一种基于多西环素诱导介导型CRISPR基因敲入技术的药物筛选方法与流程

一种基于多西环素诱导介导型crispr基因敲入技术的药物筛选方法
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种基于多西环素诱导介导型crispr基因敲入技术的药物筛选方法。


背景技术：

2.药物发现计划启动来源于当疾病或临床状况出现时，现有药物没办法满足新的疾病需求，正是这种未满足的临床需求是项目的潜在驱动力。新药研发从无到有，要历经药物发现、临床前研究和临床试验“三部曲”，最后用于疾病治疗。然而在传统的医药研发中，新候选药物的发现和测试通常需要十多年的时间，与药物发现过程相关的总成本可能超过10亿美元。此外，只有少数候选药物能够真正上市，一种新药真正上市的几率只有五千分之一。新药开发的高成本和漫长的努力也使药物开发成为制药公司的一项冒险工作，从而阻碍了新药研发进度。
3.随着生物技术的不断发展，近些年crispr介导的基因编辑已成为新药研发的强大工具已然成为释放潜在药物靶标的关键，将对现代药物发现和开发产生深远影响。截至目前crispr介导的新药研发已经为包括遗传性遗传疾病和病原体感染在内的许多疾病诊疗提供了强有力的支持。通过crispr高通量特点系统性敲除大量候选基因不仅能够同时使用hts检查数百万种化合物加速新药研发，还有助于揭示新的药物靶标和疾病相关性。高通量化合物筛选方法包括生化筛选和基于细胞的筛选。生化筛选主要涉及评估化合物与目标之间的相互作用和结合亲和力，而基于细胞的筛选则利用此类相互作用的功能关系的知识。近年来，crispr改进了基于细胞的筛选，通过准确再现疾病的精确基因组编辑从而构建具有疾病特异性遗传背景的细胞系（永生细胞系、原代细胞和干细胞）和类器官实现快速、经济的模型生成，使研究人员能够对化合物进行高通量筛选进而确定最有效的治疗药物分子。该模式可以彻底改变药物设计、节省时间、降低成本并加速药物发现过程。
4.然而，crispr介导的基因编辑存在潜在的脱靶效应，会对后续的筛选和研究产生无法估量的影响，且基因编辑后的细胞代谢会发生改变等问题也制约着药物研发进度。此外，由于一些疾病是由于基因缺失造成的，而长期过量表达缺失基因会对细胞以及动物生存构成威胁，因此，设计高通量的筛选体系对于药物研发具有重要意义。
5.基于药物筛选体系的现状，本领域需要研究一种可诱导基因编辑模型表达特定靶点从而利于药物筛选的方法，不仅能够在靶细胞特异性诱导表达缺失基因，而且能够对模型的有效性进行指征，从而利于靶点药物的研发和筛选。


技术实现要素：

6.为解决上述技术问题，本发明提供的一种基于多西环素诱导介导型crispr基因敲入技术的药物筛选方法，包括以下步骤：步骤1、构建plvx-ef1a-ires-puro-rtta3质粒，所述plvx-ef1a-ires-puro-rtta3
质粒的序列如seq id no:1所示，将pspax2质粒、pmd2.g质粒和所述plvx-ef1a-ires-puro-rtta3质粒组成三质粒系统，进行慢病毒包装；步骤2、将步骤1得到的三质粒系统先与jetprime转染试剂缓冲液混匀，涡旋振荡后加入jetprime转染试剂，混匀后瞬离，静置，所得试剂作为转染试剂备用；步骤3、将293ft细胞进行预处理后加入10cm无抗培养皿中，过夜培养后，向所述无抗培养皿中加入步骤2得到的所述转染试剂，进行转染，转染完成后使用嘌呤霉素筛选293ft细胞，再使用连续梯度稀释法将嘌呤霉素筛选后的细胞铺于96孔板进行培养；步骤4、步骤3所得的细胞形成单克隆扩增后提取基因组dna进行pcr测序，检测目标基因rtta3的表达情况，得到目标基因rtta3稳定表达的单克隆细胞系；所述pcr测序使用microgem的prepgem universal基因提取试剂盒完成，每20000个细胞使用10μl 提取试剂来提取基因组dna，pcr酶采用primestar hs dna polymerase；步骤5、构建lenti-v2-gapdh-sgrna质粒和bpk1520-donor-gapdh-egfp-ikzf2质粒，所述lenti-v2-gapdh-sgrna质粒的序列如seq id no：2所示，所述bpk1520-donor-gapdh-egfp-ikzf2质粒的序列如seq id no：3所示；步骤6、使用步骤4得到的稳定表达的rtta3单克隆细胞系共转lenti-v2-gapdh-sgrna质粒和bpk1520-donor-gapdh-egfp-ikzf2质粒，共转完成后使用连续梯度稀释法将细胞铺于96孔板并培养，所述连续梯度稀释法是将细胞消化传代并稀释至密度为每10毫升中有50个细胞，之后取100μl在96孔板中铺板；待细胞形成单克隆扩增后使用pcr方法验证并筛选得到稳定表达的ikzf2 单克隆细胞系；所述pcr测序使用microgem的prepgem universal基因提取试剂盒完成，每20000个细胞使用10μl 提取试剂来提取基因组dna，pcr酶采用primestar hs dna polymerase；步骤7、在步骤6中得到的稳定表达的ikzf2单克隆细胞系中加入多西环素诱导ikzf2表达，使用靶蛋白特异性的抑制剂处理细胞，检测靶蛋白降解趋势、gfp蛋白表达情况和细胞活性，完成药物筛选。
7.具体地，步骤2中，所述三质粒系统中，所述plvx-ef1a-ires-puro-rtta3质粒的用量为10.65 μg，所述pspax2质粒的用量为8.598 μg，所述pmd2.g质粒的用量为2.591 μg。
8.具体地，步骤2中，所述jetprime转染试剂缓冲液的用量为1 ml，所述jetprime转染试剂的用量为三质粒系统中的质粒用量总和的2-3倍。
9.具体地，步骤2中，所述静置的条件为室温下静置10-15 min。
10.具体地，步骤3中，所述预处理是指用胰酶消化293ft细胞并重悬，所述293ft细胞的接种量为10
×
106。
11.具体地，步骤3中，所述转染试剂均匀打入所述无抗培养皿的底部。
12.具体地，步骤3中，转染的操作包括以下步骤：a1、先在培养箱中培养4-6h，之后更换新鲜的无抗培养基继续培养48-72h；a2、培养结束后收集上清液并置入50ml离心管内，在3000rpm条件下离心10min，分装冻存至-80℃；a3、取1ml步骤a2所得的病毒液，用无血清培养基稀释到moi为1-5并与聚凝胺混匀；
a4、取5
×
105的293ft细胞在6孔板中过夜培养，细胞密度达到70%时，将步骤a3所得的混合液加入细胞中，在37℃条件下置于co2培养箱中培养；a5、培养12-24h后，更换新鲜的无抗培养基继续培养，培养2天后，完成转染。
13.具体地，所述聚凝胺的浓度为6-8μg/ml。
14.具体地，步骤6中，所述共转的操作包括如下步骤：b1、取5
×
105步骤3获得的rtta3单克隆细胞在6孔板中过夜培养；b2、取200μl的jetprime转染试剂缓冲液，加入lenti-v2-gapdh-sgrna质粒 0.5μg与 bpk1520-donor-gapdh-egfp-ikzf2质粒 2.5μg，涡旋振荡并加入jetprime转染试剂混匀，室温静置10-15 min，所述jetprime转染试剂的用量为所用质粒用量总和的2-3倍；b3、将步骤b2得到的混合液缓慢均匀地打入步骤b1所得细胞的培养基下，晃匀并放入培养箱中培养；b4、培养4-6h后更换新鲜培养基继续培养，培养72h后完成共转。
15.具体地，所述步骤7中，所述靶蛋白特异性的抑制剂为nvp-dky709抑制剂。
16.具体地，所述步骤7中，所述多西环素诱导的操作包括如下步骤：c1、取稳定表达的ikzf2单克隆细胞，并在细胞培养基中加入100 ng/ml的多西环素诱导表达48h；c2、将诱导后的细胞用胰酶消化并重悬于含100 ng/ml的多西环素的细胞培养基中备用；c3、将步骤c2所得细胞铺板在96孔细胞培养板中，并在37℃，5% co2条件的培养箱中过夜培养；c4、将nvp-dky709抑制剂用二甲基亚砜配置成4mm的储存液，并在96孔锥形板中连续稀释nvp-dky709混合液，得到400倍nvp-dky709存储液；c5、取2μl步骤c4所得的400倍nvp-dky709存储液到u型96孔板中，加入78μl步骤c3所得的细胞混匀，得到10倍nvp-dky709母液；c6、取10μl步骤c5所得的10倍nvp-dky709母液加入到96孔细胞培养板中，设置溶媒对照组和空白对照组，再向所有孔中加入90μl步骤c3得到的细胞悬液，使所有孔中二甲基亚砜终浓度为0.25%；c7、将96孔细胞板放回培养箱中培养6 h~24h，随后用荧光显微镜检测gfp蛋白表达结果；c8、将步骤c6中培养24h的细胞培养板置于室温下，使用荧光读板仪检测荧光强度，计算靶蛋白降解趋势。
17.本发明的基于多西环素诱导介导型crispr基因敲入技术的药物筛选方法具有以下有益效果：1、本发明提供的方法，利用多西环素诱导系统与crispr基因敲入技术相结合，在基因组层面上进行编辑，通过增加多西环素诱导介导的方式，有效避免了长期引入外源基因而导致的可能发生的细胞突变等情况，增加了药物筛选体系的稳定性。
18.2、本发明提供的方法，通过引入gfp荧光蛋白检测体系，可实现对基因敲入模型的有效性实现指征，从而克服基因编辑技术潜在的脱靶效应，进一步有利于药物筛选体系的稳定性。
19.3、本发明提供的方法，通过构建bpk1520-donor-gapdh-egfp-ikzf2质粒，改造donor质粒实现了诱导敲除的目的，其中，gapdh内含子、外显子7、外显子8之间内含子部分ttctcatccaagactggctc序列的定点插入不仅不会破坏细胞原有结构还能够引入新的可编辑序列，基因编辑位于内含子区，不改变目的细胞原本的表达谱，更有利于基因敲入和表达的实现。
20.4、本发明提供的药物筛选方法，不仅能够在靶细胞特异性诱导表达缺失基因，而且能够对模型的有效性进行指征，从而利于靶点药物的筛选，进一步助力于新药的研发。
附图说明
21.图1为本发明的多西环素诱导介导型crispr基因敲入技术流程图；图2为多西环素诱导的gfp蛋白表达检测结果图；图3为多西环素诱导靶蛋白ikzf2蛋白降解实验检测结果图。
具体实施方式
22.下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
23.以下实施例中所用试剂未做特别说明的均为商品化试剂，表1为下述所有实施例中所用的试剂和耗材信息，表2为下述所有实施例中所用的仪器及型号信息。
24.表1 试剂和耗材信息试剂供应商货号多西环素sigma631311jetprime
®
polyplus101000046聚凝胺sigmatr-1003-gprepgemuniversalmicrogempun0500嘌呤霉素gibcoa1113802nano-glo
®
hibitlyticdetectionsystempromegan3040 表2 仪器仪器供应商货号离心机eppendorf5810rts2-fl相差倒置显微镜成像系统nikonts2-flenvision读板仪perkinelmer2104envision
25.实施例1如图1所示，为本发明的多西环素诱导介导型crispr基因敲入技术流程图，在293ft细胞中通过慢病毒感染稳定表达多西环素诱导表达体系相关元件，随后在构建的细胞中通过crispr cas9介导的基因编辑在gapdh内含子特殊位点通过同源重组插入靶蛋白同时引入gfp荧光蛋白，并通过多西环素（doxycycline）诱导表达目标蛋白。
26.首先，利用慢病毒表达体系构建rtta3稳定表达的细胞系用于多西环素诱导表达，具体实验操作为：
（1）将培养好的293ft细胞用胰酶消化并重悬，取10
×
10
6 的293ft细胞在10 cm 无抗培养皿中过夜培养。
27.（2）构建序列如seq id no:1所示的plvx-ef1a-ires-puro-rtta3质粒，取1 ml jetprime
®ꢀ
缓冲液 加入1.5 ml ep管，取pspax2 (8.598 μg)，pmd2.g (2.591 μg)与plvx-ef1a-ires-puro rtta3 (10.65μg)加入缓冲液涡旋振荡并加入43.678μl jetprime
®ꢀ
（dna: jetprime
®
=1：2）混匀瞬离，室温静置10-15 min。
28.（3）吸取配置好的转染试剂，倾斜培养皿，均匀缓慢的打入培养基下，轻柔晃匀，放回培养箱（避免细胞漂浮）4-6 h。
29.（4）6 h后换新鲜培养基继续培养（含有jetprime
®
混合物的细胞上清应弃入20% 的84消毒液中）。
30.（5）换液后48h或72 h后，收集病毒上清, 将48或72 h病毒液收集入50 ml离心管，3000 rpm离心10 min，分装至冻存管，1 ml/管，冻存至-80℃。
31.（6）取5
×
105的293ft细胞/孔在6孔板中过夜培养。
32.（7）将病毒用无血清培养基稀释到moi为1~5并与聚凝胺 (6-8 μg/ml)混匀。当细胞密度达到70%时准备感染，弃掉6孔板中的培养基将制备好的病毒液1ml与聚凝胺 (6-8μg/ml)混匀均匀加入细胞中，37℃，co2培养箱中过夜培养(悬浮细胞在32℃ 1000g 离心2-4h)。
33.（8）12-24h后将细胞培养上清更换新鲜无抗培养基继续培养（含有病毒的细胞上清弃入20% 的84消毒液中）；如果开始感染时病毒moi较低换液前可再次感染。
34.（9）换液两天后更换含有1μg/μl嘌呤霉素的新鲜培养基筛选rtta3稳定表达的细胞。
35.（10）将rtta3稳定表达的细胞消化传代并将细胞稀释到密度为每10毫升中有50个细胞，取100μl在96孔板中铺板并采用连续梯度稀释法挑选rtta3单克隆细胞系。
36.（11）将形成单克隆且扩增的细胞进行细胞基因组dna提取，采用microgem的prepgem universal基因提取试剂盒提基因组dna，每20000个细胞使用10μl 提取试剂来提取基因组dna，pcr扩增检测目标基因rtta3的表达情况 pcr酶采用primestar hs dna polymerase，随后将pcr进行dna胶回收并测序，测序引物如表3所示：表3 pcr引物序列（如序列表seq no:4~seq no:16)名称序列长度bpk-mcs-r1cgcaccggtgaattcggt18-meregfp-c-fcatggtcctgctggagttcgtg22-meregfp-c_racagctcgtccatgccga18-meregfp-ncgtcgccgtccagctcgaccag22-meregfp-n_faagggcgaggagctgttca19-merexfp-rgtcttgtagttgccgtcgtc20-mergla-f1tatcgtggaaggactcatggta22-mergra-rcagtgatggcatggactgt19-merhibit-revgctaatcttcttgaacagccgcca24-merhygro-fcagacgtcgcggtgagtt18-mer
ikzf2-fggaaacagaggctattgatggct23-merrtta3-fatgtctaggctggacaagagca22-merrtta3-rgggagcatgtcaaggtcaaaat22-mer其次，构建序列如seq id no：2所示的lenti-v2-gapdh-sgrna质粒，用于识别并编辑gapdh基因组dna，再构建序列如seq id no：3所示的bpk1520-donor-gapdh-egfp-ikzf2质粒，bpk1520-donor-gapdh-egfp-ikzf2质粒基于gapdh同源臂，用于表达目的基因ikzf2与gfp，构建完成后，使用筛选得到的rtta3单克隆细胞系共转lenti-v2-gapdh-sgrna质粒与bpk1520-donor-gapdh-egfp-ikzf2质粒，构建ikzf2 ki细胞系，具体实验步骤如下：（1）取5
×
105步骤3获得的rtta3单克隆细胞在6孔板中过夜培养。
37.（2）取200μl的jetprime转染试剂缓冲液，加入lenti-v2-gapdh-sgrna质粒 0.5μg与 bpk1520-donor-gapdh-egfp-ikzf2质粒 2μg，涡旋振荡并加入jetprime转染试剂混匀，室温静置10-15 min，所述jetprime转染试剂的用量为所用质粒用量总和的2-3倍。
38.（3）将步骤（2）得到的混合液缓慢均匀地打入步骤1所得细胞的培养基下，晃匀并放入培养箱中培养。
39.（4）转染4-6h后更换新鲜培养基继续培养，72h后将细胞消化传代并将细胞稀释到密度为每10毫升中有50个细胞，取100μl在96孔板中铺板。
40.（5）完成共转后，采用microgem的prepgem universal基因提取试剂盒，每20000个细胞使用10μl 提取试剂来提取基因组dna，pcr酶采用primestar hs dna polymerase，随后将pcr进行dna胶回收并测序，测序引物如上表3所示。
41.（6）根据pcr检测结果，将敲入成功的细胞采用连续稀释的方式在96孔板铺板并分选得到ikzf2 ki细胞系。
42.（7）待细胞形成单克隆后，采用microgem的prepgem universal基因提取试剂盒，每20000个细胞使用10μl 提取试剂来提取基因组dna，pcr酶采用primestar hs dna polymerase，随后将pcr进行dna胶回收并测序，测序引物如上表3所示。
43.最后，选择筛选得到的ikzf2 ki细胞系进行多西环素诱导表达目标靶点ikzf2基因与gfp，使用nvp-dky709抑制剂处理细胞，具体实验步骤如下：（1）取敲入成功的ikzf2细胞并在细胞培养基中加入100 ng/ml多西霉素诱导表达48h。
44.（2）将诱导后的细胞用胰酶消化调整浓度到每毫升1
×
105个细胞，并重悬于含100 ng/ml 多西霉素的细胞培养基中备用。
45.（3）取96孔细胞培养板，a1-a12、b12、c12和d1-d12中加入磷酸盐缓冲液，在b2-b11和c2-c11的每孔加入90 μl悬液，接种密度为每孔9000个细胞，在b1和c1中只加入细胞培养基作为空白对照组，b11和c11作为溶媒对照组，将96孔细胞培养板在37℃，5% co2培养箱中过夜培养。
46.（4）将nvp-dky709抑制剂用二甲基亚砜配制成4mm的储存液，并将储存液稀释为10x nvp-dky709母液，稀释步骤为：首先，在96孔锥形板第一排b3-b10孔中分别加入6μl 二甲基亚砜，在b2中加入10μl 的4mm nvp-dky709的储存液；其次，从b2孔中取3μl nvp-dky709储存液加入到b3混匀，再从b3取3μl加入b4混
匀，依次连续稀释直到b10；最后，取u型96孔板并在u型96孔板的b2-b11孔中分别加入78μl细胞培养基，用12连排排枪取上一步中96孔锥形板的b2-b10孔内的稀释液2μl加入到u型96孔板的b2-b10中并混匀，稀释成10x nvp-dky709母液，10x nvp-dky709母液的浓度为1.4 nm。
47.（5）向步骤（3）的96孔细胞培养板的b2-b10、c2-c10中每孔加入10 μl 10x nvp-dky709母液，并在空白对照组（b1和c1）和溶媒对照组（b11和c11）中加入二甲基亚砜，使所有孔中二甲基亚砜终浓度为0.25%。
48.（6）将处理完成的96孔细胞板放回培养箱中培养24h，随后用荧光显微镜检测24h后细胞中gfp蛋白表达与细胞活率，如图2所示，其中上方左侧图代表未经多西环素诱导的结果，gfp蛋白表达率极低，上方右侧代表经多西环素诱导的结果，gfp蛋白表达率高；下方图片显示为明场下的细胞形态与活率，均呈现良好状态。
49.（7）靶蛋白降解趋势测试：将培养24h后的细胞培养板置于室温，平衡后加入100 μl nano-glo
®ꢀ
hibit lytic detection system检测试剂 (将lgbit protein 1:100稀释，nano-glo
®ꢀ
hibit lytic substrate 1:50 稀释到nano-glo
®
hibit lytic 缓冲液配制成检测试剂),在摇床上300
–
600rpm摇匀3
–
10 min随后静置10min用2104 envision检测荧光强度，并进行数据处理，从而确定nvp-dky709抑制剂处理后靶蛋白降解（tpd）趋势。蛋白降解比例（degradation rate %）=（溶媒对照组-实验组）/（溶媒对照组-空白对照组）
×
100%。
50.处理数据后的靶蛋白降解趋势结果如图3所示，横坐标为nvp-dky709的浓度，纵坐标为蛋白降解比例，可以看出，在多西环素诱导表达48h的情况下，用ikzf2靶蛋白降解剂nvp-dky709处理细胞24h后通过nano-glo
®ꢀ
hibit lytic detection system检测细胞中靶蛋白在不同处理浓度下的蛋白水平，蛋白降解比例得以直观体现，可证明本发明提供的方法可用于药物筛选。
51.综上所述，上述各实施例仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，皆应包含在本发明的保护范围内。

技术特征：
1.一种基于多西环素诱导介导型crispr基因敲入技术的药物筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1、构建plvx-ef1a-ires-puro-rtta3质粒，所述plvx-ef1a-ires-puro-rtta3质粒的序列如seq id no:1所示，将pspax2质粒、pmd2.g质粒和所述plvx-ef1a-ires-puro-rtta3质粒组成三质粒系统，进行慢病毒包装；步骤2、将步骤1得到的三质粒系统先与jetprime转染试剂缓冲液混匀，涡旋振荡后加入jetprime转染试剂，混匀后瞬离，静置，所得试剂作为转染试剂备用；步骤3、将293ft细胞进行预处理后加入10cm无抗培养皿中，过夜培养后，向所述无抗培养皿中加入步骤2得到的所述转染试剂，进行转染，转染完成后使用嘌呤霉素筛选293ft细胞，再使用连续梯度稀释法将嘌呤霉素筛选后的细胞铺于96孔板进行培养；步骤4、步骤3所得的细胞形成单克隆扩增后提取基因组dna进行pcr测序，检测目标基因rtta3的表达情况，得到目标基因rtta3稳定表达的单克隆细胞系；步骤5、构建lenti-v2-gapdh-sgrna质粒和bpk1520-donor-gapdh-egfp-ikzf2质粒，所述lenti-v2-gapdh-sgrna质粒的序列如seq id no：2所示，所述bpk1520-donor-gapdh-egfp-ikzf2质粒的序列如seq id no：3所示；步骤6、使用步骤4得到的稳定表达的rtta3单克隆细胞系共转lenti-v2-gapdh-sgrna质粒和bpk1520-donor-gapdh-egfp-ikzf2质粒，共转完成后使用连续梯度稀释法将细胞铺于96孔板并培养，待细胞形成单克隆扩增后使用pcr方法验证并筛选得到稳定表达的ikzf2 单克隆细胞系；步骤7、在步骤6中得到的稳定表达的ikzf2单克隆细胞系中加入多西环素诱导ikzf2表达，使用靶蛋白特异性的抑制剂处理细胞，检测靶蛋白降解趋势、gfp蛋白表达情况和细胞活性，完成药物筛选。2. 根据权利要求1所述基于多西环素诱导介导型crispr基因敲入技术的药物筛选方法，其特征在于，步骤2中，所述三质粒系统中，所述plvx-ef1a-ires-puro-rtta3质粒的用量为10.65 μg，所述pspax2质粒的用量为8.598 μg，所述pmd2.g质粒的用量为2.591 μg。3. 根据权利要求1所述的基于多西环素诱导介导型crispr基因敲入技术的药物筛选方法，其特征在于，步骤2中，所述jetprime转染试剂缓冲液的用量为1 ml，所述jetprime转染试剂的用量为三质粒系统中的质粒用量总和的2-3倍。4. 根据权利要求1所述的基于多西环素诱导介导型crispr基因敲入技术的药物筛选方法，其特征在于，步骤2中，所述静置的条件为室温下静置10-15 min。5.根据权利要求1所述的基于多西环素诱导介导型crispr基因敲入技术的药物筛选方法，其特征在于，步骤3中，所述预处理是指用胰酶消化293ft细胞并重悬，所述293ft细胞的接种量为10
×
106。6.根据权利要求1所述的基于多西环素诱导介导型crispr基因敲入技术的药物筛选方法，其特征在于，步骤3中，所述转染试剂均匀打入所述无抗培养皿的底部。7.根据权利要求1所述的基于多西环素诱导介导型crispr基因敲入技术的药物筛选方法，其特征在于，步骤3中，转染的操作包括以下步骤：a1、先在培养箱中培养4-6h，之后更换新鲜的无抗培养基继续培养48-72h；a2、培养结束后收集上清液并置入50ml离心管内，在3000rpm条件下离心10min，分装冻
存至-80℃；a3、取1ml步骤a2所得的病毒液，用无血清培养基稀释到moi为1-5并与聚凝胺混匀；a4、取5
×
105的293ft细胞在6孔板中过夜培养，细胞密度达到70%时，将步骤a3所得的混合液加入细胞中，在37℃条件下置于co2培养箱中培养；a5、培养12-24h后，更换新鲜的无抗培养基继续培养，培养2天后，完成转染。8.根据权利要求7所述的基于多西环素诱导介导型crispr基因敲入技术的药物筛选方法，其特征在于，所述聚凝胺的浓度为6-8μg/ml。9.根据权利要求1所述的基于多西环素诱导介导型crispr基因敲入技术的药物筛选方法，其特征在于，步骤6中，所述共转的操作包括如下步骤：b1、取5
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105步骤3获得的rtta3单克隆细胞在6孔板中过夜培养；b2、取200μl的jetprime转染试剂缓冲液，加入lenti-v2-gapdh-sgrna质粒 0.5μg与 bpk1520-donor-gapdh-egfp-ikzf2质粒 2.5μg，涡旋振荡并加入jetprime转染试剂混匀，室温静置10-15 min，所述jetprime转染试剂的用量为所用质粒用量总和的2-3倍；b3、将步骤b2得到的混合液缓慢均匀地打入步骤b1所得细胞的培养基下，晃匀并放入培养箱中培养；b4、培养4-6h后更换新鲜培养基继续培养，培养72h后完成共转。10.根据权利要求1所述的基于多西环素诱导介导型crispr基因敲入技术的药物筛选方法，其特征在于，所述步骤7中，所述靶蛋白特异性的抑制剂为nvp-dky709抑制剂。11.根据权利要求10所述的基于多西环素诱导介导型crispr基因敲入技术的药物筛选方法，其特征在于，所述步骤7中，所述多西环素诱导的操作包括如下步骤：c1、取稳定表达的ikzf2单克隆细胞，并在细胞培养基中加入100 ng/ml的多西环素诱导表达48h；c2、将诱导后的细胞用胰酶消化并重悬于含100 ng/ml的多西环素的细胞培养基中备用；c3、将步骤c2所得细胞铺板在96孔细胞培养板中，并在37℃，5% co2条件的培养箱中过夜培养；c4、将nvp-dky709抑制剂用二甲基亚砜配置成4mm的储存液，并在96孔锥形板中连续稀释nvp-dky709混合液，得到400倍nvp-dky709存储液；c5、取2μl步骤c4所得的400倍nvp-dky709存储液到u型96孔板中，加入78μl步骤c3所得的细胞混匀，得到10倍nvp-dky709母液；c6、取10μl步骤c5所得的10倍nvp-dky709母液加入到96孔细胞培养板中，设置溶媒对照组和空白对照组，再向所有孔中加入90μl步骤c3得到的细胞悬液，使所有孔中二甲基亚砜终浓度为0.25%；c7、将96孔细胞板放回培养箱中培养6 h~24h，随后用荧光显微镜检测gfp蛋白表达结果；c8、将步骤c6中培养24h的细胞培养板置于室温下，使用荧光读板仪检测荧光强度，计算靶蛋白降解趋势。

技术总结
本发明公开一种基于多西环素诱导介导型CRISPR基因敲入技术的药物筛选方法，构建了多西环素诱导介导的CRISPR基因敲入细胞模型，在基因组层面上进行编辑，通过增加多西环素诱导介导的方式，有效避免了长期引入外源基因而导致的可能发生的细胞突变等情况，增加了药物筛选体系的稳定性；还通过引入GFP荧光蛋白检测体系，实现了对基因敲入模型的有效性实现指征，从而克服基因编辑技术潜在的脱靶效应，利于靶点药物的筛选，进一步助力于新药的研发。进一步助力于新药的研发。进一步助力于新药的研发。


技术研发人员：王瑞峰 项键 徐能蔚 甘雨苗 谷庆阳
受保护的技术使用者：苏州药明康德新药开发有限公司
技术研发日：2023.08.24
技术公布日：2023/9/23