利用脂多糖和脂磷壁酸的抗炎和再生功能得到增强的高浓度干细胞外泌体制备方法与流程

1.本发明涉及利用脂多糖(lipopolysaccharide，lps)和脂磷壁酸(lipoteichoic acid，lta)的抗炎和/或再生功能得到增强的高浓度干细胞外泌体制备方法；以及通过上述方法能够制备的抗炎和再生诱导组合物。


背景技术：

2.构成我们身体的细胞会分泌具有脂质双层的各种大小的细胞外囊泡(extracellular vesicles)作为与周围细胞通信的信号传递物质。细胞外囊泡根据大小分类为外泌体(exosome；30～200nm)、微泡(micro-vesicle；200～1000nm)、凋亡体(apoptotic body；1um～5um)。
3.外泌体中包含mirna之类的核酸和蛋白质等。由成体干细胞分泌的外泌体已被进行大量研究，显示出对周围细胞的再生和抗炎效果具有优异的功效，并且正在进行利用其来开发多种治疗剂的研究。
4.作为用于功能性提高外泌体的方法，有调节分泌外泌体的细胞的特性的方法以及在分离外泌体后通过搭载特定物质的方法来利用外泌体以运送治疗物质的方法。
5.作为分离外泌体的方法，存在超速离心(ultracentrifuge)、超滤(ultrafiltration)、色谱(chromatography)等方法，根据分离方法不同，外泌体的功能特性、纯度、浓度、大小会发生改变。
6.作为干细胞的种类，有胚胎干细胞、成体干细胞、去分化干细胞，其中，成体干细胞从血液、骨髓、脂肪等中提取，与胚胎干细胞不同，不存在伦理问题。来自骨髓、脂肪的干细胞是通过侵入性方法从供体中提取，而脐带血干细胞是从分娩后废弃的脐带血中提取，对供体不使用侵入性方法，具有供体间的脐带血干细胞功效差异小的优点。特别是，正在开展与能够提高干细胞的有效因子的皮肤内渗透力的技术开发相关的研究，其中之一就是使用外泌体。
7.皮肤由表皮层和真皮层构成(图9)。
8.填充表皮(epidermis)的细胞包括角质细胞(keratinocytes)、黑色素细胞(melanocytes)、树突状细胞(dendritic cells)和触觉细胞(tactile cells)。大部分的表皮细胞为角质细胞。角质细胞的主要功能是形成针对热、紫外线、水分流失、病原菌、霉菌、寄生虫以及病毒造成的环境损害的屏障。多数结构蛋白质(丝聚蛋白(filaggrin)、角蛋白(keratin))、酶(蛋白酶)、脂质以及抗菌肽(防御素(defensins))有助于维持皮肤的重要的屏障功能。
9.真皮层具有表皮层(0.04mm～1.6mm)的15～40倍的厚度，是占据皮肤的大部分且保持皮肤弹力的层，起到表皮与皮下组织之间的结缔组织(connective tissue)的作用。具备皮肤附属器、血管、淋巴管、肌肉、神经等，大体分为乳头真皮(papillary dermis)和网状真皮(reticular dermis)这两层。
10.乳头真皮在真皮整体厚度中仅占非常小的一部分，由胶原蛋白、血管、纤维细胞(fibrocyte)构成。向无血管的(avascular)表皮的基底层提供营养成分。网状真皮是占据真皮的大部分的层，弹性蛋白和胶原蛋白纤维排列成粗束，赋予皮肤强度和柔韧性，由弹力纤维和多种基质蛋白质构成。胶原蛋白占结缔组织总蛋白质的25％左右，对真皮层的拉伸强度起着重要的作用。另一方面，基质金属蛋白酶(matrix metalloprotease，mmp)是一种水解细胞外基质(extracellular matrix，ecm)的锌依赖性内肽酶(zinc-dependent endopeptidase)。mmp通过分解ecm来提高细胞的迁移能力从而在皮肤组织中进行循环，但会形成皱纹而促进皮肤衰老，促进癌细胞的转移，其形成会因紫外线、压力、抗生素等而受到促进。纤连蛋白(fibronectin)是存在于细胞表面、结缔组织、血液中的糖蛋白。细胞并不直接与胶原蛋白(collagen)连接，而是通过纤连蛋白(fibronectin)连接。
11.成纤维细胞(fibroblast)产生并分泌角质细胞(keratinocyte)所需的生长因子和细胞因子。角质细胞(keratinocyte)作为表皮细胞是最容易暴露于环境的细胞。成纤维细胞可以通过角质细胞(keratinocyte)而激活，通过激活而再形成细胞外基质，使皮肤层变得均匀。
12.皮肤是覆盖整个身体的最大的器官。角质细胞(keratinocytes，kc)是主要构成要素。kc产生角质蛋白而起到抵御外因性刺激的保护膜的作用。kc已被证明产生多种细胞因子，因此皮肤在身体的免疫和炎症反应中起着重要的作用。细胞因子通过影响其他细胞和器官来介导细胞生长和分化以及炎症和免疫反应。因此，细胞因子维持细胞与细胞间的稳态。在各种皮肤疾病中均检测到失调和细胞因子的异常性产生。越来越多的证据表明细胞因子在特定疾病的病因或严重程度方面有着相当大的参与度。
13.人体的皮肤是位于身体的最外侧，通过屏障功能来保护人体免受外部压力的器官，但也是由于环境污染和紫外线之类的外部刺激而产生活性氧(reactive oxygen species；ros)的器官。
14.最容易接触皮肤的紫外线起到维持正常细胞浓度、产生vit.d和杀菌作用等有益作用，但会到达真皮层而增加成纤维细胞(dermal fibroblast)内的ros，诱导基质金属蛋白酶(mmp)的表达，切断作为结缔组织的胶原蛋白(collagen)、弹性蛋白(elastin)、葡糖胺聚糖(glycosaminoglycane，gag)、透明质酸链并分解纤维，最终产生皮肤皱纹，加速皮肤衰老。另外，生物体内ros引起的脂质过氧化不仅限于发生脂质过氧化的部位，过氧化自由基还会通过血液迁移至较远的地方而诱发其他部位的过氧化，这样的氧化反应会成为高血压、动脉硬化、心力衰竭、类风湿性关节炎、过敏、癌、中风、帕金森病、痴呆等之类的脑部疾病以及骨质疏松症的原因。除此以外，ros会诱发或加重特应性皮炎、痤疮、牛皮癣等，也参与导致细胞内的dna损伤以及皮肤癌和皮肤衰老的炎症过程(inflammatory processes)和过敏反应(allergic responses)。
15.一氧化氮(nitric oxide，no)和前列腺素e2(prostaglandin e2，pge2)是免疫细胞的代表性炎症因子，no是参与维持细胞内稳态、运送神经递质、抗癌作用和细胞毒性等的信号传递因子，但在过量存在时会导致细胞损伤和炎症反应。pgs作为稳态维持、血管扩张、平滑肌刺激和炎症介质来发挥作用，pgs中pge2保护细胞免于凋亡，同时诱发炎症和疼痛，因而与no一样，发挥双重作用。
16.细菌是生命体中最为繁盛的微生物。作为生活在人体、动物以及土壤中的任何地
方的单细胞生命体的细菌只要条件合适则每20分钟就能分裂一次并生存下去。体内的特定菌会产生维生素k，在肠道内帮助食物消化。其他一些菌会用于酸奶或泡菜之类的发酵食品，还有一些菌会净化污染的环境，控制有害菌等，发挥许多有益的作用，因此可以说对我们是必不可少的。极少部分的病原性菌在感染时也会导致肺炎之类的各种细菌性疾病或导致败血症之类的严重的副作用，从而导致宿主死亡。败血症在诱导细胞因子风暴(cytokine storm)的同时损伤细胞、器官和组织。
17.细菌具有原核生物原本的特征，不具有核膜、线粒体、叶绿体之类的结构。细菌的结构中，从免疫学观点考虑，最值得注意的部分是细胞壁，细菌的细胞壁起到保持大小和形态，防止细胞因渗透压而破裂的作用。
18.革兰氏阴性(gram negative)细菌的细胞壁由脂多糖(lps_lipopoly saccharide)和肽聚糖(peptidoglycan)构成(图10)，由脂质a(lipid a)和多种多糖类构成，即使在极少量的情况下也能诱导强烈的免疫活性。作为革兰氏阳性(gram positive)细菌的细胞壁成分的脂磷壁酸(lta_lipoteichoic acid)与革兰氏阴性(gram negative)细菌的脂多糖(lps_lipopolysaccharide)结构相似，近年来发表了乳酸菌死亡菌体的脂磷壁酸能够改变肠道内细菌和粘蛋白的产生从而缓解肠道内炎症的研究，并且促进细胞的抗炎功效相关物质的分泌等多许研究正在进行中。


技术实现要素：

19.技术课题
20.本发明想要提供一种抗炎和再生功能得到增强的高浓度外泌体，其中，在制备干细胞外泌体时用脂多糖(lps)和脂磷壁酸(lta)预处理来对干细胞诱导轻度炎症反应，从而激活干细胞的免疫反应，然后由诱导了抗炎反应的干细胞进行分泌。
21.解决课题的方法
22.本发明的第一方式提供一种外泌体制备方法，其特征在于，包括：a步骤，为了与未处理脐带血干细胞相比，增加在培养脐带血干细胞时所分泌的外泌体的浓度，在添加了选自由脂多糖(lipopolysaccharide，lps)和脂磷壁酸(lipoteichoic acid，lta)组成的组中的一种以上的无血清培养基中培养脐带血干细胞；以及b步骤，选择性分离作为a步骤的产物的脐带血干细胞、其培养液、和/或其外泌体。
23.与源自未处理脐带血干细胞的外泌体相比，上述外泌体的抗炎和/或再生功能可以得到增强。
24.本发明的第二方式提供一种皮肤或生物体膜(覆盖膜和衬膜(covering and lining membranes))涂布用组合物，其包含通过第一方式的制备方法获得的外泌体或含有其的培养液作为有效成分。
25.上述皮肤或生物体膜(覆盖膜和衬膜)涂布用组合物可以为化妆品组合物、准药物组合物或药物组合物。
26.上述皮肤或生物体膜(覆盖膜和衬膜)涂布用组合物中，外泌体可以用作透皮型载体。
27.本发明的第三方式提供一种抗炎和/或再生诱导组合物的制备方法，其特征在于，包括：第一步骤，在培养干细胞时用选自由脂多糖(lipopolysaccharide，lps)和脂磷壁酸
(lipoteichoic acid，lta)组成的组中的一种以上进行处理；以及第二步骤，选择性分离作为第一步骤的产物的干细胞、其培养液、和/或其外泌体。
28.第一步骤中，干细胞所分泌的外泌体产量可以因脂多糖(lipopolysaccharide，lps)和/或脂磷壁酸(lipoteichoic acid，lta)而增加。
29.本发明的第四方式提供通过第三方式的制备方法获得的抗炎和/或再生诱导组合物。
30.以下，对本发明进行说明。
31.本发明的外泌体制备方法包括：
32.a步骤，为了与未处理脐带血干细胞相比，增加在培养脐带血干细胞时所分泌的外泌体的浓度，在添加了选自由脂多糖(lipopolysaccharide，lps)和脂磷壁酸(lipoteichoic acid，lta)组成的组中的一种以上的无血清培养基中培养脐带血干细胞；以及
33.b步骤，选择性分离作为a步骤的产物的脐带血干细胞、其培养液、和/或其外泌体。
34.另外，本发明的抗炎和/或再生诱导组合物的制备方法包括：
35.第一步骤，在培养干细胞时用选自由脂多糖(lipopolysaccharide，lps)和脂磷壁酸(lipoteichoic acid，lta)组成的组中的一种以上进行处理；以及
36.第二步骤，选择性分离作为第一步骤的产物的干细胞、其培养液、和/或其外泌体。
37.从根据本发明用lps和lta预处理的脐带血干细胞中分离培养得到的外泌体与从在一般条件下培养的干细胞中分离的外泌体相比，抗炎和再生功效优异，外泌体的浓度高。此时，确认到外泌体的大小与对照组没有差异。另外，在用根据本发明抗炎和再生功能得到增强的外泌体处理的细胞中，没有显示出细胞毒性，也没有诱导炎症反应。另外，确认到通过用外泌体进行处理，皮肤细胞和角质细胞的增殖率和细胞迁移率增大，从而对组织再生有效。因此，根据本发明制备、分离和精制的外泌体能够有效用于抗炎和组织再生相关药物组合物、皮肤或生物体膜(覆盖膜和衬膜)涂布用组合物。本发明是基于此而完成的。
38.比如，本发明的特征在于，为了制备抗炎和/或再生功能得到增强的高浓度干细胞外泌体，在培养干细胞时进行脂多糖(lps)和/或脂磷壁酸(lta)处理，由此诱导干细胞的炎症反应，激活干细胞的免疫反应，即在诱导免疫活性之后诱导抗炎反应。
39.通常，炎症反应(inflammatory responses)是用于保护生物体免受微生物的感染或外部损伤的防御机制，与先天免疫和疾病相关。
40.本说明书中，诱导了抗炎反应的干细胞通过脂多糖(lps)和/或脂磷壁酸(lta)处理，从而能够在培养干细胞时与未处理干细胞相比提高至少一种抗炎细胞因子的mrna表达量和/或分泌量，和/或提高所分泌的外泌体内至少一种抗炎细胞因子含量。
41.本发明的外泌体也可以是在培养干细胞时用脂多糖(lps)和/或脂磷壁酸(lta)预处理而对干细胞诱导轻度炎症反应，从而在激活干细胞的免疫反应之后，由诱导了抗炎反应的干细胞所分泌的外泌体，也可以对上述诱导了抗炎反应的干细胞施加物理力来进行粉碎。
42.进而，利用已知富含组织再生相关物质的脐带血干细胞来诱导外泌体分泌，使相关物质自然地承载到外泌体内，从而能够以高浓度确保在发挥抗炎功能的同时发挥组织再生功能的外泌体。
43.另外，本说明书中，抗炎和/或再生功能得到增强的细胞外囊泡也属于本发明的外泌体的范畴。
44.本说明书中，作为皮肤的上位概念，有生物体膜(覆盖膜和衬膜)。生物体膜(覆盖膜和衬膜)是与结缔组织(connective tissue)的下部层(underlying layer)结合的由上皮组织(epithelium)构成的连续性多细胞片(continuous multicellular sheets)。生物体膜(覆盖膜和衬膜)有皮膜(cutaneous membrane)、粘膜(mucous membranes)、浆膜(serous membranes)。
45.1.脂多糖(lps)和脂磷壁酸(lta)
46.本说明书中，脂多糖(lps)可以是革兰氏阴性(gram negative)细菌的细胞壁成分，和/或脂磷壁酸(lta)可以是革兰氏阳性(gram positive)细菌的细胞壁成分。
47.以细胞壁的构成成分为基准，细菌大体可以分为两种。一种是在外部具有脂多糖(lipopolysaccharide，lps)且在细胞壁与细胞膜之间具有肽聚糖(peptidoglycan)的革兰氏阴性菌，另一种是具有肽聚糖和脂磷壁酸(lipoteichoic acid，lta)的革兰氏阳性菌(图10)。革兰氏阳性菌的细胞壁中厚厚地覆盖有多层肽聚糖层，细胞壁的约80-90％为肽聚糖。另一方面，革兰氏阴性菌的细胞壁非常薄，只有一层肽聚糖层，仅占细胞壁的10-20％。革兰氏阴性菌的细胞外壁以由磷脂质、脂多糖、脂蛋白等构成的外膜包围的形式形成。
48.作为革兰氏阳性菌，有葡萄球菌、链球菌、肺炎球菌、麻风杆菌、白喉杆菌、破伤风杆菌、炭疽杆菌、放线菌等，它们对色素或药物高度敏感，在代谢活动中需要氨基酸和维生素。它们中的一部分会释放菌体外毒素，虽然该毒素对于菌种具有很强的毒作用，但在加热时容易被破坏。该毒素在生物体内具有高抗原性，如果这些抗体与毒素结合，则具有消除或中和毒素固有功能的特异性。除此以外，如果对外毒素施以特定处理(例如，福尔马林处理)，则毒性就会消失，因此在使用这些非活性毒素(类毒素(toxoid))诱导免疫时，可以大量产生毒素去除用抗体。
49.乳酸菌也是具有与病原性细菌类似的细胞壁结构的革兰氏阳性菌，但不会诱导败血症，反而具有抑制有害细菌的体内感染和繁殖的益生菌(probiotics)的功能。
50.革兰氏阴性菌通常具有对于三苯基甲烷系或吖啶黄色素的较强抵抗力，对于表面活性剂的耐性也强的特征。另外，生存所需的营养要求简单，在构成简单的培养液中也能生长良好，并且毒素是菌体内毒素，即使通过加热也不易将其破坏。已知这些毒素还能够诱导抗体反应，表现出多种范围的免疫性。脂多糖(lipopolysaccharide，lps)是形成革兰氏阴性菌的膜结构的病原菌的内毒素，在巨噬细胞(macrophage)的免疫反应中发挥非常重要的作用。基于lps的巨噬细胞活性诱导多种炎症介质物质，使花生四烯酸(arachidonic acid)产生pgs和no，因此被大量用于研究炎症反应。直接抑制no和pge2等炎症介质活性的物质很可能被开发为抑制痤疮、特应性皮炎、类风湿性关节炎、恶性赘生物等之类的各种炎症相关疾病的抗炎剂。
51.细菌的细胞壁构成成分是在人或动物的体内最先起到识别对象作用的部分，在免疫反应研究中是必不可少的。作为革兰氏阴性菌的代表性免疫活性要素的脂多糖(lipopolysaccharide，lps)已知是构成细胞表面的物质，在病原性细菌与真核生物间的相互作用中起着非常重要的作用。在动物模型或人中lps所引起的败血症的发生机制是众所周知的，lps由脂质a和多种多糖类构成，即使在极少量的情况下也能诱导强烈的免疫活性，
在体内与lps结合蛋白(lps-binding protein：lbp)和cd14受体结合后，激活toll样受体(toll-like receptor，tlr)4，从而产生干扰素(interferon，ifn)-β。ifn-β与细胞受体结合而使stat1磷酸化，诱导诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthasei，nos)的产生，最终生成一氧化氮(nitric oxide，no)，激活血管细胞的肌球蛋白磷酸酶(myosin phosphatase)和钾通道(potassium channel)，从而扩张血管。no与败血症休克密切相关。
52.虽然革兰氏阳性菌没有lps，是败血症的主要原因，但其发生机制尚不清楚，作为革兰氏阳性菌细胞壁成分，像lps那样包含由脂肪酸(fatty acid)构成的脂质部分和多种多糖类的脂磷酸壁(lta)长久以来被认为是败血性休克的诱发物质。
53.lta的结构根据革兰氏阳性菌的种类不同而不同，可以包含核糖醇(ribitol)或磷酸甘油的长链。lta通过二酰基甘油(diacylglycerol)而固定于细胞膜。lta起到作为细胞壁自分解酶(自溶壁酶(autolytic wall enzymes))的溶菌酶(muramidases)的调节剂的作用。具有能够刺激特异性免疫反应的抗原特性。
54.lta可以通过膜磷脂与靶细胞非特异性结合，或者与cd14和toll-样受体特异性结合。已表明与tlr-2的结合会诱导nf-κb表达(中心转录因子(central transcription factor))而提高促凋亡(pro-apoptotic)和抗凋亡(anti-apoptotic)基因的表达。它的激活还诱导磷酸肌醇3-激酶(phosphoinositide 3-kinase)激活以及丝裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，mapk)激活。
55.已发现lta的分子结构在所有细菌中具有最强的疏水键。lta上调单核细胞(monocytes)中的pd-1水平，在通过pd-l进行pd-1的结合后，利用单核细胞来诱导il-10产生，由此诱发cd4 t-细胞扩张和功能(cd4 t-cell expansion and function)的il-10依赖性抑制。
56.以下表1中比较了市售或通过实验室方法(丁醇)提取的金黄色葡萄球菌(s.aureus)和枯草芽孢杆菌(b.subtilisa)lta的链(chain)长度和取代基。
57.[表1]
[0058][0059]a取代度(n，lta-甘油磷酸酯的链长度)由lta的1h nmr积分确定。在市售的枯草芽孢杆菌lta的情况下，高度的核酸污染阻碍通过nmr来测定链长度(nd，不能测定)。
[0060]
微生物感染诱导的免疫反应分为先天性免疫(innate immunity)和获得性免疫(acquired immunity)。获得性免疫对抗原的特异性高，能够非常高效地去除侵入体内的微生物，但存在需要时间才能正常发挥作用的缺点。相较于此，先天性免疫是在微生物感染初期就识别出一定样式的抗原菌(pamp；病原菌相关分子模式(pathogen-associated molecular pattern))，从而在去除侵入的微生物的同时，作为有效诱发获得性免疫的介质
发挥功能。多糖类抗原、lta和lps是与该pamp相对应的一般的抗原，通过toll样受体(tlr)来诱导免疫反应。即，lta和lps通过与结合蛋白(binding protein)或载体蛋白(carrier protein)结合，从而激活tlr，并且诱导tnf-α之类的炎症诱发细胞因子表达。进而，已知lps和lta在败血症综合症(sepsis syndrome)起着决定性的作用，所述败血症综合症在细菌感染严重的情况下，由于免疫细胞过度反应，因而毒性强的炎症因子(inflammatory factors)会被过度分泌，对各种脏器造成致命性损伤并导致患者死亡。
[0061]
根据本发明，在培养干细胞时进行脂多糖(lps)和/或脂磷壁酸(lta)处理而制备的抗炎功能得到增强的高浓度干细胞外泌体的另一特征是，不含有lps和/或lta。
[0062]
本说明书中，“外泌体不含有lps和/或lta”是指在对细胞进行上述外泌体处理时细胞活力(cell viability)不下降。
[0063]
根据本发明，在培养干细胞时进行脂多糖(lps)和/或脂磷壁酸(lta)处理而制备的抗炎功能得到增强的高浓度干细胞外泌体的又一特征是，在对细胞进行处理时，能够减少炎症诱导因子的表达量、和/或增加炎症诱导抑制因子(例如，tgf-β1和il-10)的表达量。
[0064]
另外，由于外泌体与脐带血干细胞特有的抗炎因子和再生相关因子一起分泌，因此在用上述外泌体对皮肤细胞或角质细胞进行处理时，具有细胞的增殖和迁移能力得到提高的特征。
[0065]
2.作为炎症诱导因子的炎性细胞因子
[0066]
促炎性细胞因子(proinflammatory cytokines)或炎性细胞因子是有利于炎症反应的免疫调节细胞因子。炎性细胞因子起到引发炎症反应的作用，并且起到介导先天性免疫反应的重要的作用，从而调节宿主对于病原体的防御。
[0067]
促炎性细胞因子或炎性细胞因子主要通过炎症反应的上调产生并参与其中。是由辅助t细胞(th)和巨噬细胞之类的免疫细胞以及促进炎症的特定其他细胞类型所分泌的信号分子(细胞因子)的一类。其中，包括白介素-1(il-1)、il-12和il-18、肿瘤坏死因子α(tnf-α)、干扰素γ(ifnγ)以及粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)。
[0068]
白介素(il)-1和肿瘤坏死因子(tnf)是促炎性细胞因子，在对人给药时，会引起发热、炎症、组织破坏，根据情况不同还会引起休克和死亡。il-1和tnf是白血球粘附到内皮表面后向组织迁移时所必须的内皮粘附分子的诱导剂。il-1β、il-6和tnf-α之类的促炎性细胞因子还诱发病理性疼痛。il-1β由单核细胞和巨噬细胞释放，但也存在于伤害感受性drg神经元(nociceptive drg neurons)中。il-6在针对损伤的神经反应(neuronal reaction)中起作用。tnf-α是存在于神经元和神经胶质细胞(glia)的熟知的促炎性细胞因子。tnf-α经常参与不同的信号传递途径以调节细胞中的细胞凋亡(apoptosis)。
[0069]
由于促炎作用，促炎性细胞因子具有诱发发热、炎症、组织破坏，在某些情况下诱发休克乃至死亡，从而使疾病本身或与疾病有关的症状恶化的倾向。过量的促炎性细胞因子会产生有害影响。
[0070]
另外，炎性细胞因子长期过度产生(excessive chronic production of inflammatory cytokines)会导致炎性疾病，炎性疾病与粥样动脉硬化和癌症等其他疾病有关。失调(dysregulation)还与抑郁症和其他神经疾病有关。如果想要维持健康，则需要炎性细胞因子与抗炎细胞因子间的平衡(balance between proinflammatory and anti-inflammatory cytokines)。衰老和运动也会影响炎性细胞因子的释放所导致的炎症的量。
[0071]
治疗炎性疾病的治疗方法包括中和炎性细胞因子或其受体的单克隆抗体。
[0072]
3.作为炎症诱导抑制因子的抗炎细胞因子和细胞因子抑制剂
[0073]
炎症反应的净效果由促炎性细胞因子与抗炎细胞因子之间的平衡决定。
[0074]
炎症/免疫反应是一种具有保护和损伤这两方面的生理现象，因此除了针对组织或刺激的选择性调节之外，还需要在数量、时间上进行精确调节，一旦问题得到解决就必须终止反应。因此，抗炎药物的作用只有在数量、质量以及时间上得到精确调节才能有助于疾病的治疗。如果药物不能调和并精确调节炎症反应，那么就不是治疗，反而可能加剧损伤，使疾病恶化或诱发新的疾病。因此，为了通过炎症反应的调节来治疗和预防疾病，必须正确理解炎症反应。
[0075]
主要抗炎细胞因子(anti-inflammatory cytokines)和细胞因子抑制剂(cytokine inhibitors)已列于以下表2中。抗炎细胞因子(anti-inflammatory cytokines)是能够抑制il-1、肿瘤坏死因子(tnf)和其他主要促炎性细胞因子合成的细胞因子。
[0076]
[表2]
[0077][0078]
4.干细胞培养液
[0079]
本说明书中，培养液可以指培养干细胞的细胞培养上清液。干细胞培养液含有将在干细胞的培养过程中由细胞分泌的外泌体包含在内的各种生理活性物质。另外，上述生理活性物质是能够影响细胞或身体功能的细胞因子、细胞生长因子、免疫调节因子等的统称。
[0080]
本发明的另一特征是，如果在培养干细胞时用脂多糖(lipopolysaccharide，lps)和/或脂磷壁酸(lipoteichoic acid，lta)进行处理，则干细胞分泌到培养液的外泌体产量增加。与源自未处理干细胞的外泌体相比，上述外泌体的抗炎功能得到增强，因此脂多糖(lipopolysaccharide，lps)和/或脂磷壁酸(lipoteichoic acid，lta)所处理的干细胞、其培养液、和/或其外泌体能够用作皮肤或生物体膜(覆盖膜和衬膜)涂布用组合物和/或抗炎组合物的有效成分。
[0081]
另外，如上所述，炎症/免疫反应存在保护和损伤这两方面，炎症反应的净效果由促炎性细胞因子与抗炎细胞因子之间的平衡决定，因此抗炎药物的作用也需要在数量、质量以及时间方面得到精确调节。因此，根据本发明，如果在培养干细胞时用脂多糖(lipopolysaccharide，lps)和/或脂磷壁酸(lipoteichoic acid，lta)进行处理而在体外大量制备抗炎功能得到增强的外泌体，则能够提供调节期望的给药时机、给药部位和/或给药量来进行体内应用。
[0082]
成体干细胞是在需要时分化成特定组织的细胞的未分化状态的细胞。成体干细胞可以是间充质干细胞、间充质基质细胞(mesenchymal stromal cell)或多能干细胞，但不限于此。与从人类胚胎中提取的胚胎干细胞不同，成体干细胞由于从骨髓或脑细胞等已经生长的身体组织中提取，因此具有能够避免伦理争议的优势。本发明中，成体干细胞可以源自脐带、脐带血、骨髓、脂肪、肌肉、神经、皮肤、羊膜或胎盘，但不限于此。
[0083]
间充质干细胞(mesenchymal stem cell)分泌表皮细胞生长因子(epithelial growth factor)、成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor)之类的多种生长因子(growth factor)和细胞因子。
[0084]
源自脐带血的干细胞与源自脂肪或骨髓的成体干细胞不同，使用供体的妊娠周期(40周)期间形成的脐带血，因此具有功效不会因供体的状态而发生差异的有点。
[0085]
培养基是指包含细胞在生物体外(in vitro)生长和增殖所需要的必须成分的组合物，包括本领域中通常使用的所有干细胞培养用培养基，例如，可以使用杜氏改良伊格尔培养基(dulbecco's modified eagle's medium，dmem)、最低必须培养基(minimal essential medium，mem)、基础伊格尔培养基(basal medium eagle，bme)、rpmi 1640、杜氏改良伊格尔培养基：营养混合物f10(dulbecco'smodified eagle's medium:nutrient mixture f-10，dmem/f-10)、杜氏改良伊格尔培养基：营养混合物f12(dulbecco's modified eagle's medium:nutrient mixture f-12，dmem/f-12)、α-最低必须培养基(α-minimal essential medium，α-mem)、格拉斯哥极限必需培养基(glasgow's minimal essential medium，g-mem)、isocove改良杜氏培养基(isocove's modified dulbecco's medium，imdm)、饲养层依赖性培养基(knockout dmem)等市售的培养基或人工合成的培养基，但不限于此。本说明书中，培养基通常包含碳源、氮源和微量元素成分，可以进一步包含氨基酸、抗生素以及各种生长因子等。
[0086]
5.干细胞分泌外泌体
[0087]
本发明的皮肤或生物体膜(覆盖膜和衬膜)涂布用组合物和/或抗炎和/或再生诱导组合物可以为在培养干细胞时用脂多糖(lipopolysaccharide，lps)和/或脂磷壁酸(lipoteichoic acid，lta)处理得到的产物，即干细胞分泌的外泌体、或含有其的培养液。
[0088]
外泌体能够跨越细胞膜递送物质，因此被评价为药物递送的理想的小囊，这样的脂质双层小囊系统能够克服皮肤渗透问题，因此被评价为用于将药物递送至皮肤真皮层的最有效的策略之一(saahil arora等人,asian journal of pharmaceutics,6,4,237-244,2012)。
[0089]
另外，外泌体含有反映该外泌体所来自的细胞类型的rna、蛋白质、脂质以及代谢物质。外泌体含有该外泌体所来自的细胞的各种分子构成成分(例如，蛋白质以及rna)。外泌体蛋白质组成根据该外泌体所来自的细胞和组织(tissue)不同而不同，但大部分外泌体
含有进化保守的共同的蛋白质分子集。
[0090]
外泌体可以从培养细胞后获得的培养液中分离得到，外泌体大小和含量可以受到产生外泌体的细胞所接受的分子信号的影响。根据本发明，从用lps和/或lta预处理的脐带血干细胞分离培养的外泌体与从在一般条件下培养的干细胞分离的外泌体相比，抗炎和/或再生功效优异，外泌体的浓度高。另外，外泌体的大小与未处理对照组没有区别。
[0091]
本发明可以在不分离外泌体的情况下将培养液本身用作原料，但也可以将外泌体分离后使用。另外，为了保证品质等，可以将外泌体分离以确认培养液内外泌体的大小物性。
[0092]
作为从培养液分离外泌体的方法，可以利用离心分离法、免疫结合法、过滤法等。
[0093]
外泌体分离方法中最为常用的超离心分离(ultracetrifugation)不能一次分离大量的外泌体，需要昂贵的设备且分离时需要大量的时间，由于是强烈的离心分离，因此可能使外泌体产生物理损伤，尤其存在所分离的外泌体的纯度降低等缺点。改善这些缺点的方法中，有通过使用与作为外泌体的膜(membrane)中存在的蛋白质的磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine，ps)特异性结合的物质来提高所分离的外泌体的纯度的ps亲和性方法(ps affinity method)。该方法与超离心分离方法相比，虽然能够分离高纯度的外泌体，但存在收率低的缺点。作为其他方法之一的过滤法是一种使培养液流过外泌体大小的孔来仅分离/浓缩外泌体的方式，代表性的有切向流过滤器(tangential flow filter，tff)，已知其是目前为止能够最为安全地分离外泌体的技术。
[0094]
脐带血间充质干细胞(ucb-msc)培养液中的外泌体水平高于源自脂肪组织的间充质干细胞或源自骨髓的间充质干细胞的培养液中的外泌体，因此含有egf、vegf、tgf、hgf、fgf、igf以及pdgf等多种生长因子。egf等生长因子促进作为皮肤构成细胞的成纤维细胞的增殖，并且促进细胞的迁移和胶原蛋白合成等，因此上述源自ucb-msc的外泌体能够显示出皮肤再生、皮肤弹性改善、皮肤皱纹防止或改善、皮肤衰老防止或改善、毛发生长或缩小毛囊恢复等优异的皮肤状态改善效果和伤口愈合效果。
[0095]
根据本发明制造的干细胞培养液中，不仅含有大量外泌体，而且由于其独特的脂质双层结构，还能够大量提供渗透到皮肤真皮层的纳米尺寸的外泌体，并且外泌体中含有大量的抗炎细胞因子以及各种生长因子，因此不仅可以发挥抗炎效果，还可以发挥作为皮肤构成细胞的成纤维细胞的增殖和激活带来的皮肤再生和抗衰老效果、胶原蛋白合成增加、毛发生长、缩小毛囊恢复以及伤口愈合效果。
[0096]
本发明通过脐带血干细胞的细胞培养，能够大量制备透过皮肤的100nm左右大小的外泌体，根据本发明制造的源自脐带血的干细胞培养液对于皮肤等生物体膜(覆盖膜和衬膜)的透过性高，因此不仅适合于皮肤(skin)等生物体膜(覆盖膜和衬膜)涂布用剂型(例如，药物组合物、化妆品、准药物)和/或抗炎剂等治疗剂，同时还具有诱导再生的效果，因此在使用时可以发挥优异的功效。
[0097]
因此，根据本发明，大量包含在培养脐带血干细胞时所分泌的含有高浓度的抗炎细胞因子的外泌体的干细胞培养液或由其分离的外泌体可以是皮肤(skin)等生物体膜(覆盖膜和衬膜)涂布用组合物或抗炎和再生诱导组合物的有效成分。
[0098]
本发明的外泌体可以以含有其的培养液的方式制备或使用，也可以以从上述培养液中去除了细胞的状态来制备或使用。去除了细胞的含有外泌体的培养液由于是无细胞
(cell-free)制剂，因此不仅致癌风险小，不存在移植排异反应的问题，而且在全身给药时也不担心堵塞微血管，并且由于是非细胞分离物质，能够以现成(off the shelf)产品来开发药物，因此能够降低制造单价。
[0099]
6.各种剂型化
[0100]
根据本发明，含有用脂多糖(lps)和/或脂磷壁酸(lta)进行处理而培养的干细胞所分泌的外泌体的培养液和/或从培养液分离的外泌体可以根据使用目的而制成各种剂型。
[0101]
比如，可以将含有外泌体的培养液和/或从培养液分离的外泌体凝胶化(gelation)；或者通过冷冻和/或干燥而制成粉末。
[0102]
可以与水凝胶、明胶等成分混合而用作皮肤或生物体膜(覆盖膜和衬膜)涂布用组合物，该组合物可以通过成分的含量比导致的粘性差异调节凝胶化(gelation)和溶胶化(solation)，并且可以与泊洛沙姆(poloxamer)等成分混合而设计在4℃条件下形成凝胶且在体温条件下形成溶胶的剂型。
[0103]
化妆品组合物可以制成选自由溶液、外用软膏、霜、泡沫、滋养化妆水、柔肤化妆水、香水、面膜、柔肤水、乳液、妆前乳、精华乳、肥皂、液体清洗剂、入浴剂、防晒霜、防晒油、悬浊液、乳浊液、膏、凝胶、润肤液、粉、肥皂、含表明活性剂清洁剂、油、粉底、乳液粉底、蜡粉底、贴剂和喷雾组成的组中的剂型，但不限于此。
[0104]
化妆品组合物可以进一步包含一种以上在一般皮肤化妆品中配合的化妆品学上可接受的载体，作为通常的成分，例如，可以适当配合油、水、表面活性剂、保湿剂、低级醇、增稠剂、螯合剂、色素、防腐剂、香料等，但不限于此。
[0105]
化妆品组合物中包含的化妆品学上可接受的载体根据上述化妆品组合物的剂型不同而不同。
[0106]
在剂型为软膏、膏、霜或凝胶的情况下，作为载体成分，可以使用动物性油、植物性油、蜡、石蜡、淀粉、黄芪胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、硅酮、膨润土、二氧化硅、滑石、氧化锌等，但不限于此。它们可以单独使用或两种以上混合使用。
[0107]
在剂型为粉或喷雾的情况下，作为载体成分，可以使用乳糖、滑石、二氧化硅、氢氧化铝、硅酸钙、聚酰胺粉末等，特别是在喷雾的情况下，可以进一步包含氯氟烃、丙烷/丁烷或二甲醚之类的推进剂，但不限于此。它们可以单独使用或两种以上混合使用。
[0108]
在剂型为溶液或乳浊液的情况下，作为载体成分，可以使用溶剂、增溶剂或乳化剂等，比如，可以使用水、甘油、乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苄醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁基乙二醇油等，尤其可以使用棉籽油、花生油、玉米胚芽油、橄榄油、蓖麻籽油以及芝麻油、甘油脂肪族酯、聚乙二醇或失水山梨糖醇的脂肪酸酯，但不限于此。它们可以单独使用或两种以上混合使用。
[0109]
在剂型为悬浊液的情况下，作为载体成分，可以使用水、甘油、乙醇或丙二醇之类的液体稀释剂，乙氧基化异硬脂醇、聚氧乙烯山梨糖醇酯以及聚氧乙烯失水山梨糖醇酯之类的悬浮剂，微晶性纤维素、偏氢氧化铝、膨润土、琼脂或黄芪胶等，但不限于此。它们可以单独使用或两种以上混合使用。
[0110]
在剂型为肥皂的情况下，作为载体成分，可以使用脂肪酸的碱金属盐、脂肪酸半酯盐、脂肪酸蛋白水解物、羟乙基磺酸盐、羊毛脂衍生物、脂肪族醇、植物性油、甘油、糖等，但
不限于此。它们可以单独使用或两种以上混合使用。
[0111]
化妆品组合物中，上述外泌体的含量可以为上述化妆品组合物总重量的0.0001至50重量％，更具体地，含量可以为0.0005至10重量％。在外泌体的含量在上述范围内时，具有表现出优异的皮肤状态改善功效的优点，且具有使组合物的剂型稳定的有点。
[0112]
一般而言，准药物是指以诊断、治疗、改善、减轻、治疗或预防人或动物疾病为目的使用的物品中作用比药物轻或除以药物用途使用的物品之外的物品。包括用于治疗或预防人或动物疾病的产品、对人体的作用轻微或不直接作用的产品等。
[0113]
准药物组合物可以制成选自由身体清洁剂、泡沫、肥皂、面膜、软膏剂、霜、润肤液、精华乳以及喷雾组成的组中的剂型，但不限于此。
[0114]
在本发明为皮肤(skin)之类的生物体膜(覆盖膜和衬膜)涂布用或抗炎和/或再生诱导组合物的情况下，除了包含外泌体作为有效成分之外，还可以进一步包含药学上可接受的载体。
[0115]“药学上可接受”是指，给药时不刺激生物体，并且不妨碍所给药的化合物的生物学活性和特性，可以在药学领域中通用。
[0116]
给药量可以为用于改善皮肤状态的药学上有效的量。上述术语“药学上有效的量”是指以能够应用于医学治疗的合理效益/风险比率治疗疾病时充足的量，有效剂量水平可以根据包括个体类型以及严重程度、年龄、性别、疾病的种类、药物的活性、对药物的敏感度、给药时间、给药途径以及排出比率、治疗时间、同时使用的药物在内的要素和其他医学领域众所周知的要素来确定。另外，如本领域技术人员所理解的那样，有效量可以根据处理的途径、赋形剂的使用以及与其他药物一起使用的可能性而变化。
[0117]
载体的种类没有特别限制，可以使用任意载体，只要是本技术领域中通常使用的载体即可。虽不限于此，但作为具体例，可以举出食盐水、无菌水、林格氏溶液、缓冲食盐水、白蛋白注射溶液、乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、麦芽糖糊精、甘油、乙醇等。它们可以单独使用或两种以上混合使用。
[0118]
另外，视需要，可以添加赋形剂、稀释剂、抗氧化剂、缓冲液或抑菌剂等其他药学上可接受的添加剂来使用，并且可以附加填充剂、增量剂、润湿剂、崩解剂、分散剂、表面活性剂、粘结剂或润滑剂等来使用。
[0119]
上述皮肤或生物体膜(覆盖膜和衬膜)涂布用组合物中，本发明的外泌体可以用作透皮型载体。
[0120]
另一方面，经皮给药途径通常通过经皮贴剂来将药物应用于皮肤，为了获得全身效果而使用。吸收速度根据应用部位皮肤的物理特性以及药物脂溶性不同而存在巨大不同。
[0121]
本发明的抗炎组合物和/或皮肤或生物体膜(覆盖膜和衬膜)涂布用组合物可以为含有外泌体的经皮用贴剂形式。经皮用贴剂可以具备在附着皮肤时保护产品的非透过性支撑体(背衬膜(backing film))、含有大部分药物的药物储藏层(drug reservoir)、药物释放膜(drug-release membrane)以及附着粘着剂层(contact adhesive)。可以进一步具备包装时作为保护产品的膜(film)且在使用时去除的剥离纸(剥离衬垫(release liner))。
[0122]
药物释放膜(drug-release membrane)可以是在药物透过时调节其吸收率的高分子膜。另外，附着粘着剂层(contact adhesive)可以是被设计成附着于皮肤7天的低刺激粘
着剂层(psa：压敏粘着剂(pressure sensitive adhesive))。
[0123]
发明效果
[0124]
本发明能够提供在培养时用脂多糖(lps)和/或脂磷壁酸(lta)进行预处理而对干细胞诱导轻度炎症反应，激活干细胞的免疫反应后使用诱导了抗炎反应的干细胞，由此抗炎功能得到增强的高浓度外泌体。另外，能够提供从以高含量包含组织再生物质的脐带血干细胞分泌的诱导组织再生的外泌体。本发明的外泌体能够用作可应用于包括抗炎和/或再生诱导组合物、和/或皮肤或生物体膜(覆盖膜和衬膜)涂布用组合物在内的各种剂型的有效成分。
附图说明
[0125]
图1是用lps和lta预处理的脐带血干细胞以及培养液中炎症抑制因子表达量分析图表。
[0126]
图2是示出用lps和lta预处理而制备的脐带血干细胞的外泌体浓度和大小的图表。
[0127]
图3是用lps和lta预处理而制备的干细胞的外泌体中炎症相关因子含量分析图表。
[0128]
图4是对诱导了炎症反应的人角质形成细胞进行外泌体处理后细胞活力分析图表。
[0129]
图5是对诱导了炎症的人角质细胞进行外泌体处理后炎症诱导因子表达分析图表。
[0130]
图6是对诱导了炎症的人角质细胞进行外泌体处理后炎症抑制因子表达分析图表。
[0131]
图7是对皮肤细胞和角质细胞用外泌体处理后对细胞增殖增加率分析的图表。
[0132]
图8是对皮肤细胞和角质细胞用外泌体处理后为了确认是否促进细胞迁移而对细胞染色后拍摄的照片。
[0133]
图9是存在于皮肤中的各种细胞类型的概略图。
[0134]
图10是示出革兰氏阳性菌(左侧)和革兰氏阴性菌(右侧)的细胞壁结构的概念图。
[0135]
图11示出了脂多糖(lps)的结构(structure)。(红色(核心)为kdo残基，蓝色为葡萄糖胺(glucosamine)残基，黑色为酰基链(acyl chains)，绿色为磷酸酯基(phosphate groups))。
[0136]
图12示出了金黄色葡萄球菌(s.aureus)的脂磷壁酸(lta)结构。
[0137]
图13图示了源自kc的细胞因子的多种效果。
具体实施方式
[0138]
以下，通过实施例来更加具体地说明本发明。只是，以下实施例仅用于明确例示本发明的技术特征，并非限定本发明的保护范围。
[0139]
[材料]
[0140]
脂多糖(lipopolysaccharide)购自默克西格玛奥德里奇(merck sigma-aldrich；目录号：l1329)，生物来源为大肠杆菌(escherichia coli；o127:b8)。
[0141]
脂磷壁酸(lipoteichoic acid)购自默克西格玛奥德里奇(目录号：l2515)，生物来源为金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)。
[0142]
实施例1.细胞培养
[0143]
1.1脐带血干细胞(umbilical cord blood stem cell)
[0144]
将脐带血干细胞(umbilical cord blood stem cell)在含有10％牛胎儿血清(fetal bovine serum)和成纤维细胞生长因子2(fibroblast growth factor 2，fgf2)的dmem/f12培养基中在37℃、5％co2培养箱中进行培养。
[0145]
1.2人角质形成细胞(human keratinocyte)和人皮肤成纤维细胞(human fibroblast)
[0146]
将人角质形成细胞(human keratinocyte)在包含10％牛胎儿血清(fetal bovine serum)的rpmi-1640培养基中在37℃、5％co2培养箱中进行培养。
[0147]
将人皮肤成纤维细胞(human fibroblast)在包含10％牛胎儿血清(fetal bovine serum)的dmem培养基中在37℃、5％co2培养箱中进行培养。
[0148]
实施例2.脐带血干细胞培养液制备
[0149]
2.1细胞培养
[0150]
将培养的脐带血干细胞用pbs洗涤后，利用胰蛋白酶(trypsin)edta使细胞悬浮后，放入胰蛋白酶edta处理量2倍的培养基使胰蛋白酶edta灭活。将悬浮的细胞离心分离而去除上清液。将细胞团块(pellet)用培养基再悬浊后，测定细胞数，以4～10x103个细胞(cells)/cm2进行接种(seeding)。
[0151]
2.2脐带血干细胞培养液制备
[0152]
在脐带血干细胞的细胞融合度(cell confluency)达到60～90％时，用pbs洗涤培养基，然后将培养基更换为无血清培养基(serum free media)，之后培养2～7天。培养2～7天后，收集除细胞外的所有上清液，在1000xg下进行3分钟离心分离而将细胞和杂质去除后，利用0.2um过滤器对培养液进行过滤。
[0153]
2.3用lps(脂多糖)和lta(脂磷壁酸)预处理的脐带血干细胞培养液制备
[0154]
以脐带血干细胞接种(seeding)后用无血清培养基(serum free media)更换培养基为基准，在12～48小时之间，用脂多糖(lipopolysaccharide_10～1000ng/ml)和脂磷壁酸(lipoteichoic acid_10～1000ng/ml)单独或一起处理而进行培养后，用pbs洗涤培养基，将培养基更换为无血清培养基(serum free media)，然后培养2～7天。培养2～7天后，收集除细胞外的所有上清液，在1000xg下进行3分钟离心分离而将细胞和杂质去除后，利用0.2um过滤器对培养液进行过滤。
[0155]
2.4用lps和lta预处理的脐带血干细胞和培养液中炎症抑制因子表达量分析
[0156]
对于用lps(脂多糖)和lta(脂磷壁酸)单独或一起对脐带血干细胞预处理的脐带血干细胞和培养液中抗炎相关因子的表达量进行分析。
[0157]
如图1所示，确认到(a)与对照组(实施例2.2)相比，用lps和lta预处理的脐带血干细胞(实施例2.3)中，抗炎相关因子tgf-β1和il-10的mrna表达量增加。(b)与对照组相比，用lps和lta预处理后制备的培养液中抗炎相关因子tgf-β1和含量增加。另一方面，在il-10的情况下，各实验组没有含量的差异。
[0158]
实施例3.脐带血干细胞外泌体分离
[0159]
在实施例2的各条件下进行制备，对于利用0.2um过滤器过滤的培养液，使用capturem外泌体分离试剂盒(capturem
tm
exosome isolation kit，takara bio)提取外泌体。
[0160]
3.1用lps和lta预处理而制备的脐带血干细胞外泌体浓度和大小分析
[0161]
对于从在各个不同条件下培养的脐带血干细胞培养液中提取的外泌体，利用nanosight_ns300(malvern)测定外泌体的不同大小分布以及浓度。
[0162]
如图2所示，对各个不同条件外泌体进行分析的结果，确认到与对照组相比，从用lps和/或lta预处理的脐带血干细胞中分离的外泌体的浓度增加，并且确认到外泌体的大小与对照组没有区别。
[0163]
3.2用lps和lta预处理而制备的干细胞外泌体中炎症相关因子含量分析
[0164]
利用elisa对各个不同条件脐带血干细胞外泌体中存在的抗炎相关因子的含量进行分析。如图3所示，对各个不同条件外泌体进行分析的结果，确认到(a)炎症抑制因子tgf-β1和il-10在外泌体中的含量与未处理对照组(dmem)相比，在用lps和lta预处理的脐带血干细胞外泌体中更高，(b)炎症诱导因子tnf-α和ifn-γ与对照组没有区别。
[0165]
实施例4.人角质细胞中的外泌体抗炎功效分析
[0166]
4.1对诱导了炎症反应的人角质形成细胞进行外泌体处理后的细胞活力分析
[0167]
将人角质细胞(human keratinocyte)接种于12孔板(well plate)后，利用包含10％牛胎儿血清(fetal bovine serum)的rpmi-1640进行培养，在细胞融合度达到80％时，将培养基更换为包含tnf-α(10ng/ml)和ifn-γ(10ng)的无血清rpmi-1640基础培养基。在更换培养基6小时后，向诱导了炎症反应的人角质形成细胞添加从实施例2的各培养液提取的外泌体1～10x108个，在培养24小时后，通过cck-8分析确认细胞活力(a)。
[0168]
另外，用实施例2的各个不同条件外泌体对人角质形成细胞预处理6小时后，分别以10ng/ml浓度用炎症诱导物质tnf-α和ifn-γ进行处理，24小时之后分析细胞活力(b)。
[0169]
如图4(a)所示，分别以10ng/ml浓度用炎症诱导物质tnf-α和ifn-γ对人角质形成细胞预处理6小时后，用实施例2的各个不同条件外泌体进行处理，结果确认到，在诱导了炎症的对照组(图表中第2个对照)中，与没有诱导的对照组(图表中第1个对照)相比，细胞活力大幅下降，在用实施例2.3的各个不同条件外泌体进行了处理的实验组中，细胞活力得到恢复。
[0170]
如图4(b)所示，用实施例2的各个不同条件外泌体对人角质形成细胞预处理6小时后，分别以10ng/ml浓度用炎症诱导物质tnf-α和ifn-γ进行处理，24小时后分析细胞活力，结果确认到，在诱导了炎症的对照组(图表中第2个对照)中，与没有诱导的对照组(图表中第1个对照)相比，细胞活力大幅下降，在用实施例2.3的各个不同条件外泌体处理的实验组中，细胞活力得到恢复。
[0171]
另外，如图4(a)、(b)所示，在用lps和lta预处理而制备的外泌体进行处理的实验组(lps、lta、lps+lta)中，细胞活力没有下降，因此可以推断lps和lta没有残留在外泌体中。
[0172]
4.2抗炎功效确认试验
[0173]
将人角质细胞(human keratinocyte)接种于12孔板后，利用包含10％牛胎儿血清(fetal bovine serum)的rpmi-1640进行培养，在细胞融合度达到80％时，将培养基更换为
包含炎症诱导物质tnf-α(10ng/ml)和ifn-γ(10ng)的无血清rpmi-1640基础培养基。更换培养基6小时后，添加从实施例2的各培养液提取的外泌体2～10x108个，培养24小时后收集培养液和细胞。
[0174]
4.2.1对诱导了炎症的人角质细胞进行外泌体处理后的炎症诱导因子表达分析
[0175]
诱导炎症反应后，从用实施例2的外泌体进行处理的人角质形成细胞中提取总rna，分析促炎性细胞因子tnf-α和il-6的mrna表达量，利用elisa对诱导炎症反应后用实施例2的外泌体进行处理的人角质形成细胞的培养液分析促炎性细胞因子tnf-α和il-6的蛋白质表达量。
[0176]
对诱导了炎症反应的人角质形成细胞用实施例2的各个不同条件外泌体进行处理后，分析细胞内炎症诱导因子表达，结果如图5(a)所示，确认到在诱导了炎症的对照组(图表中第2个对照)中，与没有诱导的对照组(图表中第1个对照)相比，炎症诱导因子的mrna表达量大幅增加，在用实施例2.3的各个不同条件外泌体进行处理的实验组(lps、lta、lps+lta)中，发生了不同程度的减少。
[0177]
另外，如图5(b)所示，确认到(b)在诱导了炎症的对照组(图表中第2个对照)中，与没有诱导的对照组(图表中第1个对照)相比，炎症诱导因子的蛋白质表达量大幅增加，在用实施例2.3的各个不同条件外泌体进行处理的实验组(lps、lta、lps+lta)中，发生了不同程度的减少。
[0178]
特别是，在用lps和lta这两者预处理的实验组中，确认到与没有进行处理的实验组相比，炎症诱导因子的表达量进一步下降，通过lps和lta的预处理，外泌体的抗炎功效得到提高。
[0179]
4.2.2对诱导了炎症的人角质细胞进行外泌体处理后的炎症抑制因子表达分析
[0180]
对诱导了炎症反应的人角质形成细胞用实施例2的各个不同条件外泌体进行处理后，分析细胞内炎症抑制因子表达。如图6所示，在用实施例2.3的各个不同条件外泌体进行处理的实验组(lps、lta、lps+lta)中，以不同程度调节了炎症抑制因子表达。
[0181]
特别是，在用lps和lta这两者预处理的实验组中，确认到与没有进行处理的实验组相比，炎症诱导抑制因子tgf-β1和il-10的表达量进一步增加，通过lps和lta的预处理，外泌体的抗炎功效得到提高，另一方面，确认到炎症诱导物质il-4的表达量没有增加。
[0182]
实施例5.外泌体处理后的再生诱导功效分析
[0183]
利用在实施例2的条件下用lps和lta同时进行处理后分离的外泌体，对于能够确认为组织再生特性的细胞增殖能力和细胞迁移能力进行分析。
[0184]
5.1对人角质细胞和人成纤维细胞进行外泌体处理后的细胞增殖能力分析
[0185]
利用添加有10％牛胎儿血清(fetal bovine serum)的rpmi-1640和dmem培养基，将角质细胞(keratinocyte)和成纤维细胞(fibroblast)分别涂布于培养皿后，诱导一天粘附，第二天用外泌体进行处理。然后，以24小时间隔，用cck-8进行处理并测定细胞活力，结果确认到，在两细胞中，用外泌体处理的实验组与对照组相比，细胞增殖速度均明显更快(图7)。
[0186]
5.2对人角质细胞和人成纤维细胞进行外泌体处理后的细胞迁移能力分析
[0187]
将角质细胞(keratinocyte)和成纤维细胞(fibroblast)以细胞融合度达到100％的方式涂抹于安装有多孔膜(porous membrane)的迁移小室(trans well)并诱导粘附后，
用外泌体进行处理，在培养48小时的同时，以能够通过孔迁移的方式进行诱导。经过一定时间后，用结晶紫(crystal violet)对膜的反面进行染色，确认通过孔迁移的细胞。结果，用外泌体处理的实验组的细胞显示出比对照组明显更高的染色程度，由此确认到外泌体促进细胞的迁移(图8)。

技术特征：
1.一种外泌体制备方法，其特征在于，包括：a步骤，为了与未处理脐带血干细胞相比，增加在培养脐带血干细胞时所分泌的外泌体的浓度，在添加了选自由脂多糖lps和脂磷壁酸lta组成的组中的一种以上的无血清培养基中培养脐带血干细胞；以及b步骤，选择性分离作为a步骤的产物的脐带血干细胞、其培养液、和/或其外泌体。2.根据权利要求1所述的外泌体制备方法，其特征在于，所述外泌体与源自未处理脐带血干细胞的外泌体相比抗炎和/或再生功能得到增强。3.一种皮肤或生物体膜涂布用组合物，其包含通过权利要求1或2所述的制备方法获得的外泌体或含有该外泌体的培养液作为有效成分，所述生物体膜为覆盖膜和衬膜。4.根据权利要求3所述的皮肤或生物体膜涂布用组合物，其特征在于，为化妆品组合物、准药物组合物或药物组合物。5.根据权利要求3所述的皮肤或生物体膜涂布用组合物，其特征在于，脐带血干细胞的外泌体用作透皮型载体。6.根据权利要求3所述的皮肤或生物体膜涂布用组合物，其特征在于，作为与高分子混合而凝胶化的剂型，在体温条件下形成溶胶。7.一种抗炎和/或再生诱导组合物的制备方法，其特征在于，包括：第一步骤，在培养干细胞时用选自由脂多糖lps和脂磷壁酸lta组成的组中的一种以上进行处理；以及第二步骤，选择性分离作为第一步骤的产物的干细胞、其培养液、和/或其外泌体。8.根据权利要求7所述的抗炎和/或再生诱导组合物的制备方法，其特征在于，在第一步骤中，在培养干细胞时用脂多糖lps和脂磷壁酸lta这两者进行处理。9.根据权利要求7所述的抗炎和/或再生诱导组合物的制备方法，其特征在于，脂多糖lps为革兰氏阴性细菌的细胞壁成分，和/或脂磷壁酸lta为革兰氏阳性细菌的细胞壁成分。10.根据权利要求7所述的抗炎和/或再生诱导组合物的制备方法，其特征在于，在第一步骤中，通过脂多糖lps和/或脂磷壁酸lta处理，从而在培养干细胞时，与未处理干细胞相比，抗炎细胞因子的mrna表达量和/或分泌量增加，和/或所分泌的外泌体内抗炎细胞因子含量高。11.根据权利要求7所述的抗炎和/或再生诱导组合物的制备方法，其特征在于，在第一步骤中，通过脂多糖lps和/或脂磷壁酸lta处理，从而激活干细胞的免疫反应。12.根据权利要求7所述的抗炎和/或再生诱导组合物的制备方法，其特征在于，在第一步骤中，脂多糖lps和/或脂磷壁酸lta诱导干细胞的炎症反应。13.根据权利要求7所述的抗炎和/或再生诱导组合物的制备方法，其特征在于，作为第一步骤的产物的外泌体不含有lps和/或lta。14.根据权利要求7所述的抗炎和/或再生诱导组合物的制备方法，其特征在于，在用第一步骤的产物对细胞进行处理时，降低炎症诱导因子的表达量，和/或提高炎症诱导抑制因子的表达量。15.根据权利要求7所述的抗炎和/或再生诱导组合物的制备方法，其特征在于，抗炎组合物为作为第一步骤的产物的干细胞所分泌的外泌体；或含有该外泌体的培养液。16.根据权利要求7所述的抗炎和/或再生诱导组合物的制备方法，其特征在于，在第一
步骤中，干细胞所分泌的外泌体产量因脂多糖lps和/或脂磷壁酸lta而增加。17.根据权利要求7至16中任一项所述的抗炎和/或再生诱导组合物的制备方法，其特征在于，干细胞为脐带血干细胞。18.一种抗炎和/或再生诱导组合物，其通过权利要求7至16中任一项所述的制备方法而获得。

技术总结
本发明涉及利用脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)和脂磷壁酸(Lipoteichoic Acid，LTA)的抗炎功能得到增强的高浓度干细胞外泌体制备方法；以及通过上述方法能够制备的抗炎和/或再生诱导组合物。本发明的抗炎组合物的制备方法包括：第一步骤，在培养干细胞时用选自由脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)和脂磷壁酸(Lipoteichoic Acid，LTA)组成的组中的一种以上进行处理；以及第二步骤，选择性分离作为第一步骤的产物的干细胞、其培养液、和/或其外泌体。体。体。


技术研发人员：李在龙 安熙珍 李睿仁 李东烈 罗圭钦
受保护的技术使用者：株式会社普里莫里斯治疗
技术研发日：2021.12.06
技术公布日：2023/10/5