一株新型重组BCG菌株及其构建方法和应用

一株新型重组bcg菌株及其构建方法和应用
技术领域
1.本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一株新型重组bcg菌株及其构建方法和应用。


背景技术：

2.铁是生命活动中必不可少的元素之一，它参与了包括细胞呼吸、dna合成和细胞分裂等多种生物过程。铁载体是一类具有高亲和力和选择性地结合铁离子的分子，主要用于运输和储存铁，以满足细胞对铁的需求。铁载体的研究不仅有助于深入理解细胞铁代谢和铁载体毒性的机制，还具有广泛的应用前景。例如，铁载体可以作为药物输送系统，将药物有效地输送到靶细胞内，从而提高治疗效果；铁载体应用于工业和农业生产中，从而提高植物对铁的吸收能力以及某些微生物对铁的利用效率等。此外，铁载体可以通过限制微生物对铁的利用和减少游离铁离子的浓度来产生抑菌效应。这种抑菌效应不仅在自然界中起着重要的竞争作用，还可以应用于开发新的抗微生物药物或防治微生物感染的策略。
3.结核分枝杆菌是引起结核病的病原菌，其铁载体是一类对铁离子具有高亲和力的小分子，主要包括分枝菌素(mbt)和羧基分枝菌素(cmbt)。目前，分枝杆菌中铁载体的研究主要包括铁载体的代谢调控机制、调节宿主细胞的免疫学作用以及分枝杆菌的鉴定等。最近，研究发现高浓度的铁载体对结核分枝杆菌具有毒性。这些研究有望为探索结核病新的治疗和诊断策略以及制备抑菌剂应用于工业和农业生产提供理论和实践基础。
4.遗憾的是，现阶段分枝杆菌铁载体主要是使用野生型牛分枝杆菌bcg菌株在缺铁培养条件下进行生产。这种方式生产的铁载体产率低而且工艺复杂，因此需要一种应用于铁载体生产的安全高产菌株以及简单快速地分离纯化方法。


技术实现要素：

5.本发明克服了现有技术中分枝杆菌铁载体主要是使用野生型牛分枝杆菌bcg菌株在缺铁培养条件下进行生产，生产的铁载体产率低而且工艺复杂的技术问题，提供一株新型重组bcg菌株及其构建方法和应用。
6.为解决上述问题，本发明采取如下技术方案：
7.一株新型重组bcg菌株，所述bcg菌株由野生型牛分枝杆菌atcc 1173p2经过基因改造获得，所述基因改造方法为，利用潮霉素基因hyg片段替代野生型牛分枝杆菌的esxh基因片段；
8.所述esxh基因的核苷酸序列如seq id no：1所示；
9.所述潮霉素基因hyg的核苷酸序列如seq id no：2所示。
10.上述新型重组bcg菌株的构建方法包括如下步骤：
11.(1)以野生型牛分枝杆菌atcc 1173p2菌株为模板，在esxh基因同源臂上下游800bp的位置分别设计引物对，进行pcr扩增得到up800和dn800；
12.(2)采用paci-spei分别对自杀质粒pmind和up800进行酶切、酶连和转化，获得重
组质粒pmind-up800；随后利用hindiii-nhei对重组质粒以及dn800进行酶切、酶连和转化，最终获得重组质粒pmind-up800-dn800；
13.(3)采用紫外照射步骤(2)质粒pmind-up800-dn800后，将质粒电转至野生型牛分枝杆菌atcc 1173p2菌株中，然后经过含有潮霉素hygr和xgal以及oadc的7h10培养基平板筛选，获得新型重组bcg菌株。
14.进一步的，所述步骤(1)的引物对包括上游同源臂引物对和下游同源臂引物对；
15.所述上游同源臂引物对的正向引物的核苷酸序列如seq id no：3所示；反向引物的核苷酸序列如seq id no：4所示；
16.所述下游同源臂引物对的正向引物的核苷酸序列如seq id no：5所示；反向引物的核苷酸序列如seq id no：6所示。
17.本发明的另一个目的还在于保护上述新型重组bcg菌株以及上述方法制备得到的新型重组bcg菌株在提高铁载体产量中的应用。
18.本发明的另一个目的还在于保护上述新型重组bcg菌株在制备铁载体中的应用。
19.上述应用中，所述铁载体的制备方法为：将新型重组bcg菌株培养后进行离心分离，收集细胞沉淀，然后将沉淀用磷酸盐缓冲液洗涤，并用乙醇重悬之后取提取液与氯仿混合，滴加fecl3溶液直到观察到红色的饱和度，再加入蒸馏水混匀形成双相溶液；取有机相用水洗涤后，用无水硫酸镁干燥、离心，并将有机相进行真空冷冻干燥后获得到铁载体。
20.本发明与现有技术相比较具有以下有益效果：
21.本发明通过将野生型牛分枝杆菌atcc 1173p2进行基因改造获得新型重组bcg菌株，具体的基因改造方法为，利用潮霉素基因hyg片段替代野生型牛分枝杆菌的esxh基因片段。本发明的新型重组bcg菌株与野生型牛分枝杆菌atcc 1173p2菌株相比，新型重组bcg菌株的胞内铁载体的含量提高了12.5倍，并且纯化得到的铁载体纯度高。因此，本发明得到的新型重组bcg菌株可以用于铁载体的高效生产。
附图说明
22.图1为野生型牛分枝杆菌atcc 1173p2菌株(wt)基因组中敲除esxh的重组策略模式图；
23.图2为野生型牛分枝杆菌atcc 1173p2菌株(wt)和新型重组bcg菌株(koesxh)的pcr验证结果；附图中m为dl10,000dnamarker；从下至上依次为1从下至上依次为250bp、500bp、1000bp、2000bp、4000bp、7000bp、10,000bp；
24.图3为野生型牛分枝杆菌atcc 1173p2菌株(wt)和新型重组bcg菌株(koesxh)生长到对数期后的照片；
25.图4为野生型牛分枝杆菌atcc 1173p2菌株(wt)和新型重组bcg菌株(koesxh)在7h9培养基中的生长差异图；
26.图5为铁载体(fe-mbt)质谱鉴定结果图；
27.图6为野生型牛分枝杆菌atcc 1173p2菌株(wt)和新型重组bcg菌株(koesxh)胞内铁载体抽提液的液相质谱检测结果图；
28.图7为野生型牛分枝杆菌atcc 1173p2菌株(wt)和新型重组bcg菌株(koesxh)胞内不同种铁载体的含量；
29.图8为野生型牛分枝杆菌atcc 1173p2菌株(wt)和新型重组bcg菌株(koesxh)胞内总铁载体的含量对比图。
具体实施方式
30.下面结合实施例和试验对本发明作进一步说明。
31.实施例1
32.一株新型重组bcg菌株，所述bcg菌株由野生型牛分枝杆菌atcc 1173p2经过基因改造获得，所述基因改造方法为，利用潮霉素基因hyg片段替代野生型牛分枝杆菌的esxh基因片段；本发明的野生型牛分枝杆菌atcc 1173p2保藏于美国模式培养物集存库(atcc)，发明人于美国模式培养物集存库(atcc)购买获得，型号为mycobacterium tuberculosis variant bovis bcg pasteur 1173p2。
33.所述esxh基因的核苷酸序列如seq id no：1所示；
34.所述潮霉素基因hyg的核苷酸序列如seq id no：2所示。
35.实施例2
36.实施例1的一株新型重组bcg菌株的构建方法，其包括如下步骤：
37.(1)以野生型牛分枝杆菌atcc 1173p2菌株为模板，在esxh基因同源臂上下游800bp的位置分别设计引物对，进行pcr扩增得到up800和dn800；
38.(2)采用paci-spei分别对自杀质粒pmind和up800进行酶切、酶连和转化，获得重组质粒pmind-up800；随后利用hindiii-nhei对重组质粒以及dn800进行酶切、酶连和转化，最终获得重组质粒pmind-up800-dn800；
39.(3)采用紫外照射步骤(2)质粒pmind-up800-dn800后，将质粒电转至野生型牛分枝杆菌atcc 1173p2菌株中，然后经过含有潮霉素hygr和xgal以及oadc的7h10培养基平板筛选，获得新型重组bcg菌株。
40.其中，所述引物的包括上游同源臂引物和下游同源臂引物；
41.所述上游同源臂正向引物的核苷酸序列如seq id no：3所示；
42.所述上游同源臂反向引物的核苷酸序列如seq id no：4所示；
43.所述下游同源臂正向引物的核苷酸序列如seq id no：5所示；
44.所述下游同源臂反向引物的核苷酸序列如seq id no：6所示。
45.其中野生型牛分枝杆菌atcc 1173p2菌株(wt)基因组中敲除esxh的重组策略模式图见图1所示。
46.本实施例在上述基础上对获得的新型重组bcg菌株扩培，具体方法为：从步骤(3)中7h10培养基平板上挑取白色菌落于含有潮霉素hygr和oadc的7h9培养基中培养，于37℃进行摇床培养；待细菌培养至对数期，取菌液进行pcr以及测序验证。
47.野生型牛分枝杆菌atcc 1173p2菌株(wt)和新型重组bcg菌株(koesxh)的pcr验证结果见图2所示。由图2的实验结果可以证实基因esxh在野生型牛分枝杆菌atcc 1173p2菌株(wt)基因组中被潮霉素基因hyg替代，即esxh在bcg菌株中敲除成功，获得了新型重组bcg菌株(koesxh)。
48.在上述实验的基础上，本实施例还将野生型牛分枝杆菌atcc 1173p2菌株(wt)和新型重组bcg菌株(koesxh)分别在7h9培养基中培养，两种菌株培养至对数期后的照片见图
3，而两种菌株在7h9培养基中的生长差异见图4。图3和图4可以看出，koesxh溶液偏黄，但新型重组bcg菌株(koesxh)生长与野生型牛分枝杆菌atcc 1173p2菌株(wt)没有明显差异。
49.实施例3
50.本实施例在实施例2的基础上分别利用野生型牛分枝杆菌atcc 1173p2菌株(wt)和新型重组bcg菌株(koesxh)制备铁载体，并对铁载体进行分离纯化，其方法包括如下步骤：
51.(1)菌株培养：将野生型牛分枝杆菌atcc 1173p2菌株(wt)和新型重组bcg菌株(koesxh)分别在7h9培养基中培养至对数期中期，随后在8000rpm转速下离心5分钟，分别收集细胞沉淀；
52.(2)铁载体的分离纯化：分别将步骤(1)得到的细胞沉淀用磷酸盐缓冲液洗涤一次，并用100％乙醇重悬，于室温下搅拌过夜；将提取液以8000rpm离心5分钟，取上清液与等体积的氯仿混合，室温放置3min；将10％w/v的fecl3(100％乙醇溶解)滴加到溶液中，直到观察到红色的饱和度；加入四分之三体积的蒸馏水，充分混匀，静置以形成双相溶液(氯仿和水/乙醇相)；有机相用等体积的h2o洗涤4次后，用无水硫酸镁干燥剩余的水，8000rpm离心5分钟；有机相于-80℃冷冻过夜，随后进行真空冷冻干燥4h获得到铁载体。冻干的粉末(即铁载体)分别用100％乙醇溶解，进行液相质谱分析。其中，铁载体(fe-mbt)质谱鉴定结果见图5，而野生型牛分枝杆菌atcc 1173p2菌株(wt)和新型重组bcg菌株(koesxh)两种菌株胞内铁载体的液相分析结果见图6。分别对野生型牛分枝杆菌atcc 1173p2菌株(wt)和新型重组bcg菌株(koesxh)两种菌株胞内不同的铁载体进行定量检测，结果见图7，而野生型牛分枝杆菌atcc 1173p2菌株(wt)和新型重组bcg菌株(koesxh)两种菌株胞内总铁载体的含量见图8。由图7和图8可知，与野生型牛分枝杆菌atcc 1173p2菌株(wt)相比，新型重组bcg菌株(koesxh)胞内铁载体的含量提高了12.5倍(本次检测中，误差值代表了3次生物学重复的误差值，p值是通过graphpadprism7软件中非配对双尾t检验得出，***代表p《0.001)。
53.基于以上的实施例以及检测结果可以说明本发明可以将野生型牛分枝杆菌atcc 1173p2菌株基因组中esxh基因敲除且被潮霉素基因hyg替代后获得的新型重组bcg菌株。与野生型牛分枝杆菌atcc 1173p2菌株相比，新型重组bcg菌株(koesxh)的胞内铁载体的含量提高了12.5倍，并且纯化得到的铁载体纯度高。本发明得到的新型重组bcg菌株(koesxh)可以用于铁载体的高效生产和纯化。
54.上述说明是针对本发明较佳可行实施例的详细说明，但实施例并非用以限定本发明的专利申请范围，凡本发明所提示的技术精神下所完成的同等变化或修饰变更，均应属于本发明所涵盖专利范围。

技术特征：
1.一株新型重组bcg菌株，其特征在于：所述bcg菌株由野生型牛分枝杆菌atcc 1173p2经过基因改造获得，所述基因改造方法为，利用潮霉素基因hyg片段替代野生型牛分枝杆菌的esxh基因片段；所述esxh基因的核苷酸序列如seq id no：1所示；所述潮霉素基因hyg的核苷酸序列如seq id no：2所示。2.如权利要求1所述新型重组bcg菌株的构建方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：(1)以野生型牛分枝杆菌atcc 1173p2菌株为模板，在esxh基因同源臂上下游800bp的位置分别设计引物对，进行pcr扩增得到up800和dn800；(2)采用paci-spei分别对自杀质粒pmind和up800进行酶切、酶连和转化，获得重组质粒pmind-up800；随后利用hindiii-nhei对重组质粒以及dn800进行酶切、酶连和转化，最终获得重组质粒pmind-up800-dn800；(3)采用紫外照射步骤(2)质粒pmind-up800-dn800后，将质粒电转至野生型牛分枝杆菌atcc 1173p2菌株中，然后经过含有潮霉素hyg
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和xgal以及oadc的7h10培养基平板筛选，获得新型重组bcg菌株。3.如权利要求2所述新型重组bcg菌株的构建方法，其特征在于：所述步骤(1)的引物对包括上游同源臂引物对和下游同源臂引物对；所述上游同源臂引物对的正向引物的核苷酸序列如seq id no：3所示；反向引物的核苷酸序列如seq id no：4所示；所述下游同源臂引物对的正向引物的核苷酸序列如seq id no：5所示；反向引物的核苷酸序列如seq id no：6所示。4.如权利要求1所述新型重组bcg菌株和如权利要求2或3所述方法制备得到的新型重组bcg菌株在提高铁载体产量中的应用。5.如权利要求1所述新型重组bcg菌株和如权利要求2或3所述方法制备得到的新型重组bcg菌株在制备铁载体中的应用。6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述铁载体的制备方法为：将新型重组bcg菌株培养后进行离心分离，收集细胞沉淀，然后将沉淀用磷酸盐缓冲液洗涤，并用乙醇重悬之后取提取液与氯仿混合，滴加fecl3溶液直到观察到红色的饱和度，再加入蒸馏水混匀形成双相溶液；取有机相用水洗涤后，用无水硫酸镁干燥、离心，并将有机相进行真空冷冻干燥后获得到铁载体。

技术总结
本发明公开了一株新型重组BCG菌株及其构建方法和应用。本发明的新型重组BCG菌株是由野生型牛分枝杆菌ATCC1173P2经过基因改造获得，基因改造方法为：利用潮霉素基因hyg片段替代野生型牛分枝杆菌的esxH基因片段；其中，esxH基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；潮霉素基因hyg的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。本发明的新型重组BCG菌株与野生型牛分枝杆菌ATCC1173P2相比，新型重组BCG菌株的胞内铁载体的含量提高了12.5倍，并且纯化得到的铁载体纯度高。本发明的新型重组BCG菌株可以用于铁载体的高效生产。载体的高效生产。载体的高效生产。


技术研发人员：何正国 李肖辉 陈柳
受保护的技术使用者：广西大学
技术研发日：2023.06.29
技术公布日：2023/9/23