y”或“x或y”，并且应被视为对两种含义或任一含义提供明确的支持。
48.如本文所使用的，除非相反地说明，否则术语“约”是指指定值的+/-10％，更优选地+/-5％。
49.术语“水平”和“量”用于定义来自受试者的样品中或细胞培养基(或来自其的样品)中的特定物质的量。例如，特定的浓度、重量、百分比(例如v/v％)或比率可以用于定义样品中的特定物质的水平。在一实例中，所述水平根据本公开的细胞在培养条件下表达的特定标志物的多少来表示。在一实例中，表达表示细胞表面表达。在另一实例中，所述水平以在培养条件下从本文所述的细胞中释放的特定标志物的多少来表示。在一实例中，从患者或受试者获得样品(例如血液样品)，并且测量样品中物质的水平以确定样品中所述物质的水平。
50.在一实例中，所述水平以pg/ml表示。例如，nt-probnp的水平可以以pg/ml表示。在一实例中，所述水平以mg/l表示。例如，crp的水平可以以mg/l表示。在另一实例中，所述水平以每106个细胞的pg表示。
51.在一实例中，在培养条件下确定细胞培养基中的特定标志物的水平。术语“培养条件”用于指代在培养中生长的细胞。在一实例中，培养条件是指活跃分裂的细胞群。在一实例中，此类细胞可能处于指数生长期。例如，特定标志物的水平可以通过获取细胞培养基的样品并测量样品中的标志物水平来确定。在另一实例中，特定标志物的水平可以通过获取细胞样品并测量细胞裂解液中标志物的水平来确定。本领域技术人员将通过对培养基进行取样来测量分泌的标志物，而在细胞表面上表达的标志物可以通过评估细胞裂解液的样品来测量。在一实例中，当细胞处于指数生长期时获取样品。在一实例中，在培养至少两天后
获取样品。
52.从冷冻保存的中间体中对细胞进行培养扩增意味着将经受低温冷冻的细胞解冻并在适合细胞生长的条件下体外培养。
53.在一实例中，特定标志物的“水平”或“量”是在细胞被冷冻保存并且然后重新接种到培养物之后确定的。例如，在细胞的第一次冷冻保存后确定水平。在另一实例中，在细胞的第二次冷冻保存后确定水平。例如，细胞可以从冷冻保存的中间物中培养扩增，在重新接种在培养物中之前进行第二次冷冻保存，使得可以在培养条件下确定特定标志物的水平。
54.如本文所使用的，术语“治疗(treating)”、“治疗(treat)”、“治疗(treatment)”、“减少进展”包含施用间充质谱系干细胞或前体细胞群体和/或其后代和/或源自其的可溶性因子和/或源自其的细胞外囊泡，从而减少或消除至少一种进行性心力衰竭症状，或者在减少进展的情况下，延缓进行性心力衰竭的发展。
55.如本文所使用的，术语“受试者”是指人类受试者。例如，受试者可以是成年人。在另一实例中，受试者可以是儿童。在另一实例中，受试者可以是青少年。如“受试者”、“患者”或“个体”等术语是可以在本公开的上下文中互换使用的术语。需要治疗的受试者包含那些已经患有进行性心力衰竭的受试者，以及那些需要预防、延迟或停止进行性心力衰竭的受试者。
56.在一实例中，本公开的组合物包括未经基因修饰的间充质前体谱系或干细胞。如本文所使用的，术语“未经基因修饰的”是指未通过用核酸转染修饰的细胞。为避免疑义，在本公开的上下文中，用编码蛋白质的核酸转染的间充质谱系前体或干细胞将被认为是经基因修饰的。
57.如本文所用，术语“样品”是指其中可以测量crp水平的来自受试者的提取物。“样品”包含样品的提取物和/或衍生物和/或级分。在本公开中，任何生物材料都可以用作上述样品，只要它可以从受试者收集并测定以确定受试者体内的crp水平即可。在一实例中，样品是血液样品。在一实例中，血液样品是从患有nyha ii级心力衰竭的受试者中获得的。
58.贯穿本说明书，词语“包括(comprise)”或如“包括(comprises)”或“包括(comprising)”等变体应当被理解为暗示包含所陈述要素、整数或步骤或要素组、整数组或步骤组，但不排除任何其它要素、整数或步骤或要素组、整数组或步骤组。
59.贯穿本说明书，除非另有明确说明或上下文另有要求，否则对单个步骤、物质组合物、步骤组或物质组合物组的提及应被视为涵盖这些步骤、物质组合物、步骤组或物质组合物组中的一个和多个(即一种或多种)。
60.本领域的技术人员将会了解，可对在此描述的本公开加以除具体所描述的那些之外的变化和修改。应当理解，本公开包含所有此类变化和修改。本公开还包含本说明书中个别或共同提及或指出的所有步骤、特征、组合物和化合物，以及所述步骤或特征中的任何两者或更多者的任何和所有组合。
61.本公开的范围不受本文所述的具体实施例的限制，这仅出于例示的目的。如本文所描述的，功能等效的产物、组合物和方法显然在本公开的范围内。
62.除非另有明确说明，否则本文公开的任何实例在进行必要的修改后应被视为适用于任何其它实例。
63.进行性心力衰竭
64.心肌病是一种使心脏难以将血液泵送到身体的其它部位的心肌疾病。当心脏不能充分泵血来维持血液流动以满足身体的需要时，就会发生心力衰竭。心肌病可以在缺血性或非缺血性事件后发生。缺血性心力衰竭的一个原因是心肌梗死(mi)(例如心脏病发作)后的收缩功能障碍。当血液停止正常流向心脏的某一部位时，就会发生mi。血液供应不足导致局部区域心肌坏死，称为梗死或梗死形成。梗死的心脏不能充分泵血来维持血液流动以满足身体的需要，从而导致多种病理生理反应，并最终导致心力衰竭。非缺血性心肌病与已知的冠状动脉疾病无关。一个实例是扩张型心肌病(dcm)，其中心脏的泵血能力下降，因为心脏的主要泵送腔左心室变得扩大、扩张和虚弱。
65.一旦心脏不能充分泵血来维持血液流动以满足身体的需要，就会启动一系列的代偿机制，以缓冲心输出量的下降，并协助维持足够的血压以灌注重要器官。因此，患有心力衰竭的患者可能在很长一段时间内不会进展。然而，代偿机制最终不能补偿受损的心脏，从而导致心输出量的逐渐下降，称为“进行性心力衰竭”。在本公开的上下文中，术语慢性心力衰竭、充血性心力衰竭、充血性心脏衰竭、收缩功能障碍和晚期心力衰竭可以与“进行性心力衰竭”互换使用。
66.本公开的方法对患有进行性心力衰竭的患者的子集有效。在一实例中，这些受试者是基于纽约心脏协会(nyha)分级量表定义的。在一实例中，受试者的进行性心力衰竭小于iii级。在一实例中，受试者患有ii级心力衰竭。在一实例中，nyha分级是基于受试者的症状分配的。例如，nyha分级可以基于下表进行分配：
[0067][0068]
在一实例中，受试者的心力衰竭是由缺血性事件引起的。在一实例中，受试者的心力衰竭是由心肌梗死(mi)引起的。例如，受试者可以是mi受试者。术语“心肌梗死(mi)受试者”用于定义发生心肌梗死的受试者。在一实例中，受试者的心力衰竭是由非缺血性心肌病引起的。
[0069]
本公开的方法可以用于治疗特定mi受试者群体的进行性心力衰竭。需要治疗的受试者包含那些已经患有进行性心力衰竭的受试者，以及那些需要预防、延迟或停止进行性心力衰竭的受试者。在这些实例中，受试者患有基于nyha的ii级或iii级进行性心力衰竭。例如，受试者可能患有ii级进行性心力衰竭。
[0070]
在一实例中，根据本公开进行治疗的受试者具有由升高的c反应性蛋白水平所定义的“活动性炎症”。在一实例中，活动性炎症的特征在于crp水平≥2mg/l。
[0071]“c反应性蛋白”或“crp”是一种炎性介体，在急性炎性复发的条件下，所述炎性介体的水平会升高，并且一旦炎症消退，其水平会迅速正常化。在一实例中，根据本公开治疗的受试者的心脏性死亡的风险升高。心脏性死亡是由于心脏功能丧失而导致的死亡。在一实例中，根据本公开治疗的受试者具有升高的crp。术语“升高的crp”在本公开的上下文中用于指相对于基线crp水平升高的crp水平。在一实例中，crp水平≥1mg/l是升高的。在另一
实例中，crp水平≥1.5mg/l是升高的。在另一实例中，crp水平≥2mg/l是升高的。
[0072]
在一实例中，根据本公开治疗的受试者的初始crp水平≥2mg/l。例如，受试者可能患有ii级或iii级心力衰竭，并且初始crp水平≥2mg/l。在另一实例中，受试者可能患有ii级心力衰竭，并且初始crp水平≥2mg/l。在一实例中，根据本公开治疗的受试者的初始crp水平《5mg/l。在另一实例中，受试者的初始crp水平《4mg/l。在另一实例中，受试者的初始crp水平介于2mg/l与6mg/l之间。在另一实例中，受试者的初始crp水平介于3mg/l与6mg/l之间。在另一实例中，受试者的初始crp水平介于4mg/l与5mg/l之间。
[0073]
存在各种可用于测量crp水平的测定，如基于抗体的免疫测定。例如，可以使用酶联免疫吸附(elisa)测定血液样品中的crp水平。在一实例中，从患者获得血液样品，并且然后在与抗crp抗体接触之前将所述血液样品纯化。抗体结合的程度用于量化血液样品中crp的水平(例如mg/l)。在一实例中，crp是通过血浆高敏crp(hscrp)elisa测定来测量的。
[0074]
b型利钠肽(bnp)是一种由心脏产生的激素。n端(nt)前激素bnp(nt-probnp)是一种从产生bnp的同一分子释放的非活性前激素。bnp和nt-probnp都是响应于心脏内压力的变化而释放的。这些变化可能与心力衰竭和其它心脏问题有关。当心力衰竭发展或恶化时，水平会上升，并且当心力衰竭稳定时，水平会下降。因此，bnp是心力衰竭进展的有效标志物。在一实例中，在施用本公开的组合物之前，受试者的nt-probnp水平小于2200pg/ml。在另一实例中，在施用本公开的组合物之前，受试者的nt-probnp水平小于2100pg/ml。在另一实例中，在施用本公开的组合物之前，受试者的nt-probnp水平小于2000pg/ml。在另一实例中，在施用本公开的组合物之前，受试者的nt-probnp水平小于1900pg/ml。在另一实例中，在施用本公开的组合物之前，受试者的nt-probnp水平介于2200pg/ml与1000pg/ml之间。在另一实例中，在施用本公开的组合物之前，受试者的nt-probnp水平介于2200pg/ml与1100pg/ml之间。在另一实例中，在施用本公开的组合物之前，受试者的nt-probnp水平介于2100pg/ml与1200pg/ml之间。在另一实例中，在施用本公开的组合物之前，受试者的nt-probnp水平介于2000pg/ml与1500pg/ml之间。存在各种可用于测量nt-probnp水平的测定，如基于抗体的免疫测定，例如elisa测定。在一实例中，从患者获得血液样品，并且然后在与抗nt-probnp抗体接触之前将所述血液样品纯化。抗体结合的程度用于量化血液样品中nt-probnp的水平(例如pg/l)。
[0075]
在另一实例中，受试者在施用本文公开的组合物之前的先前12个月内具有心力衰竭住院事件。在另一实例中，受试者在施用本文公开的组合物之前的先前9个月内具有心力衰竭住院事件。在另一实例中，受试者在施用本文公开的组合物之前的6至12个月内具有心力衰竭住院事件。在一实例中，心力衰竭住院事件是心力衰竭的体征和症状恶化。在另一实例中，心力衰竭住院事件是缺血性事件。在另一实例中，心力衰竭住院是非缺血性事件。
[0076]
在另一实例中，受试者在施用本公开的组合物之前能够在6分钟内行走至少320米。在另一实例中，受试者在施用本公开的组合物之前能够在6分钟内行走至少330米。在另一实例中，受试者在施用本公开的组合物之前能够在6分钟内行走至少340米。在另一实例中，受试者在施用本公开的组合物之前能够在6分钟内行走至少350米。
[0077]
在一实例中，受试者可以患有持续性左心室功能障碍。左心室功能障碍的特征在于心肌收缩力下降。当左心室内心肌收缩力下降时，左心室射血分数(lvef)降低。因此，lvef提供了一种确定左心室功能障碍的方法。
[0078]
lvef和lvesv可以通过本领域已知的许多方法来测量，如超声心动图、单光子发射计算机断层扫描(spect)或心脏磁共振成像(cmri)。
[0079]
在一实例中，lvef小于45％的受试者患有左心室功能障碍。在其它实例中，lvef小于约44％、43％、42％、41％的受试者患有左心室功能障碍。在另一实例中，lvef小于约40％的受试者患有左心室功能障碍。在其它实例中，lvef小于约39％、38％、37％、36％、35％、34％、33％、32％、31％、30％的受试者患有左心室功能障碍。
[0080]
在本公开的上下文中，术语“持续性左心室功能障碍”用于定义在一定时间段或一系列测量中持续的左心室功能障碍。例如，“持续性左心室功能障碍”可以包含持续约1至约14天或更长时间的左心室功能障碍。
[0081]
在一实例中，受试者的lvef小于45％。在另一实例中，受试者的lvef小于40％。在其它实例中，受试者的lvef小于39％、38％、37％、36％、35％、34％、33％、32％、31％、30％。
[0082]
本公开的方法涉及以进行性心力衰竭为特征的心输出量的逐渐下降的治疗。因此，在本公开的上下文中，“治疗(treat)”和“治疗(treatment)”是指治疗性治疗和防治或预防措施。
[0083]
在一实例中，治疗包含施用本公开的组合物。在一实例中，本公开的方法减少或抑制进行性心力衰竭的进展。在一实例中，治疗抑制受试者的向nyha iii级进行性心力衰竭的进展。在另一实例中，治疗降低了心脏性死亡的风险。在一实例中，心脏性死亡的风险降低是相对于患有nyha iii级进行性心力衰竭的受试者的心脏性死亡的风险而言的。在另一实例中，在治疗后缺血性mace(mi或中风)的风险降低。在一实例中，缺血性mace(mi或中风)的风险相对于基线降低了至少50％。在另一实例中，缺血性mace(mi或中风)的风险相对于基线降低了至少55％。在另一实例中，缺血性mace(mi或中风)的风险相对于基线降低了至少60％。在另一实例中，缺血性mace(mi或中风)的风险相对于基线降低了至少65％。在另一实例中，缺血性mace(mi或中风)的风险相对于基线降低了至少70％。在另一实例中，缺血性mace(mi或中风)的风险相对于基线降低了至少50％至70％。
[0084]
在另一实例中，在治疗后，3点mace(心脏性死亡/mi/中风)的风险降低。在本公开的上下文中，“3点mace”用于指被定义为心血管死亡、非致死性心肌梗死和非致死性中风(心脏性死亡/mi/中风)的复合。在一实例中，3点mace的风险相对于基线降低了至少30％。在另一实例中，3点mace的风险相对于基线降低了至少40％。在另一实例中，3点mace的风险相对于基线降低了至少45％。在另一实例中，3点mace的风险相对于基线降低了至少50％。在另一实例中，3点mace的风险相对于基线降低了至少30％至50％。
[0085]
在一实例中，治疗增加了患者的存活率。在一实例中，治疗增加受试者在开始治疗后存活至少1000天的概率。在另一实例中，治疗增加受试者在开始治疗后存活至少2000天的概率。在一实例中，相对于未用本公开的组合物治疗的受试者确定增加的概率。在一实例中，相对于患有iii级心力衰竭的受试者确定增加的概率。
[0086]
在一实例中，治疗降低心力衰竭相关的主要不良心脏事件(hf-mace)的机会或风险，所述hf-mace定义为心脏相关死亡或复苏性心脏性死亡或非致死性失代偿性心力衰竭事件的复合。在一实例中，在施用本文公开的组合物后至少6个月、至少12个月、至少24个月、至少36个月内降低hf-mace的机会或风险。在一实例中，治疗降低了全因死亡的机会或风险。
[0087]
缺血性事件
[0088]
在一实例中，本公开涉及降低受试者，特别是患有心肌病的受试者的缺血性事件的风险或发生率的方法。在一实例中，本公开涉及降低患有心肌病且crp升高的受试者的缺血性事件的风险或发生率的方法。在一实例中，风险或发生率相对于未接受本公开的组合物的受试者降低。例如，相对于未经治疗的受试者，风险或发病率可以降低。在一实例中，缺血性事件是由闭塞的形成引起的。在一实例中，闭塞是动脉闭塞。在一实例中，缺血性事件是脑血管闭塞的形成。在另一实例中，缺血性事件是心脏闭塞的形成。例如，闭塞可以在冠状动脉中形成。
[0089]
由闭塞形成引起的缺血性事件的实例包含心肌梗死和中风。因此，在一实例中，本公开涉及降低患有心肌病的受试者的心肌梗死或中风的风险或发生率的方法。
[0090]
通过施用如本公开的组合物等细胞疗法来降低患有心肌病的受试者的缺血性事件的风险或发生率。
[0091]
在一实例中，受试者患有非缺血性心肌病。例如，受试者的心肌病可能是由左心室增大引起的(扩张型心肌病)。在另一实例中，心肌病是由病毒感染引起的。
[0092]
在另一实例中，受试者根据纽约心脏协会(nyha)分级量表患有ii级或iii级心力衰竭。
[0093]
在另一实例中，受试者的n端前b型利钠肽(nt-probnp)水平在施用所述细胞之前介于1000pg/ml与2000pg/ml之间。在另一实例中，所述受试者的c反应性蛋白(crp)水平升高。在另一实例中，所述受试者的crp水平≥1.5mg/l。在另一实例中，所述受试者的crp水平≥2mg/l。在另一实例中，所述受试者的crp水平介于1mg/l与5mg/l之间。在另一实例中，所述受试者的crp水平介于3mg/l与5mg/l之间。
[0094]
在一实例中，所述细胞经心内膜施用。
[0095]
在一实例中，降低的风险是降低的3年风险。在另一实例中，降低的风险是降低的5年风险。在这些实例中，缺血性事件的风险在定义的时间段内降低。
[0096]
间充质谱系前体细胞
[0097]
如本文所使用的，术语“间充质谱系前体或干细胞(mlpsc)”是指未分化的多能细胞，所述多能细胞具有自我更新的能力同时保持多能性以及分化为许多间充质来源(例如，成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、基质细胞、成纤维细胞和肌腱)或非中胚层来源(例如，肝细胞、神经细胞和上皮细胞)的细胞类型的能力。为避免疑义，“间充质谱系前体细胞”是指可以分化为如骨、软骨、肌肉和脂肪细胞以及纤维结缔组织等间充质细胞的细胞。
[0098]
术语“间充质谱系前体或干细胞”包含亲本细胞以及其未分化的后代。所述术语还包含间充质前体细胞、多能基质细胞、间充质干细胞(msc)、血管周围间充质前体细胞以及其未分化的后代。
[0099]
间充质谱系前体或干细胞可以是自体的、同种异体的、异种的、同源的(syngenic)或同基因的(isogenic)。自体细胞是从其将被重新植入的同一个体中分离的。同种异体细胞是从同一物种的供体中分离的。异种细胞是从另一物种的供体中分离的。同源或同基因细胞是从基因相同的生物体中分离的，如双胞胎、克隆或高度近交的研究动物模型。
[0100]
在一实例中，间充质谱系前体或干细胞是同种异体的。在一实例中，同种异体间充质谱系前体或干细胞被培养扩增并冷冻保存。
[0101]
间充质谱系前体或干细胞主要存在于骨髓中，但也显示存在于多种宿主组织中，包含例如脐带血和脐带、成人外周血、脂肪组织、小梁骨和牙髓。其也存在于皮肤、脾脏、胰腺、脑、肾、肝、心脏、视网膜、脑、毛囊、肠、肺、淋巴结、胸腺、韧带、肌腱、骨骼肌、真皮和骨膜中；并且能够分化成种系，如中胚层和/或内胚层和/或外胚层。因此，间充质谱系前体或干细胞能够分化成大量细胞类型，包含但不限于脂肪、骨、软骨、弹性组织、肌肉和纤维结缔组织。这些细胞进入的特定谱系定型和分化途径取决于来自机械影响和/或如生长因子、细胞因子和/或宿主组织建立的局部微环境条件等内源性生物活性因子的各种影响。
[0102]
术语“富集的”、“富集”或其变体在本文中用于描述与未处理的细胞群体(例如，在其自然环境中的细胞)相比，一种特定细胞类型的比例或多种特定细胞类型的比例增加的细胞群体。在一实例中，富集间充质谱系前体或干细胞的群体包括至少约0.1％或0.5％或1％或2％或5％或10％或15％或20％或25％或30％或50％或75％的间充质谱系前体或干细胞。在此方面，将采用术语“富集间充质谱系前体或干细胞的细胞群体”来明确支持术语“包括x％间充质谱系前体或干细胞的细胞群体”，其中x％是如本文叙述的百分比。在一些实例中，间充质谱系前体或干细胞可以形成克隆源性集落，例如cfu-f(成纤维细胞)或其子集(例如，50％或60％或70％或70％或90％或95％)可以具有此活性。
[0103]
在本公开的一实例中，间充质谱系前体或干细胞是间充质干细胞(msc)。msc可以是均质组合物或可以是在msc中富集的混合细胞群体。可以通过培养粘附骨髓或骨膜细胞获得均质msc组合物，并且可以通过用独特的单克隆抗体鉴定的特定细胞表面标志物来鉴定msc。例如，在美国专利第5,486,359号中描述了一种用于获得富集在msc中的细胞群体的方法。msc的替代性来源包含但不限于血液、皮肤、脐带血、肌肉、脂肪、骨和软骨膜。在一实例中，msc是同种异体的。在一实例中，msc是冷冻保存的。在一实例中，msc是培养扩增且冷冻保存的。
[0104]
在另一实例中，间充质谱系前体或干细胞是cd29+、cd54+、cd73+、cd90+、cd102+、cd105+、cd106+、cd166+、mhc1+msc。
[0105]
分离的或富集的间充质谱系前体或干细胞可以通过培养在体外扩增。分离的或富集的间充质谱系前体或干细胞可以冷冻保存、解冻，然后通过培养在体外扩增。
[0106]
在一个实例中，分离的或富集的间充质谱系前体或干细胞以50,000个活细胞/cm2接种于培养基(无血清或补充有血清)中，例如补充有5％胎牛血清(fbs)和谷氨酰胺的α最小必需培养基(αmem)，并且使其在37℃、20％ o2下粘附在培养容器上过夜。随后根据需要更换和/或改变培养基，并且将细胞在37℃、5％ o2下进一步培养68小时至72小时。
[0107]
如本领域技术人员将理解的，培养的间充质谱系前体或干细胞在表型上不同于体内细胞。例如，在一个实施例中，其表达以下标志物中的一种或多种：cd44、ng2、dc146和cd140b。培养的间充质谱系前体或干细胞在生物学上也不同于体内细胞，与体内大部分非循环(静态)细胞相比，具有更高的增殖率。
[0108]
在一个实例中，细胞群体从包括可选择形式的stro-1+细胞的细胞制剂富集。在此方面，术语“可选择形式”将被理解为意指细胞表达允许选择stro-1+细胞的标志物(例如，细胞表面标志物)。标志物可以是stro-1，但不一定是。例如，如本文所描述的和/或例示的，表达stro-2和/或stro-3(tnap)和/或stro-4和/或vcam-1和/或cd146和/或3g5的细胞(例如，间充质前体细胞)还表达stro-1(并且可以是stro-1bright)。因此，细胞为stro-1+的指
示并不意味着细胞仅通过stro-1表达来选择。在一个实例中，至少基于stro-3表达来选择细胞，例如，其为stro-3+(tnap+)。
[0109]
提及细胞或其群体的选择不一定需要从特定组织来源中选择。如本文所描述的，stro-1+细胞可以选自或分离自或富集自多种来源。也就是说，在一些实例中，这些术语为从包括stro-1+细胞(例如，间充质前体细胞)的任何组织或血管化组织或包括周细胞(例如，stro-1+周细胞)的组织或本文所述的组织中的任何一种或多种组织中选择提供了支持。
[0110]
在一个实例中，本公开中使用的细胞单独或共同表达一种或多种标志物，所述标志物选自由以下组成的组：tnap+、vcam-1+、thy-1+、stro-2+、stro-4+(hsp-90β)、cd45+、cd146+、3g5+或其任何组合。
[0111]“单独地”意指本公开单独涵盖所述标志物或标志物组，并且尽管本文中可能未单独列出单独的标志物或标志物组，但所附权利要求可以将此类标志物或标志物组彼此单独和分开定义。
[0112]“共同地”意指本公开涵盖所述标志物或标志物组的任何数量或组合，并且尽管标志物或标志物组的此类数量或组合可能未在本文中具体列出，但所附权利要求可以将此类组合或子组合与任何其它标志物组合或标志物组单独和分开定义。
[0113]
如本文所使用的，术语“tnap”旨在涵盖组织非特异性碱性磷酸酶的所有同种型。例如，所述术语涵盖肝脏同种型(lap)、骨同种型(bap)和肾脏同种型(kap)。在一个实例中，tnap为bap。在一个实例中，如本文所使用的tnap是指可以与由根据《布达佩斯条约(budapest treaty)》的规定以保藏登记号pta-7282于2005年12月19日保藏在atcc的杂交瘤细胞系产生的stro-3抗体结合的分子。
[0114]
此外，在一个实例中，stro-1+细胞能够产生克隆源性cfu-f。
[0115]
在一个实例中，显著比例的stro-1+细胞能够分化成至少两个不同的种系。stro-1+细胞可以定型为的谱系的非限制性实例包含骨前体细胞；肝细胞祖细胞，所述祖细胞对胆管上皮细胞和肝细胞具有多能性；神经受限细胞，所述神经受限细胞可以生成胶质细胞前体，所述胶质细胞前体进展为少突胶质细胞和星形胶质细胞；进展为神经元的神经元前体；心肌和心肌细胞的前体，葡萄糖反应性胰岛素分泌胰腺β细胞系。其它谱系包含但不限于成牙质细胞、产生牙质的细胞和软骨细胞，以及以下的前体细胞：视网膜色素上皮细胞、成纤维细胞、如角质形成细胞等皮肤细胞、树突细胞、毛囊细胞、肾导管上皮细胞、平滑肌和骨骼肌细胞、睾丸祖细胞、血管内皮细胞、肌腱、韧带、软骨、脂肪细胞、成纤维细胞、骨髓基质、心肌、平滑肌、骨骼肌、周细胞、血管、上皮细胞、胶质细胞、神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。
[0116]
在一实例中，间充质谱系前体或干细胞从单个供体或多个供体获得，其中供体样品或间充质谱系前体或干细胞随后被汇集，然后培养扩增。
[0117]
本公开所涵盖的间充质谱系前体或干细胞也可以在向受试者施用之前冷冻保存。在一实例中，间充质谱系前体或干细胞在向受试者施用之前进行培养扩增和冷冻保存。
[0118]
在一实例中，本公开涵盖间充质谱系前体或干细胞以及其后代、源自其的可溶性因子和/或从其分离的胞外囊泡。在另一实例中，本公开涵盖间充质谱系前体或干细胞以及从其分离的胞外囊泡。例如，可以在适合将胞外囊泡分泌到细胞培养基中的条件下培养扩
增本公开的间充质前体谱系或干细胞一定时间段。随后可以从培养基中获得分泌的胞外囊泡用于疗法。
[0119]
如本文所使用的，术语“胞外囊泡”是指从细胞中自然释放的脂质颗粒，并且其大小范围从约30nm至大至10微米，尽管其大小通常小于200nm。其可以含有来自释放细胞(例如，间充质干细胞；stro-1
+
细胞)的蛋白质、核酸、脂质、代谢物或细胞器。
[0120]
如本文所使用的，术语“外泌体”是指一种类型的胞外囊泡，其大小通常在约30nm至约150nm的范围内，并且源自哺乳动物细胞的核内体区室，其从所述区室运输到细胞膜并且释放。其可以含有核酸(例如，rna；微小rna)、蛋白质、脂质和代谢物，并且可以通过从一个细胞分泌并被其它细胞吸收以递送其货物而在细胞间通讯中发挥作用。
[0121]
在一实例中，本公开的组合物包括诱导靶组织中的新血管形成的细胞。在一实例中，靶组织是心脏。在另一实例中，细胞分泌保护处于危险中的或受损的心肌的因子。在一实例中，处于危险中的或受损的心肌受由缺血性事件导致的血流缺乏的影响。在一实例中，细胞分泌减少心肌细胞凋亡的因子。
[0122]
细胞的培养扩增
[0123]
在一实例中，间充质谱系前体或干细胞被培养扩增。“培养扩增的”间充质谱系前体或干细胞培养基与新鲜分离的细胞的区别在于其已在细胞培养基中培养并传代(即传代培养)。在一实例中，培养扩增的间充质谱系前体或干细胞被培养扩增约4次传代至10次传代。在一实例中，间充质谱系前体或干细胞被培养扩增至少5次传代、至少6次传代、至少7次传代、至少8次传代、至少9次传代、至少10次传代。例如，间充质谱系前体或干细胞可以被培养扩增至少5次传代。在一实例中，间充质谱系前体或干细胞可以被培养扩增至少5次传代至10次传代。在一实例中，间充质谱系前体或干细胞可以被培养扩增至少5次传代至8次传代。在一实例中，间充质谱系前体或干细胞可以被培养扩增至少5次传代至7次传代。在一实例中，间充质谱系前体或干细胞可以被培养扩增多于10次传代。在另一实例中，间充质谱系前体或干细胞可以被培养扩增多于7次传代。在这些实例中，干细胞可以在被冷冻保存之前进行培养扩增以提供中间冷冻保存的mlpsc群体。在一实例中，本公开的组合物通过培养来自中间冷冻保存的mlpsc群体或换言之冷冻保存的中间体的细胞产生。
[0124]
在一实例中，本公开的组合物包括从冷冻保存的中间体培养扩增的间充质谱系前体或干细胞。在一实例中，将从冷冻保存的中间体培养扩增的细胞培养扩增至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10次传代。例如，间充质谱系前体或干细胞可以被培养扩增至少5次传代。在一实例中，间充质谱系前体或干细胞可以被培养扩增至少5次传代至10次传代。在一实例中，间充质谱系前体或干细胞可以被培养扩增至少5次传代至8次传代。在一实例中，间充质谱系前体或干细胞可以被培养扩增至少5次传代至7次传代。在一实例中，间充质谱系前体或干细胞可以被培养扩增多于10次传代。在另一实例中，间充质谱系前体或干细胞可以被培养扩增多于7次传代。
[0125]
在一实例中，从冷冻保存的中间体培养扩增的间充质谱系前体或干细胞可以在不含动物蛋白的培养基中培养扩增。在一实例中，从冷冻保存的中间体培养扩增的间充质谱系前体或干细胞可以在无异源成分培养基中培养扩增。在一实例中，从冷冻保存的中间体培养扩增的间充质谱系前体或干细胞可以在不含胎牛血清的培养基中培养扩增。
[0126]
在一实施例中，间充质谱系前体或干细胞可以从单个供体或多个供体获得，其中
供体样品或间充质谱系前体或干细胞随后被汇集，然后培养扩增。在一实例中，培养扩增过程包括：
[0127]
i.通过传代扩增来扩增多个活细胞以提供至少约10亿个活细胞的制剂，其中传代扩增包括建立分离的间充质谱系前体或干细胞的原代培养，并且然后连续建立从先前培养物中分离的间充质谱系前体或干细胞的第一非原代(p1)培养；
[0128]
ii.通过传代扩增将分离的间充质谱系前体或干细胞的p1培养扩增至间充质谱系前体或干细胞的第二非原代(p2)培养；以及
[0129]
iii.制备和冷冻保存从间充质谱系前体或干细胞的p2培养中获得的处理中的中间间充质谱系前体或干细胞制剂；以及
[0130]
iv.将冷冻保存的处理中的中间间充质谱系前体或干细胞制剂解冻并通过传代扩增来扩增处理中的中间间充质谱系前体或干细胞制剂。
[0131]
在一实例中，扩增的间充质谱系前体或干细胞制剂具有抗原谱和活性谱，所述抗原谱和活性谱包括：
[0132]
i.小于约0.75％的cd45+细胞；
[0133]
ii.至少约95％的cd105+细胞；
[0134]
iii.至少约95％的cd166+细胞。
[0135]
在一实例中，相对于对照，扩增的间充质谱系前体或干细胞制剂能够抑制cd3/cd28激活的pbmc的il2-rα表达至少约30％。
[0136]
在一实例中，培养扩增的间充质谱系前体或干细胞被培养扩增约4次传代至10次传代，其中间充质谱系前体或干细胞在被进一步培养扩增之前在至少2次传代或3次传代后被冷冻保存。在一实例中，将间充质谱系前体或干细胞培养扩增至少1次传代、至少2次传代、至少3次传代、至少4次传代、至少5次传代，冷冻保存，然后在根据本公开的方法培养之前进一步培养扩增至少1次传代、至少2次传代、至少3次传代、至少4次传代、至少5次传代。
[0137]
可以使用本领域已知的任何设备和细胞处理方法进行间充质谱系前体或干细胞分离和离体扩增的过程。本公开的各种培养扩增实施例采用需要对细胞进行操作的步骤，例如，接种、进料、解离粘附培养物或洗涤的步骤。任何操控细胞的步骤都有可能损伤细胞。尽管间充质谱系前体或干细胞在制备期间总体上可以承受一定量的损伤，但细胞优选地通过充分执行给定步骤同时最小化对细胞的损伤的处理程序和/或设备进行操控。
[0138]
在一实例中，间充质谱系前体或干细胞在包含细胞来源袋、洗涤溶液袋、再循环洗涤袋、具有入口和出口端口的旋转膜过滤器、滤液袋、混合区、用于洗涤的细胞的最终产物袋和适当的管道的设备中洗涤，例如，如us 6,251,295中所描述的，所述文献特此通过引用并入。
[0139]
在一实例中，根据本公开培养的间充质谱系前体或干细胞组合物在cd105阳性和cd166阳性和cd45阴性方面是95％均质的。在一实例中，此均质性通过离体扩增持续存在；即虽然多次群体倍增。
[0140]
在一实例中，本公开的间充质谱系前体或干细胞在3d培养中被培养扩增。例如，本公开的间充质谱系前体或干细胞可以在生物反应器中被培养扩增。在一实例中，本公开的间充质谱系前体或干细胞首先在2d培养中被培养扩增，然后在3d培养中进一步扩增。在一实例中，本公开的间充质谱系前体或干细胞是从主细胞库中培养扩增的。在一实例中，本公
开的间充质谱系前体或干细胞在接种于3d培养之前在2d培养中从主细胞库中培养扩增。在一实例中，本公开的间充质谱系前体或干细胞在生物反应器中在接种于3d培养中之前在2d培养中从主细胞库中培养扩增至少3天。在一实例中，本公开的间充质谱系前体或干细胞在生物反应器中在接种于3d培养中之前在2d培养中从主细胞库中培养扩增至少4天。在一实例中，本公开的间充质谱系前体或干细胞在生物反应器中在接种于3d培养之前在2d培养中从主细胞库中培养扩增3天至5天。在这些实例中，2d培养可以在细胞工厂中进行。各种细胞工厂产物可商购获得(例如赛默飞世尔公司(thermofisher)、西格玛公司(sigma))。
[0141]
细胞培养基
[0142]
本文公开的间充质谱系前体或干细胞可以在各种合适的生长培养基中培养扩增。
[0143]
如在本公开的上下文中使用的术语“培养基”(“medium”或“media”)包含细胞周围环境的组分。培养基有助于和/或提供适于允许细胞生长的条件。培养基可以是固态的、液态的、气态的或相和材料的混合物。培养基可以包含液态生长培养基以及不维持细胞生长的液态培养基。培养基还包含凝胶状培养基，如琼脂、琼脂糖、明胶和胶原蛋白基质。示例性气态培养基包含在培养皿或其它固态或半固态载体上生长的细胞所暴露的气相。
[0144]
用于培养扩增的细胞培养基含有所有必需氨基酸，并且还可以含有非必需氨基酸。通常，氨基酸被分类为必需氨基酸(thr、met、val、leu、ile、phe、trp、lys、his)和非必需氨基酸(gly、ala、ser、cys、gln、asn、asp、tyr、arg、pro)。
[0145]
本领域的技术人员将理解，为了获得最佳结果，基础培养基必须适于所关注的细胞系。例如，如果发现基础培养基中的葡萄糖(或其它能量源)已耗尽并因此限制了生长，则可能需要增加此能量源的水平，或在培养过程期间添加葡萄糖(或其它能量源)。在一实例中，溶解氧(do)水平还可以是受控的。
[0146]
在一实例中，细胞培养基含有人来源的添加剂。例如，可以向细胞培养基中添加人血清和人血小板细胞裂解物。
[0147]
在一实例中，细胞培养基仅含有人来源的添加剂。因此，在一实例中，细胞培养基是不含异种的。为避免疑问，在这些实例中，培养基是不含动物蛋白的。在一实例中，本公开的方法中使用的细胞培养基是不含动物组分的。
[0148]
在一实例中，培养基包括血清。在其它实例中，培养基是包括促进间充质谱系前体或干细胞增殖的生长因子的不含胎牛血清的培养基。在一实施例中，培养基是不含血清的干细胞培养基。在一实例中，细胞培养基包括：
[0149]
基础培养基；
[0150]
血小板源性生长因子(pdgf)；
[0151]
成纤维细胞生长因子2(fgf2)。
[0152]
在一实例中，培养基包括血小板源性生长因子(pdgf)和成纤维细胞生长因子2(fgf2)，其中fgf2的水平小于约6ng/ml。例如，fgf2水平可以小于约5ng/ml、小于约4ng/ml、小于约3ng/ml、小于约2ng/ml、小于约1ng/ml。在其它实例中，fgf2水平小于约0.9ng/ml、小于约0.8ng/ml、小于约0.7ng/ml、小于约0.6ng/ml、小于约0.5ng/ml、小于约0.4ng/ml、小于约0.3ng/ml、小于约0.2ng/ml。
[0153]
在另一实例中，fgf2的水平介于约1pg/ml与100pg/ml之间。在另一实例中，fgf2水平介于约5pg/ml与80pg/ml之间。
[0154]
在一实例中，pdgf为pdgf-bb。在一实例中，pdgf-bb水平介于约1ng/ml与150ng/ml之间。在另一实例中，pdgf-bb水平介于约7.5ng/ml与120ng/ml之间。在另一实例中，pdgf-bb水平介于约15ng/ml与60ng/ml之间。在另一实例中，pdgf-bb水平为至少约10ng/ml。在另一实例中，pdgf-bb水平为至少约15ng/ml。在另一实例中，pdgf-bb水平为至少约20ng/ml。在另一实例中，pdgf-bb水平为至少约21ng/ml。在另一实例中，pdgf-bb水平为至少约22ng/ml。在另一实例中，pdgf-bb水平为至少约23ng/ml。在另一实例中，pdgf-bb水平为至少约24ng/ml。在另一实例中，pdgf-bb水平为至少约25ng/ml。
[0155]
在另一实例中，pdgf为pdgf-ab。在一实例中，pdgf-ab水平介于约1ng/ml与150ng/ml之间。在另一实例中，pdgf-ab水平介于约7.5ng/ml与120ng/ml之间。在另一实例中，pdgf-ab水平介于约15ng/ml与60ng/ml之间。在另一实例中，pdgf-ab水平为至少约10ng/ml。在另一实例中，pdgf-ab水平为至少约15ng/ml。在另一实例中，pdgf-ab水平为至少约20ng/ml。在另一实例中，pdgf-ab水平为至少约21ng/ml。在另一实例中，pdgf-ab水平为至少约22ng/ml。在另一实例中，pdgf-ab水平为至少约23ng/ml。在另一实例中，pdgf-ab水平为至少约24ng/ml。在另一实例中，pdgf-ab水平为至少约25ng/ml。
[0156]
在其它实例中，可以向细胞培养基中添加另外的因子。在一实例中，培养基进一步包括egf。egf是为通过与其受体egfr结合刺激细胞增殖的生长因子。在一实例中，本公开的方法包括在进一步包括egf的不含胎牛血清的细胞培养基中培养干细胞群体。在一实例中，egf水平介于约0.1ng/ml与7ng/ml之间。例如，egf水平可以为至少约5ng/ml。
[0157]
在另一实例中，egf水平介于约0.2ng/ml与3.2ng/ml之间。在另一实例中，egf水平介于约0.4ng/ml与1.6ng/ml之间。在另一实例中，egf水平介于约0.2ng/ml。在另一实例中，egf水平为至少约0.3ng/ml。在另一实例中，egf水平为至少约0.4ng/ml。在另一实例中，egf水平为至少约0.5ng/ml。在另一实例中，egf水平为至少约0.6ng/ml。在另一实例中，egf水平为至少约0.7ng/ml。在另一实例中，egf水平为至少约0.8ng/ml。在另一实例中，egf水平为至少约0.9ng/ml。在另一实例中，egf水平为至少约1.0ng/ml。
[0158]
在以上实例中，如αmem或stemspan
tm
等基础培养基可以补充有参考量的生长因子。在一实例中，培养基包括补充有32ng/ml pdgf-bb、0.8ng/ml egf和0.02ng/ml fgf的αmem或stemspan
tm
。
[0159]
在其它实例中，可以向细胞培养基中添加另外的因子。例如，细胞培养基可以补充有一种或多种刺激因子，所述一种或多种刺激因子选自由以下组成的组：表皮生长因子(egf)、1α,25-二羟基维生素d3(1,25d)、肿瘤坏死因子α(tnf-α)、白介素-lβ(il-lβ)和基质源性因子lα(sdf-lα)。在另一实施例中，还可以在存在量足以支持细胞的生长的至少一种细胞因子的情况下培养细胞。在另一实施例中，可以在存在肝素或其衍生物的情况下培养细胞。例如，细胞培养基可以含有约50ng/ml的肝素。在其它实例中，细胞培养基含有约60ng/ml的肝素、约70ng/ml的肝素、约80ng/ml的肝素、约90ng/ml的肝素、约100ng/ml的肝素、约110ng/ml的肝素、约110ng/ml的肝素、约120ng/ml的肝素、约130ng/ml的肝素、约140ng/ml的肝素、约150ng/ml的肝素或其衍生物。在一实例中，肝素衍生物为硫酸盐。各种形式的硫酸肝素在本领域是已知的，并且包含硫酸肝素2(hs2)。hs2可以来自各种来源，包含例如雄性和/或雌性哺乳动物的肝脏。因此，示例性的硫酸肝素包含雄性肝硫酸肝素(mml hs)和雌性肝硫酸肝素(fml hs)。
[0160]
在另一实例中，本公开的细胞培养基促进干细胞增殖，同时将干细胞维持在未分化状态。当干细胞尚未成为特定分化谱系时，其被视为未分化。如以上讨论的，干细胞显示出区别于分化细胞的形态特征。此外，未分化的干细胞表达可以用作用于检测分化状态的标志物的基因。多肽产物还可以用作用于检测分化状态的标志物。因此，本领域的技术人员可以使用常规形态学、遗传学和/或蛋白质组学分析容易地确定本公开的方法是否将干细胞维持在未分化状态。
[0161]
细胞的修饰
[0162]
本文公开的间充质谱系前体或干细胞可以以此类方式改变，即在施用时，细胞的裂解被抑制。抗原的改变可以诱导免疫无应答或耐受性，从而预防诱导免疫应答的效应子阶段(例如，细胞毒性t细胞产生、抗体产生等)，所述效应子阶段最终导致正常免疫应答中对外来细胞的排斥。可以改变以实现此目标的抗原包含例如mhc i类抗原、mhc ii类抗原、lfa-3和icam-1。
[0163]
间充质谱系前体或干细胞也可以被基因修饰以表达对横纹骨骼肌细胞的分化和/或维持具有重要意义的蛋白质。示例性蛋白质包含生长因子(tgf-β、胰岛素样生长因子1(igf-1)、fgf)、成肌因子(例如，myod、成肌素、成肌因子5(myf5)、成肌调节因子(mrf))、转录因子(例如，gata-4)、细胞因子(例如，嗜心素-1)、神经调节蛋白家族成员(例如，神经调节蛋白1、2和3)和同源盒基因(例如，csx、tinman和nkx家族)。
[0164]
组合物
[0165]
本文公开的间充质谱系或干细胞可以从冷冻保存的中间体培养扩增以产生含有至少一个治疗剂量的制剂。
[0166]
在一实例中，本公开的组合物包括10
×
106个细胞至35
×
106个细胞。在另一实例中，组合物包括20
×
106个细胞至30
×
106个细胞。在其它实例中，组合物包括至少100
×
106个细胞。在另一实例中，组合物包括50
×
106个细胞至500
×
106个细胞。在其它实例中，本公开的组合物包括1.5亿个细胞。
[0167]
在一个实例中，本公开的组合物包括药学上可接受的载体和/或赋形剂。术语“载体”和“赋形剂”是指本领域常规用于促进活性化合物的储存、施用和/或生物活性的物质组合物(参见例如《雷明顿氏药物科学(remington's pharmaceutical sciences)》,第16版,马克出版公司(mac publishing company)(1980))。载体还可以减少活性化合物的任何不期望的副作用。合适的载体是例如稳定的，例如不能与载体中的其它成分反应。在一个实例中，载体在用于治疗的剂量和浓度下不会在接受者中产生显著的局部或全身副作用。
[0168]
本公开的合适载体包含常规使用的那些，例如水、盐水、右旋糖水溶液、乳糖、林格氏溶液(ringer's solution)、缓冲溶液、透明质酸和二醇是示例性的液体载体，特别是(当为等渗的时)对于溶液。合适的药物载体和赋形剂包含淀粉、纤维素、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、稻米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸镁、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、氯化钠、甘油、丙二醇、水、乙醇等。
[0169]
在另一实例中，载体是培养基组合物，例如，细胞在其中生长或悬浮。此类培养基组合物不会在将其施用到的受试者中引起任何副作用。示例性载体和赋形剂不会不利地影响细胞的活力和/或细胞治疗或预防疾病的能力。
[0170]
在一个实例中，载体或赋形剂提供缓冲活性以将细胞和/或可溶性因子维持在合
适的ph，从而发挥生物活性，例如载体或赋形剂是磷酸盐缓冲盐水(pbs)。pbs代表有吸引力的载体或赋形剂，因为其与细胞和因子的相互作用最小并且允许细胞和因子的快速释放，在此类情况下，本公开的组合物可以生产为用于直接应用到血流中或进入组织或组织周围或邻近组织的区域的液体，例如通过注射。
[0171]
本公开的组合物可以被冷冻保存。可以使用本领域已知的慢速冷却方法或
‘
快速’冷冻方案进行间充质谱系前体或干细胞的冷冻保存。优选地，与未冷冻细胞相比，冷冻保存的方法保持冷冻保存的细胞的相似表型、细胞表面标志物和生长速率。
[0172]
冷冻保存的组合物可以包括冷冻保存溶液。冷冻保存溶液的ph通常为6.5至8，优选地7.4。
[0173]
冷冻保存溶液可以包括无菌、无热原等渗溶液，例如plasmalyte atm。100ml的plasmalyte atm含有526mg氯化钠，usp(nacl)；502mg葡萄糖酸钠(c6h11nao7)；368mg三水乙酸钠，usp(c2h3nao2
·
3h2o)；37mg氯化钾，usp(kcl)；以及30mg氯化镁，usp(mgcl2
·
6h2o)。其不含抗微生物剂。用氢氧化钠调整ph。ph为7.4(6.5至8.0)。
[0174]
冷冻保存溶液可以包括profreeze
tm
。冷冻保存溶液可以另外或可替代地包括培养基，例如αmem。
[0175]
为了促进冷冻，通常将冷冻保护剂，例如二甲亚砜(dmso)添加到冷冻保存溶液中。理想地，冷冻保护剂应该对细胞和患者无毒、无抗原性、化学惰性，在解冻后提供高存活率并允许移植而无需洗涤。然而，最常用的冷冻保护剂dmso显示出一些细胞毒性。羟乙基淀粉(hes)可以用作替代品或与dmso结合使用，以降低冷冻保存溶液的细胞毒性。
[0176]
冷冻保存溶液可以包括dmso、羟乙基淀粉、人血清组分和其它蛋白质填充剂中的一种或多种。在一个实例中，冷冻保存的溶液包括plasma-lyte a(70％)、dmso(10％)、hsa(25％)溶液，所述hsa溶液包括5％ hsa和15％缓冲液。
[0177]
在一实例中，冷冻保存溶液可以进一步包括甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮(pvp)和海藻糖中的一种或多种。
[0178]
冷冻保存的组合物可以解冻并直接向受试者施用或添加到例如包括透明质酸的另一种溶液中。可替代地，在施用前可以将冷冻保存的组合物解冻并将间充质谱系前体或干细胞重悬于替代载体中。
[0179]
本文描述的组合物可以单独施用或作为与其它细胞的混合物施用。不同类型的细胞可以在施用前立即或不久与本公开的组合物混合，或者其可以在施用前一起共培养一段时间。
[0180]
在一个实例中，组合物包括有效量或治疗或预防有效量的间充质谱系前体或干细胞和/或其后代和/或源自其的可溶性因子。例如，所述组合物包括约1
×
105个干细胞至约1
×
109个干细胞或约1.25
×
103个干细胞至约1.25
×
107个干细胞/kg(80kg受试者)。待施用的细胞的确切量取决于多种因素，包含受试者的年龄、体重和性别以及要治疗的病症的程度和严重程度。
[0181]
尽管在所述组合物中提供了细胞的数量，但在一实例中，施用50
×
106个至200
×
107个细胞。在其它实例中，施用60
×
106个至200
×
106个细胞或75
×
106个至150
×
106个细胞。在一实例中，施用75
×
106个细胞。在另一实例中，施用150
×
106个细胞。
[0182]
在一实例中，所述组合物包括大于5.00
×
106个活细胞/ml。在另一实例中，所述组
合物包括大于5.50
×
106个活细胞/ml。在另一实例中，所述组合物包括大于6.00
×
106个活细胞/ml。在另一实例中，所述组合物包括大于6.50
×
106个活细胞/ml。在另一实例中，所述组合物包括大于6.68
×
106个活细胞/ml。
[0183]
在一实例中，间充质谱系前体或干细胞包括组合物的细胞群体的至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约99％。
[0184]
在一实例中，所述组合物可以任选地包装在具有用于期望目的的书面说明的合适容器中。
[0185]
本公开的组合物可以全身地施用，例如通过静脉内施用。在一实例中，组合物经心内膜施用。
[0186]
心脏性死亡、心肌梗死或中风的风险
[0187]
在一实例中，本公开的方法涉及基于受试者的crp水平评估心脏性死亡、心肌梗死或中风中的一者或多者的风险的方法。例如，本公开的方法可以涉及基于受试者的crp水平评估心脏性死亡的风险的方法。在一实例中，本公开涵盖一种用于确定受试者的心脏性死亡、心肌梗死或中风中的一者或多者的风险升高的方法，所述方法包括测量从受试者获得的样品中的crp水平，其中crp升高表明心脏性死亡、心肌梗死或中风的风险升高。在一实例中，所述受试者患有进行性心力衰竭。例如，受试者可能患有nyha ii级进行性心力衰竭。因此，在一实例中，样品是从患有nyha ii级进行性心力衰竭的受试者获得的。在一实例中，样品是血液样品。
[0188]
在一实例中，crp的水平》1mg/l表明心脏性死亡、心肌梗死或中风的风险升高。在一实例中，crp的水平》1.5mg/l表明心脏性死亡、心肌梗死或中风的风险升高。在一实例中，crp的水平≥2mg/l表明心脏性死亡、心肌梗死或中风的风险升高。在一实例中，crp的水平介于≥2mg/l与5mg/l之间表明心脏性死亡、心肌梗死或中风的风险升高。在一实例中，在缺血性事件后测量crp的水平。在一实例中，缺血性事件是心肌梗死。
[0189]
在一实例中，将包括诱导靶组织中的新血管形成的细胞的组合物施用于评估为具有升高的心脏性死亡、心肌梗死或中风风险的受试者。因此，在一实例中，本公开涉及一种治疗进行性心力衰竭的方法，所述方法包括：i)选择根据纽约心脏协会(nyha)分级量表患有ii级心力衰竭并具有升高的crp水平的受试者；以及ii)向所述受试者施用根据本公开的组合物。在一实例中，受试者的crp水平≥2mg/ml。
[0190]
本领域的技术人员将理解的是，在不脱离广泛描述的本发明的精神或范围的情况下，可以对如在特定实施例中示出的本发明进行多种变化和/或修改。因此，本实施例应当在所有方面都被视为是说明性的而非限制性的。
[0191]
本技术要求于2020年12月15日提交的au2020904675、于2021年1月12日提交的2021900059、于2021年9月10日提交的au2021902941和于2021年10月20日提交的au2021903365的优先权，所述文献的公开内容整体并入本文。
[0192]
本文所讨论和/或提到的所有出版物以其整体并入本文。
[0193]
对已包含在本说明书中的文件、法令、材料、装置、物品等的任何讨论仅仅是出于为本发明提供上下文的目的。这不应视为承认任何或所有这些事项形成现有技术基础的一
部分，或者是与本发明相关的领域中的公知常识，因为其在本技术的每个权利要求的优先权日期之前就已经存在。
[0194]
实例
[0195]
组合物
[0196]
所述组合物由利用抗stro-3抗体从骨单核细胞中分离、离体扩增并冷冻保存的人骨髓源性同种异体mpc组成。
[0197]
患者
[0198]
基线数据
[0199][0200]
[0201][0202]
主要和次要结果测量如下：
[0203]
1)非致死性主要不良心脏事件(mace)：
[0204]
心力衰竭mace(复发性失代偿性心力衰竭事件或高级别心律失常)；
[0205]
缺血性mace(心脏病发作或中风)
[0206]
2)心脏原因死亡
[0207]
相对于对照，细胞疗法出人意料地将缺血性mace(mi，中风)的发生率降低了60％(n＝537个患者；p＝0.002；图1)。图2示出了相对于对照，在nyha ii级和iii级中观察到的缺血性mace(mi，中风)的发生率显著降低。这些数据表明细胞疗法可以降低患有心肌病的患者的缺血性事件的风险。图3示出了在缺血性和非缺血性患者中都观察到缺血性mace(mi，中风)的发生率显著降低。心肌病患者由于在这些患者体内的持续的炎性过程而有闭塞斑块产生的风险。鉴于在缺血性和非缺血性心肌病患者中观察到的缺血性mace普遍减少，细胞疗法似乎抑制了这些问题过程。因此，目前的数据似乎支持了一个普遍的概念，通过所述概念可以施用细胞疗法以降低患有心肌病的患者的缺血性事件的风险。
[0208]
令人惊讶的是，细胞疗法降低了nyha ii级患者的心脏性死亡，但没有降低nyha iii级患者的心脏性死亡(图4和6)。这一结果令人惊讶，因为它表明利用细胞疗法来降低心脏性死亡需要某一活心肌阈值水平。换句话说，患有iii级心力衰竭的患者可能在疾病连续体中进展过快，而无法使用细胞疗法来提高其存活率。这些发现表明细胞疗法将对nyha ii级患者特别有效。鉴于所施用的细胞诱导靶组织中的新血管形成的能力，本发明人的发现提出了通过施用细胞疗法降低等级在nyha iii级以下的患者的心脏性死亡的一般概念。作为此概念的进一步支持，本发明人注意到，不管心肌病的原因如何，都观察到会维持nyha ii级患者的心脏性死亡的降低，其中在缺血性和非缺血性nyha ii级患者中观察到心脏性死亡的降低(图5)。
[0209]
3)改善的结果
[0210]
3点mace
[0211]
随后的分析揭示，与对照相比，在所有537个经治疗的患者中，单次注射细胞疗法
显著降低了3点不可逆发病率或死亡率mace的复合结果的风险。在crp≥2mg/ml的受试者中，风险降低甚至更明显。3点mace的风险使用至第一事件的时间分析降低了33％[hr 0.667；95％ ci(0.472，0.941)；p＝0.021；图7a]，并且在针对随访时间归一化的复发事件率分析中(即每100患者-年的事件数)降低了35％[hr 0.646；95％ ci(0.466，0.895)；p＝0.009；图7b]。血浆hscrp水平》2mg/l或《2mg/l的患者的此复合结果的卡普兰-迈耶曲线(kaplan-meier curve)在图7c中描绘。如图7c所示，在crp》2mg/l的所有经治疗的患者中，细胞疗法显著降低了以下的风险：
[0212]
●
非致死性mi和非致死性中风(图7c1)；以及
[0213]
●
心脏性死亡或缺血性mace(mi或中风)的复合(图7c2)。
[0214]
缺血性mace
[0215]
在所有537个经治疗的患者中，与对照相比，单次注射细胞疗法在使用至第一事件的时间分析(ttfe)的情况下将不可逆发病率(非致死性mi或非致死性中风)的发生风险降低了65％[hr 0.346；95％ ci(0.180，0.664)；p＝0.001；图8a]，并且在使用复发事件率归一化的情况下将所述风险降低了69％[hr 0.306；95％ ci(0.162，0.579)；p《0.001；图8b]。
[0216]
基于治疗时是否存在炎症，对所有经治疗的患者进行预先指定的亚组分析。301个具有炎症的患者(crp》2mg/l)的单次注射细胞疗法在使用ttfe的情况下将非致死性mi或非致死性中风的风险降低了79％[hr 0.206；95％ ci(0.070，0.611)；p＝0.004；图8a]，并且在使用复发事件率归一化的情况下将所述风险降低了83％[hr 0.170；95％ci(0.059，0.492)；p＝0.001；图8b]。结合以上提及的3点mace分析，这些数据支持了选择和治疗患有心力衰竭并具有活动性炎症(优选地如通过crp》2mg/l所定义的)的患者的基本原理。
[0217]
细胞疗法将所有患者的心脏性死亡或缺血性mace(mi或中风)的复合显著降低了33％(图9)。随后对患者组的进一步分析揭示，与对照相比，细胞疗法将nyha ii级患者的心脏性死亡或缺血性mace(mi或中风)的复合显著降低了60％，这进一步支持了选择和治疗患有nyha ii级心力衰竭的患者的基本原理(图9)。还注意到，经过多年的随访，细胞疗法防止了nyha ii级患者的心脏性死亡的进展(图10)。
[0218]
细胞疗法也出人意料地降低了crp水平升高，特别是crp水平≥2mg/l的nyha ii级患者的心脏性死亡(图11)和3点mace(心脏性死亡/mi/中风；图12)的风险。这些有益效果在基线crp《2mg/的患者中不明显，这表明细胞疗法可能在活动性炎症存在时特别有益。
[0219]
进一步的数据分析揭示，crp是心脏性死亡的重要标志物。如图11所示，crp水平升高(≥2mg/l)的患者的心脏性死亡风险显著增加。这些数据进一步支持了用细胞疗法治疗nyha ii级患者，特别是当这些患者的crp水平升高，例如crp≥2mg/l时。这些数据也表明crp水平作为指标或有心脏性死亡风险的患者的效用。

技术特征：
1.一种用于治疗或预防受试者的进行性心力衰竭的方法，所述方法包括向所述受试者施用包括细胞的组合物，其中所述受试者根据纽约心脏协会(nyha)分级量表患有ii级心力衰竭。2.一种减少受试者的心力衰竭的进展的方法，所述方法包括向所述受试者施用包括细胞的组合物，其中所述受试者根据纽约心脏协会(nyha)分级量表患有ii级心力衰竭。3.一种减少根据纽约心脏协会(nyha)分级量表患有ii级心力衰竭的受试者的心脏性死亡的方法，所述方法包括向所述受试者施用包括细胞的组合物。4.一种选择要用细胞疗法治疗的心力衰竭患者的方法，所述方法包括：i)根据纽约心脏协会(nyha)分级量表评估心力衰竭；以及ii)选择根据nyha患有ii级心力衰竭的受试者，优选地，其中所述方法包括施用包括细胞的组合物。5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述受试者的crp水平在施用细胞之前是升高的。6.根据权利要求5所述的方法，其中所述受试者的crp水平≥2mg/l。7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述细胞：诱导靶组织中的新血管形成，优选地，其中所述细胞促进动脉生成；和/或分泌保护处于危险中的心肌的因子。8.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其包括以下步骤：i)选择根据纽约心脏协会(nyha)分级量表患有ii级心力衰竭的受试者；以及ii)向所述受试者施用包括诱导靶组织中的新血管形成的细胞的组合物。9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中施用所述组合物抑制所述受试者的向nyhaiii级进行性心力衰竭的进展。10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述受试者的n端前b型利钠肽(nt-probnp)水平为：在施用所述细胞前，小于2200pg/ml，优选地小于2000pg/ml；或者，在施用所述细胞前，介于1000pg/ml与2000pg/ml之间。11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述受试者的c反应性蛋白(crp)水平<5mg/l，优选地<4mg/l。12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述受试者的crp水平介于1.5mg/l与5mg/l之间。13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述受试者在先前9个月内具有心力衰竭住院事件。14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述受试者的lvef小于约45％，优选地小于40％。15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述受试者患有持续性左心室功能障碍。16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中所述受试者的心力衰竭是由缺血性事件或非缺血性事件引起的。17.根据权利要求1、2或5至16中任一项所述的方法，其中所述受试者在治疗后的心脏性死亡风险降低。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述风险降低是相对于患有nyha iii级进行性心力衰竭的受试者的心脏性死亡风险而言的。19.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中所述受试者在治疗后的缺血性mace(mi或中风)风险降低。20.根据权利要求1至19中任一项所述的方法，其中所述组合物经心内膜和/或静脉内地施用。21.根据权利要求1至20中任一项所述的方法，其中所述细胞是间充质谱系前体或干细胞(mlpsc)。22.根据权利要求21所述的方法，其中所述mlpsc是stro-1+。23.根据权利要求21所述的方法，其中所述mlpsc是间充质干细胞(msc)。24.根据权利要求21或权利要求22所述的方法，其中所述mlpsc是同种异体的。25.根据权利要求21至24中任一项所述的方法，其中所述细胞被培养扩增。26.根据权利要求25所述的方法，其中所述细胞在培养扩增之前是tnap+。27.根据权利要求21至26中任一项所述的方法，其中所述细胞已被冷冻保存。28.根据权利要求1至27中任一项所述的方法，其包括施用1
×
107至2
×
108个细胞。29.根据权利要求1至28中任一项所述的方法，其中所述组合物进一步包括plasma-lyte a、二甲亚砜(dmso)、人血清白蛋白(hsa)。30.根据权利要求1至29中任一项所述的方法，其中所述组合物进一步包括plasma-lyte a(70％)、dmso(10％)、hsa(25％)溶液，所述hsa溶液包括5％hsa和15％缓冲液。31.根据权利要求1至30中任一项所述的方法，其中所述组合物包括大于6.68
×
106个活细胞/ml。32.根据权利要求1至25或27至31中任一项所述的方法，其中所述组合物包括利用抗stro-3抗体从骨单核细胞中分离、离体扩增并冷冻保存的人骨髓源性同种异体间充质前体细胞(mpc)。33.一种降低受试者的缺血性事件风险的方法，所述方法包括向所述受试者施用包括细胞的组合物。34.根据权利要求33所述的方法，其中所述受试者的crp水平≥2mg/l。35.根据权利要求33或34所述的方法，其中所述缺血性事件是动脉闭塞的形成。36.根据权利要求33或34所述的方法，其中所述缺血性事件是脑血管或心脏闭塞的形成。37.根据权利要求33或34所述的方法，其中所述缺血性事件是中风或心肌梗死。38.根据权利要求33至37中任一项所述的方法，其中所述受试者患有非缺血性心肌病。39.根据权利要求33至38中任一项所述的方法，其中所述细胞经心内膜施用。40.根据权利要求33至39中任一项所述的方法，其中所述受试者根据纽约心脏协会(nyha)分级量表患有ii级或iii级心力衰竭。41.根据权利要求33至40中任一项所述的方法，其中所述细胞：诱导靶组织中的新血管形成，优选地，其中所述细胞促进动脉生成；和/或分泌保护处于危险中的心肌的因子。42.根据权利要求33至41中任一项所述的方法，其中所述细胞是间充质谱系前体或干
细胞(mlpsc)。43.根据权利要求33至42中任一项所述的方法，其中所述受试者的n端前b型利钠肽(nt-probnp)水平在施用所述细胞之前介于1000pg/ml与2000pg/ml之间。44.根据权利要求33或35至44中任一项所述的方法，其中所述受试者的c反应性蛋白(crp)水平介于1.5mg/l与5mg/l之间。45.根据权利要求42所述的方法，其中所述mlpsc是以下中的一者或多者：stro-1+、同种异体的、培养扩增的、经受冷冻保存的。46.根据权利要求45所述的方法，其中所述细胞被培养扩增并在培养扩增之前表达tnap+。47.根据权利要求33至46中任一项所述的方法，其包括施用1
×
107至2
×
108个细胞。48.根据权利要求33至47中任一项所述的方法，其中所述组合物包括plasma-lyte a(70％)、dmso(10％)、hsa(25％)溶液，所述hsa溶液包括5％hsa和15％缓冲液。49.根据权利要求33至48中任一项所述的方法，其中所述组合物包括利用抗stro-3抗体从骨单核细胞中分离、离体扩增并冷冻保存的人骨髓源性同种异体间充质前体细胞(mpc)。50.一种用于确定受试者的心脏性死亡、心肌梗死或中风中的一者或多者的风险升高的方法，所述方法包括测量从受试者获得的样品中的crp水平，其中crp升高表明心脏性死亡、心肌梗死或中风的风险升高。51.根据权利要求50所述的方法，其中所述受试者患有进行性心力衰竭。52.根据权利要求51所述的方法，其中所述受试者患有ii级进行性心力衰竭。53.根据权利要求50至52中任一项所述的方法，其中crp水平≥2mg/l表明心脏性死亡、心肌梗死或中风的风险升高。54.根据权利要求50至53中任一项所述的方法，其中所述方法确定心脏性死亡的风险升高。55.一种用于治疗或预防受试者的进行性心力衰竭的方法，所述方法包括向所述受试者施用包括间充质前体谱系或干细胞的组合物，其中所述受试者根据纽约心脏协会(nyha)分级量表患有ii级或iii级心力衰竭并具有活动性炎症。56.一种减少受试者的心力衰竭的进展的方法，所述方法包括向所述受试者施用包括间充质前体谱系或干细胞的组合物，其中所述受试者根据纽约心脏协会(nyha)分级量表患有ii级或iii级心力衰竭并具有活动性炎症。57.一种减少根据纽约心脏协会(nyha)分级量表活动性炎症患有ii级或iii级心力衰竭的受试者的心脏性死亡的方法，所述方法包括向所述受试者施用包括间充质前体谱系或干细胞的组合物。58.一种选择要用细胞疗法治疗的心力衰竭患者的方法，所述方法包括：i)评估crp水平并根据纽约心脏协会(nyha)分级量表评估心力衰竭；以及ii)选择根据nyha患有ii级或iii级心力衰竭并具有活动性炎症的受试者，优选地，其中所述方法包括施用包括间充质前体谱系或干细胞的组合物。59.根据权利要求55至58中任一项所述的方法，其中活动性炎症是基于所述受试者的crp水平确定的。
60.根据权利要求59所述的方法，其中活动性炎症的特征在于crp水平≥2mg/l。

技术总结
本公开涉及用于治疗和/或预防患有早期心力衰竭的受试者的进行性心力衰竭的方法。此类方法可以用于治疗或预防根据纽约心脏协会(NYHA)分级量表患有II级心力衰竭的受试者的进行性心力衰竭。进行性心力衰竭。


技术研发人员：S
受保护的技术使用者：迈索布拉斯特国际有限公司
技术研发日：2021.12.15
技术公布日：2023/10/5