包括人类在内的生物体细胞中的转录产物、转染RNA及其纯化复合物的工具的制作方法

包括人类在内的生物体细胞中的转录产物、转染rna及其纯化复合物的工具
技术领域
1.本发明涉及crispr-dcas/cas蛋白衍生物或crispr-dcas/cas蛋白衍生物集、多核苷酸或多核苷酸的互补链、媒介、转化体、载体、纯化靶rna方法、细胞内环境分析方法、新型冠状病毒的预防剂或治疗剂、以及用于基于mrna异常剪接的疾病的治疗剂。


背景技术：

2.大约340,000个人类rna被认为存在于体内，其中大约300个已经被研究，大约99％的人类rna的功能尚未阐明。另一方面，人类蛋白的数量约为21,000种，其中约70％已被研究。
3.人类rna功能的阐明被延迟的原因是，rna是在每个细胞中瞬时表达的基因，并且在任何条件下都难以纯化具有特定核苷酸序列的rna，因为抗体识别和用例如生物素标记是困难的。


技术实现要素：

4.技术问题
5.本发明的一个目的在于提供一种能够评价rna分子的功能的靶向技术。
6.本发明的另一个目的在于可视化具有特定核苷酸序列的rna的细胞内行为。
7.本发明的另一个目的在于提供一种用于新型冠状病毒的预防剂或治疗剂或一种用于基于mrna异常剪接的疾病的治疗剂。
8.解决方法
9.本发明提供了crispr-dcas/cas蛋白衍生物或crispr-dcas/cas蛋白衍生物集、多核苷酸或多核苷酸的互补链、媒介、转化体、载体、纯化靶rna方法、细胞内环境分析方法、新型冠状病毒的预防剂或治疗剂、以及用于基于mrna异常剪接的疾病的治疗剂，其如下所列。
10.项1.一种衍生自crispr-dcas(死cas)蛋白或crispr-cas蛋白的crispr-dcas/cas蛋白衍生物或crispr-dcas/cas蛋白衍生物集，
11.所述crispr-dcas(死cas)蛋白具有螺旋区，能够与向导rna和靶rna形成复合物，并且不具有核酸酶活性，以及
12.所述crispr-cas蛋白具有螺旋区，能够与向导rna和靶rna形成复合物，并且具有核酸酶活性，
13.所述crispr-dcas/cas蛋白衍生物或crispr-dcas/cas蛋白衍生物集包括：
14.n结构域，所述n结构域包含crispr-dcas(死cas)蛋白或crispr-cas蛋白的螺旋区的n端侧，
15.c结构域，所述c结构域包含crispr-dcas(死cas)蛋白或crispr-cas蛋白的螺旋区的c端侧，以及
16.第一因子和第二因子，所述第一因子和所述第二因子能够响应刺激而结合，所述n
结构域与所述第一因子连接，以及所述c结构域与所述第二因子连接，
17.具有所述第一因子和所述第二因子的crispr-dcas/cas蛋白衍生物通过含有蛋白酶识别序列的连接子结合，或通过含有自裂解肽的连接子结合，或是非共价结合，
18.所述crispr-dcas/cas蛋白衍生物因此具有：
19.(n结构域)-(第一因子)-(含有蛋白酶识别序列的连接子)-(第二因子)-(c结构域)的结构，或
20.(n结构域)-(第一因子)-(含有自裂解肽的连接子)-(第二因子)-(c结构域)的结构，或
21.(n结构域)-(第一因子)-(非共价键)-(第二因子)-(c结构域)的结构，以及
22.所述crispr-dcas/cas蛋白衍生物集包括(n结构域)-(第一因子)和(第二因子)-(c结构域)两部分。
23.项2.根据项1所述的crispr-dcas/cas蛋白衍生物或crispr-dcas/cas蛋白衍生物集，其中，所述n结构域包含所述螺旋区的n端侧上的一部分氨基酸序列，以及所述c结构域包含所述螺旋区的c端侧上的一部分氨基酸序列。
24.项3.根据项1所述的crispr-dcas/cas蛋白衍生物或crispr-dcas/cas蛋白衍生物集，其中，
25.所述n结构域包含位于源自瓦氏纤毛菌(leptotrichia wadei)的cas13a(序列id:wp_21746774.1)的螺旋区的n端侧的一部分氨基酸序列中的164个氨基酸，以及
26.所述c结构域包含位于源自瓦氏纤毛菌(leptotrichia wadei)的cas13a(序列id:wp_21746774.1)的螺旋区的c端侧的一部分氨基酸序列中的1003个氨基酸。
27.项4.根据项1至3中任一项所述的crispr-dcas/cas蛋白衍生物或crispr-dcas/cas蛋白衍生物集，其中，所述第一因子含有nmag或pmag，以及所述第二因子含有pmag或nmag。
28.项5.一种编码项1至4中任一项所述的crispr-dcas/cas蛋白衍生物或crispr-dcas/cas蛋白衍生物集的多核苷酸，或其互补链。
29.项6.一种或两种媒介，包含一个或两个项5所述的多核苷酸或其互补链。
30.项7.根据项6所述的一种或两种媒介，其中，各个媒介是腺病毒媒介、腺相关病毒媒介、或质粒媒介。
31.项8.根据项7所述的一种或两种媒介，其中，所述媒介为两种媒介，一种媒介具有(n结构域)-(第一因子)的结构，以及另一种媒介具有(第二因子)-(c结构域)的结构。
32.项9.根据项6至8中任一项所述的一种或两种媒介，进一步包含编码对应于所述靶rna的向导rna的多核苷酸。
33.项10.一种由项6至9中任一项所述的一种或两种媒介转化的转化体。
34.项11.根据项1至4中任一项所述的crispr-dcas/cas蛋白衍生物或crispr-dcas/cas蛋白衍生物集、根据项5所述的多核苷酸或其互补链、根据项6至9中任一项所述的一种或两种媒介、或根据项10所述的转化体，其中，所述靶rna是一组与生物功能和疾病都相关的长非编码rna(lncrna)和/或非编码rna(ncrna)。
35.项12.根据项10或11所述的转化体，其中，所述转化体是转化的哺乳动物细胞或转化的非人类哺乳动物。
36.项13.根据项1至4中任一项所述的crispr-dcas/cas蛋白衍生物或crispr-dcas/cas蛋白衍生物集、根据项5所述的多核苷酸或其互补链、根据项6至9中任一项所述的一种或两种媒介、或根据项10至12中任一项所述的转化体，其中，所述靶rna是源自rna病毒的rna，新型冠状病毒rna、源自合成基因的rna、lncrna、能被向导rna靶向的30nt以上的ncrna、或前体rna。
37.项14.一种用于纯化靶rna的载体，包括：
38.固体载体，以及
39.crispr-dcas(死cas)蛋白，所述crispr-dcas(死cas)蛋白能够与向导rna和靶rna形成复合物并且不具有核酸酶活性，所述crispr-dcas(死cas)蛋白被支持在所述固体载体上。
40.项15.一种纯化靶rna的方法，包括：
41.允许向导rna和靶rna作用于项14所述的载体上，以在所述载体上形成包含所述靶rna、所述向导rna和所述crispr-dcas蛋白的复合物；以及
42.从所述复合物中洗脱靶rna和靶rna结合因子，所述靶rna结合因子选自由基因组dna、蛋白、和除靶rna以外的rna组成的组中。
43.项16.一种用于分析细胞内环境的方法，包括：
44.将多个向导rna引入或表达到项10所述的转化体中；
45.裂解所述转化体以用rna捕获颗粒来捕获靶rna；以及
46.分析与所述rna捕获颗粒结合的靶rna。
47.项17.根据项16所述的分析方法，其中，所述转化体是ips细胞。
48.项18.根据项16或17所述的分析方法，包括提取由靶rna、向导rna和光活化dcas蛋白的复合物的形成而产生的细胞的表型。
49.项19.一种用于新型冠状病毒的预防剂或治疗剂，包含作为活性成分的脂质代谢调节剂。
50.项20.根据项19所述的用于新型冠状病毒的预防剂或治疗剂，其中，所述脂质代谢调节剂具有hmg-coa还原酶抑制作用或乙酰coa还原酶抑制作用。
51.项21.根据项19或20所述的用于新型冠状病毒的预防剂或治疗剂，其中，所述脂质代谢调节剂为阿托伐他汀或瑞舒伐他汀。
52.项22.一种用于基于mrna、rrna(核糖体rna)和lncrna的异常剪接的疾病的治疗剂，包含作为活性成分的项6至9中任一项所述的一种或两种媒介。
53.项23.根据项1所述的crispr-dcas/cas蛋白衍生物或crispr-dcas/cas蛋白衍生物集，其中，所述crispr-dcas/cas蛋白是具有核酸酶活性的cas13蛋白。
54.有益效果
55.根据本发明，可以容易地纯化具有所需核苷酸序列的长非编码rna(lncrna)。
56.根据本发明，基于分裂位置将cas13蛋白分裂为肽也可以应用于具有核糖核酸酶活性的cas13(cas13)，并且可以用作活化的cas13。
57.根据本发明的分裂cas13/dcas13可用于除了上述应用之外的已知cas13/dcas13应用。
58.根据本发明，可以纯化或捕获细胞中的靶rna，并且可以分析细胞内环境。
59.可以通过使用标记的刺激活化的dcas13来可视化具有所需核苷酸序列的lncrna的细胞内行为。
60.此外，本发明可以为主要由异常剪接引起的疾病提供治疗剂。
61.此外，本发明可以为rna病毒、特别是新型冠状病毒感染提供预防剂或治疗剂。
附图说明
62.图1示出了rna复合物纯化技术：反式rna免疫沉淀(trip)。
63.图2示出了rna功能的修饰分析的应用：精确rna序列修饰(prsm)。
64.图3示出了光活化cas13(padcas13)系统的构建。
65.图4示出了光活化cas13(padcas13)系统的构建。
66.图5示出了光活化cas13(padcas13)系统的构建。
67.图6示出了具有高选择性的靶lncrna。
68.图7示出了靶向人类xist rna的rna可视化的示例。通过使用gfp标记的dcas13能够在活细胞中确认xist rna的亚细胞定位。
69.图8示出了实现trip方法的模型图。
70.图9是用于sars-cov-2的未翻译区的trip方法的概述。
71.图10示出了来自pgl3-sars-cov-2.orf1-启动子的转录物。
72.图11示出了chip(染色质免疫沉淀)方案。
73.图12示出了靶向sars-cov-2的trip分析方法的性能评估1。
74.图13示出了靶向sars-cov-2的trip分析方法的性能评估2。
75.图14示出了衍生自sars-cov-2的rna在人类细胞中结合的rna的种类；本体富集分析。
76.图15示出了靶向sars-cov-2的trip分析方法的性能评估3。
77.图16示出了靶向sars-cov-2的trip分析方法的性能评估4。
78.图17是示出s565的氢键参与阿托伐他汀和瑞舒伐他汀与hmg-coa的结合的数据。
79.图18示出了靶向sars-cov-2的trip分析方法的性能评估5。
80.图19示出了trip方法中使用的dna免疫沉淀的概述。
81.图20a示出了光敏开关系统的演示测试。
82.图20b示出了pa-dcas13蛋白的性能评估测试。对每个细胞部分进行蛋白印迹(western blotting)以确认以下内容：
83.(a)具有靶向lncrna xist的向导rna的dcas13蛋白在核部分中表达；以及
84.(b)将dcas13转移到由向导rna(细胞核)靶向的rna的位点。
85.图21是验证xist rna的结合区是否与组蛋白密码相关的示例的概述。
86.图22a示出了chip-seq分析的应用。图22a中左侧的图示出了xist rna的dna上的结合区在基因的转录起始区周围是否具有规律性。左起第二列示出了用于xist的trip方法的检测结果。左起第一列示出了不含crrna的阴性检测。左起第三列、第四列和第五列是组蛋白修饰的综合图。右侧的图是来自左侧的图中的转录起始区的堆积区的图。顶部的图示出了用于xist的trip方法的检测结果，该结果从顶部开始在第三张图中示出了类似于h3k4me3的堆积模式，因此表明xist是转录调节子。
87.图22b示出了在转录起始位点(tss)累积的靶rna(xist)的性质。将由向导rna限定的靶点设置为长非编码rna xist，并进行染色质免疫沉淀并与现有技术进行比较。本发明的技术能够用一个或两个向导rna进行高分辨率检测。立即开启/关闭的能力和在rna分子内进行比较的能力是现有技术以及原始dcas13蛋白难以实现的创新性能。x轴：距转录起始位点的距离(右端：5000bp；左端：-5000bp)；y轴：转录起始区的累积的平均值。
88.图23示出了rna结构分析数据，该数据用作设计xirt crrna、结构预测图和以及与xist序列结合的一组蛋白的预测的参考。
89.图24示出了由dcas13控制xist rna功能的验证测试。已经证实，在用对应于图23的上部图中crrna号的crrna转染的细胞中，将dcas13引入xist rna的特定序列中是否抑制h3(组蛋白h3)通过xist rna诱导进入基因组。结果表明，在用crrnas 1、2、3和5转染的细胞中，h3与基因组区的结合被抑制，并且当crrnas 1、2、3和5被靶向时，xist的功能被抑制。
90.图25示出了使用光活化的cas13(padcas13)系统的应用；使用sc序列的rna表型分析。
91.图26示出了前体rna水平的杜氏肌营养不良致病因子肌营养不良蛋白基因突变修复；杜氏肌营养不良症外显子跳跃治疗剂的开发。
92.图27a示出了plko5.u6.crrna(基因名称).trfp.v1。
93.图27b示出了plko5.u6.crrna(基因名称).trfp.v1。
94.图28a示出了pentr1a.dcas13a.gfp。
95.图28b示出了pentr1a.dcas13a.gfp。
96.图28c示出了pentr1a.dcas13a.gfp。
97.图28d示出了pentr1a.dcas13a.gfp。
98.图29a示出了pgl3-sars-cov-2.orf1-启动子。
99.图29b示出了pgl3-sars-cov-2.orf1-启动子。
100.图29c示出了pgl3-sars-cov-2.orf1-启动子。
101.图30示出了经证实通过衍生自病毒的5’utr抑制翻译的esirna cdna靶序列。
102.图31示出了pd-1阳性t细胞/nk细胞的pd-1前体mrna。
103.图32示出了靶向pd-1前体mrna的内含子1和2的向导rna。
104.图33示出了使用dcas13制备pd-1失活的淋巴细胞。通过使用综合rna靶向分析，成功地产生了pd-1表达调控的t细胞。体外药物的开发可以通过使用图33中右侧的图中所示的区域a中的细胞中包含的向导rna序列和dcas13蛋白来进行：可以提供比car-t细胞治疗(kymriah)更安全的细胞治疗药物。
105.图34示出在与衍生自sars-cov-2的5’utr rna基因信息融合的荧光素酶rna中观察到翻译活性增加。
具体实施方式
106.本发明中用于分离和纯化、功能阐明和疾病预防或治疗的靶rna的示例包括lncrna、衍生自rna病毒的rna、包括新型冠状病毒rna、以及具有异常剪接的rna。
107.在本发明中，具有螺旋区、能够与向导rna和靶rna形成复合物、并且不具有核酸酶活性的crispr-dcas蛋白的示例，或具有螺旋区、能够与向导rna和靶rna形成复合物、并具
有核酸酶活性的crispr-cas蛋白的示例更受青睐，核酸酶活性包括cas5/dcas5、cas6/dcas6、cas7/dcas7、cas9/dcas9、cas10/dcas10、cas11/dcas11和cas13/dcas13、其中优选cas13/dcas13。
108.crispr-dcas蛋白和crispr-cas蛋白具有螺旋区，在螺旋区的任何位置裂解，并分为裂解点的n端侧的n结构域和裂解点的c端侧的c结构域，以形成以下两种多肽：(n结构域)-(第一因子)的多肽，其中n结构域与第一因子结合，(第二因子)-(c结构域)的多肽，其中c结构域和第二因子结合。通过经由包含蛋白酶识别序列的连接子或包含自裂解肽的连接子结合这些多肽，可以形成由(n结构域)-(第一因子)-(包含蛋白酶识别序列的连接子)-(第二因子)-(c结构域)或(n结构域)-(第一因子)-(包含自裂解肽的连接子)-(第二因子)-(c结构域)表示的一个蛋白(crispr-dcas/cas蛋白)。可选地，包含(n结构域)-(第一因子)的多肽和包含(第二因子)-(c结构域)的多肽可以用作一组(crispr-dcas/cas蛋白衍生物集)。该集是“包含两部分的crispr-dcas/cas蛋白衍生物集。由(n结构域)-(第一因子)-(包含蛋白酶识别序列的连接子)-(第二因子)-(c结构域)表示的一个蛋白或由(n结构域)-(第一因子)-(包含自裂解肽的连接子)-(第二因子)-(c结构域)表示的一个蛋白用蛋白酶识别序列或自裂解肽裂解以形成一组多肽，一个肽包含(n结构域)-(第一因子)，另一多肽包含(第二因子)-(c结构域)。当第一因子和第二因子通过刺激结合时，形成一个由(n结构域)-(第一因子)-(非共价键)-(第二因子)-(c结构域)表示的复合物。在本说明书中，这种复合物和由(n结构域)-(第一因子)-(包含蛋白酶识别序列的连接子)-(第二因子)-(c结构域)或由(n结构域)-(第一因子)-(包含自裂解肽的连接子)-(第二因子)-(c结构域)表示的蛋白有时统称为“crispr-dcas/cas蛋白衍生物”。当复合物中的非共价键在没有刺激的情况下断裂时，复合物分裂成一组多肽，一个肽包含(n结构域)-(第一因子)，另一多肽包含(第二因子)-(c结构域)。在存在或不存在刺激的情况下，第一因子和第二因子之间的非共价键的形成和断裂可逆地发生。促进第一因子和第二因子结合的刺激包括物理刺激的示例，例如光(例如，白光和蓝光)、热(高温、低温)、ph(酸性、中性、碱性)和压力；配体和受体的组合；以及化学物质。当刺激是光时，第一因子或第二因子可以是nmag，而另一个可以是pmag。“非共价结合”包括第一因子和第二因子的结合。例如，当第一因子和第二因子是nmag和pmag时，“非共价键”包括nmag和pmag的结合。
109.蛋白酶识别序列可以被细胞内蛋白酶裂解。可以将能够裂解蛋白酶识别序列的蛋白酶与crispr-dcas/cas蛋白一起引入细胞中。连接子的长度可由本领域技术人员适当选择，但优选为包含3至100个氨基酸和更优选为5至60个氨基酸的肽。作为蛋白酶识别序列，可以使用本领域已知的各种蛋白酶识别序列(j.clin.biol.chem.,vol.283,no.30,p.20897,2008)。优选地，蛋白酶识别序列是引入crispr-dcas/cas蛋白衍生物或crispr-dcas/cas蛋白衍生物集的细胞中的细胞内蛋白酶识别序列。细胞内蛋白酶识别序列的实例包括由细胞内蛋白酶弗林(furin)、pc7和pace4识别的氨基酸序列。连接子可以是由蛋白酶识别序列组成的肽，或可以进一步包含蛋白酶识别序列的n端侧和/或c端侧的氨基酸序列。自裂解肽的示例包括文献中所述的那些(szymczak-workman,andrea l et al.,“design and construction of 2a peptide-linked multicistronic vectors.”cold spring harbor protocols,vol.2012,2 199-204.1feb.2012,doi:10.1101/pdb.ip 067876.)，其全部内容通过引用并入本文。自裂解肽的实例包括但不限于t2a、p2a、e2a和f2a。
110.n结构域和c结构域可以在螺旋区中具有或不具有氨基酸的一部分，可以在螺旋区中具有修饰的氨基酸序列，可以包括添加或插入到原始氨基酸序列的新氨基酸序列，或者可以包括衍生自蛋白酶识别序列或自裂解肽或连接子的氨基酸序列。
111.本发明包括编码crispr-dcas/cas蛋白衍生物或crispr-dcas/cas蛋白衍生物集的多核苷酸，或该多核苷酸的互补链。这样的多核苷酸的示例包括：
112.(i)多核苷酸，该多核苷酸编码(n结构域)-(第一因子)-(包含蛋白酶识别序列的连接子)-(第二因子)-(c结构域)或(n结构区)-(第一因子)-(包含自裂解肽的连接子)-(第二因子)-(c结构域)；
113.(ii)一种多核苷酸，该多核苷酸通过适当的间隔核苷酸序列将编码包含(n结构域)-(第一因子)的多肽的多核苷酸与编码包含(第二因子)-(c结构域)的肽的多核苷酸连接而形成；以及
114.(iii)两种多核苷酸的集合，一种多核苷酸编码包含(n结构域)-(第一因子)的多肽，另一多核酸编码包含(第二因子)-(c结构域)的多肽。
115.本发明的媒介包括上述(i)至(iii)中的任一种。在(i)和(ii)的情况下，媒介是一个媒介。在(iii)的情况下，媒介是两个媒介的集合。
116.媒介可以是质粒媒介或病毒媒介。病毒媒介的示例包括腺相关病毒媒介、腺病毒媒介、逆转录病毒媒介和慢病毒媒介。质粒媒介的示例包括用于gateway系统的入口媒介(例如pentr)、用于基因重组的供体媒介和用于平行转移的目的媒介。
117.除了编码crispr-dcas/cas蛋白衍生物或crispr-dcas/cas蛋白衍生物集的多核苷酸或多核苷酸的互补链之外，媒介还可以编码至少一种向导rna。
118.本发明的转化体是通过用本发明的媒介转化宿主细胞而产生的。宿主的示例包括哺乳动物，例如人类、小鼠、大鼠、兔子、豚鼠、仓鼠、山羊、狗和猴子。当宿主细胞是es细胞或非人类哺乳动物的受精卵时，可以从转化的细胞产生非人类哺乳动物。本发明的转化体包括非人类哺乳动物。
119.本发明的用于纯化靶rna的载体包括固体载体，在该固体载体上能够与向导rna和靶rna形成复合物并且不具有核酸酶活性的多种crispr-dcas(死cas)蛋白被支持在固体载体上。不具有核酸酶活性的crispr-dcas(死cas)蛋白的示例包括dcas5、dcas6、dcas7、dcas9、dcas10、dcas11和dcas13，其中优选包括dcas13。
120.用于支持crispr-dcas蛋白的固体载体的示例包括已知载体，例如硅藻土、活性炭、氧化铝、氧化钛、交联淀粉颗粒、纤维素基聚合物、甲壳素和壳聚糖衍生物。
121.用于将crispr-dcas蛋白固定在固体载体上的方法的示例包括已知的用于固定蛋白的方法，例如物理吸附法、离子结合法、综合法和共价结合法。在这些方法中，共价结合法是优选的，因为其具有优异的长期稳定性。用于共价结合dcas蛋白的方法的示例包括各种方法，例如使用具有醛基的化合物(例如甲醛、乙二醛或戊二醛)的方法；使用多功能酰化剂的方法；以及使巯基交联的方法。用于纯化靶rna的载体优选通过填充柱状反应器来使用。
122.图1示出了使用本发明的crispr-dcas/cas蛋白衍生物对细胞或细胞裂解物中的靶rna进行功能分析的方法。在图1中，使用光活化的dcas13作为crispr-dcas蛋白，失活的dcas 13是用蓝光或白光照射之前(暗处)的dcas13，活化的dcas13是用包括蓝光或白光的光照射之后(亮处)的dcas13。在光照射之前，crrna、失活的dcas13和靶rna分别存在。当通
过光照射产生活化的dcas13时，形成crrna活化的dcas13-靶rna复合物。靶rna可以与dna、除靶rna以外的rna、蛋白等结合。
123.图1示出了dna、rna或蛋白与靶rna复合的示例。当dna或rna与靶rna结合时，可以将dna或rna从靶rna中分离出来，并通过实时pcr(qpcr)下一代测序(ngs)进行分析，以确定靶rna结合的dna或rna。当蛋白与靶rna结合时，可以通过从靶rna中分离蛋白并进行蛋白组分析来确定与靶rna相结合的蛋白。因此，可以通过分析与靶rna结合的dna、rna或蛋白来阐明靶rna的功能。此外，靶rna的序列可以通过使用qpcr和ngs的组合的分析来确定。这些分析可以用于分析细胞内环境。例如，图2示出了ips细胞分化诱导后的细胞内环境的分析结果。
124.crrna序列可以根据基于rna高阶结构预测的crrna算法来设计。用于纯化靶rna的载体被设计为包含多个与crispr-dcas蛋白结合的crrna。对样品中与crrna结合的大量靶rna进行测序，从而可以获得关于靶rna的信息。例如，一组在疾病期间表达的长非编码rna(lncrna)可以从来源于该疾病细胞的样品中确定，或者如果一组在疾病期间表达的lncrna的序列已经确定，则可以通过监测候选药物化合物如何改变表达模式来筛选有效的候选药物化合物。由于已知许多特定疾病和lncrna之间的关系，因此可以参考这些信息来设计crrna。
125.在本发明的优选实施例中，光活化dcas蛋白系统(padcas系统)可用于观察lncrna在细胞中的表达、分布、迁移等。
126.图2示出了将本发明的细胞应用于prsm(精确rna序列修饰)的实例。
127.图3至图5示出了本发明的padcas系统的示例。在padcas系统中，crispr-dcas蛋白被分为包含向导rna识别结构域的n端部分(对应于图3至图5中的ilwacas13a.n-n-mag)和包含hepn结构域的第二部分(对应于图3至图5中的ilwacas13a.c-p mag)。当用蓝光或白光照射包含这些部分的细胞时，nmag和pmag的构象发生变化，nmag与pmag相互结合成为活化dcas蛋白，并且通过标记的活化dcas(例如荧光蛋白，例如绿色荧光蛋白)可以检测由细胞中的crrna与靶rna的结合形成的复合物。nmag和pmag的核苷酸序列和氨基酸序列在文献中是已知的(nature communications,vol.6,article no.:6256(2015))。
128.本发明中使用的crispr-cas/dcas蛋白能够与向导rna和靶rna形成复合物，并且具有或不具有rna核酸酶活性，能够调节rna剪接机制。例如，在第44外显子中引入终止密码子的杜氏肌营养不良患者的情况下，可以将跳过本发明的cas13和外显子44的向导rna引入细胞中以治疗杜氏肌营养不良。
129.主要由异常rna剪接引起的疾病，如杜氏肌营养不良，如下表1至4所示。
130.[表1]
[0131][0132]
[表2]
[0133][0134]
[表3]
[0135][0136]
[表4]
[0137][0138]
本发明还提供能够抑制新型冠状病毒在哺乳动物(包括人类)体内生长的新型冠状病毒的治疗剂。
[0139]
本发明人的研究表明，新型冠状病毒的蛋白是利用哺乳动物(特别是人类)的脂质
代谢途径生物合成的。本发明人将脂代谢调节剂作为物质进行了测试，该物质能够抑制脂代谢途径中种新型冠状病毒蛋白的生物合成，从而防止病毒感染，并进一步抑制病毒的生长，并且即使病毒感染已经建立，也能缓解新型冠状病毒感染的症状并抑制其严重程度。因此，本发明人发现，脂质代谢调节剂可以通过将脂质代谢调节剂施用于哺乳动物(例如人类)、特别是未服用脂质代谢调节剂的人类，从而预防新型冠状病毒的感染；即使在新型冠状病毒感染的情况下，脂代谢调节剂也可抑制或至少延迟从轻度疾病到中度疾病或从中度疾病到重度疾病的转变。在感染新型冠状病毒之前服用脂质代谢调节剂，可抑制新型冠状病毒在体内的生长，从而抑制感染的发生。脂质代谢调节剂由于毒性低，在抑制新型冠状病毒感染方面特别有用。对成年人而言，脂质代谢调节剂的剂量是每天约1至150mg。脂质代谢调节剂可以分剂量每天给药1至4次。
[0140]
脂质代谢调节剂的示例包括但不限于美伐他汀、阿托伐他汀、普伐他汀、瑞舒伐他汀、氟伐他汀和洛伐他汀。脂质代谢调节剂优选具有hmg-coa还原酶抑制作用。脂质代谢调节剂的优选示例包括阿托伐他汀和瑞舒伐他汀。
[0141]
可以通过将本发明应用于nk细胞来抑制pd-1。例如，胸膜播散或腹膜播散可以通过从患有胸膜播散或腹膜播散的患者中去除胸腔积液或腹水，抑制胸腔积液或腹水中所含的nk细胞的pd-1，并将产生的细胞返回到胸腔积液或腹水中来治疗。
[0142]
例如，可使用抗pd-1抗体与本发明的dcas13复合物的组合。
[0143]
使用抗pd1抗体和本发明的dcas13复合物抑制正常pd-1mrna的部分成熟，可以通过抑制pd-1表达的t细胞更有效地治疗癌症，从而在保持原有t细胞活性的同时消除自身耐受。具体而言，靶向pd-1前体mrna的dcas13可依赖于外部刺激在人类淋巴细胞中表达，用于剪接调节。
[0144]
示例
[0145]
以下基于示例详细描述本发明的实施例。
[0146]
示例1：使用反式rna免疫沉淀(trip)的rna复合物纯化程序(图1)
[0147]
被称为crispr-dcas蛋白(例如crispr-dcas13；以下有时缩写为“dcas13”)的rna靶序列识别和结合系统是将包含靶序列的28个核苷酸的向导rna(crrna)和不具有核酸酶活性的dcas蛋白的复合物设计成分为两部分的系统，例如能够通过光照射结合的pmag和nmag的组合，识别靶基因并与靶基因形成复合物。例如，在图1中，在dcas13分为pmag和nmag的情况下，失活的dcas13对应于光照射前pmag与nmag分离的状态，而活化的dcas13对应于光照射后pmag及nmag结合的状态。失活的dcas13和活化的dcas13可以根据例如使用热休克蛋白系统的温度在结合状态和非结合状态之间可逆地改变。分裂后的dcas蛋白处于非活化状态，但可通过外部刺激(例如光或热)结合和活化。这里，“活化”是指crispr-dcas蛋白形成靶rna和crrna的复合物。trip技术的使用可以提取靶rna、crrna和dcas13的复合物。复合物可以包括其他rna、dna、蛋白以及与靶rna结合的各种类似因子。在某些情况下，还可以从细胞提取物中消除特定的rna(例如核糖体rna)。在图1中，“开启&免疫沉淀&洗涤”是指通过光照射将失活的dcas13转化为活化的dcas13(开启)，并将获得的复合物进行免疫沉淀，然后洗涤以去除复合物以外的成分。随后提取将靶rna与结合到靶rna的dna、蛋白或非靶rna分离，并且可以通过下一代测序对dna/rna进行测序。在蛋白的情况下，可以进行蛋白组分析。
rna和与xist结合的rna。结果证明，xist rna可以通过下一代测序方法提取出高纯度(图6)。pentr1a.dcas13a.gfp(图28a)被创建为gateway(注册商标)特异性重组的进入媒介，并重组到哺乳动物细胞表达媒介中。通过将xist基因序列插入plko5.u6.crrna(基因名称).trfp.v1中，创建了组成性表达靶向xist的crrna的慢病毒媒介(图27a)。
[0160]
图7示出了靶向人类xist rna的rna可视化的示例。通过使用gfp标记的光活化dcas13(padcas13)，可以在活细胞中确认xist rna的核定位。
[0161]
图8是执行trip方法的模型图。图9示出了sars-cov-2衍生rna与人类细胞内因子之间相互作用的验证测试的概述。
[0162]
预测病毒衍生rna序列的二级结构，并设计可靶向的crrna，或制备pgl3-sars-cov-2.orf1-启动子(图29a)作为与病毒衍生rna和crrna靶向标签序列(荧光素酶序列)融合的合成rna表达媒介。在该测试中，通过将xist基因序列插入plko5.u6.crrna(基因名称).trfp.v1中，创建了组成性表达靶向荧光素酶基因的crrna的慢病毒媒介。在病毒感染的细胞(或感染的模型细胞)中，靶向病毒rna的crrna或靶向tag序列和dcas13的crrna在任何时候被表达并转化为活化cas13/dcas13，然后通过使用trip方法纯化病毒衍生rna及其复合物。对于dna/rna，进行下一代测序。在蛋白的情况下，进行蛋白组分析。图10示出了对sars-cov-2的非翻译区实际实施的trip方法的概述。本发明人试图阐明衍生自sars-cov-2的未翻译序列在人类细胞中合成其自身蛋白的机制。
[0163]
图11示出了标签序列(在该图中，荧光素酶蛋白的rna)和sars-cov-2的非翻译区的融合rna的结构分析，以及用于trip方法的crrna序列设计的方法。结果表明，sars-cov-2的非翻译区具有独特的结构。
[0164]
图12示出了trip方法中使用的rna免疫沉淀的概述。
[0165]
图12示出了用于确认通过trip方法回收的纯度程度的qpcr分析。在将图9和图10所示的tag融合的sars-cov-2的非翻译区序列或单独的tag序列引入hek293t细胞和a549细胞后，进行靶向tag序列的trip方法，以比较和检查通过回收的rna回收sars-cov-2的未翻译区序列的效率。只有在用tag融合的sars-cov-2转染并进行cas13介导的免疫沉淀的细胞中，才能回收rna序列。
[0166]
图13示出了评估靶向sars-cov-2的trip分析方法性能的示例。在图13中，箭头表示通过免疫沉淀获得的参与脂质代谢的基因组。如图13所示，研究发现，sars-cov-2的非翻译区序列的rna在人体细胞中特别结合了rna序列，并在细胞中显著结合了代谢机制。
[0167]
图14是评估靶向sars-cov-2的trip分析技术性能的另一示例。本体富集分析示出，图13中回收的rna组的功能13是脂质代谢机制。
[0168]
图15示出了评估靶向sars-cov-2的trip分析方法性能的另一个示例：用于验证将tag融合的sars-cov-2非翻译区序列或单独将tag序列引入细胞中是否会对细胞中脂质代谢机制的基因表达产生影响的测试。
[0169]
检测了go分析中提取的与脂质代谢相关的基因的转录活性是否通过更新sars-cov-2的5'utr基因表达而改变。
[0170]
acaa2、hmgcs、fads 1/2和scd都是参与胆固醇代谢和/或脂质代谢的因素。当pgl3-5'utr在hek293t和a549细胞中表达时，与表达pgl3的情况相比，证实了基因表达的显著变化。
[0171]
图16(b)是图15(a)的结果的解释图。在衍生自sars-cov-2的5'utr表达增加的系统中，a549中对pufa系统的代谢增强，hek 293t细胞中胆固醇代谢系统增强。
[0172]
图16(c)示出了使用他汀类药物(市售药物)抑制hmgcs的尝试。他汀抑制通过衍生自sars-cov-2的5'utr增加的萤光素酶蛋白的表达。对细胞增殖的抑制和对荧光素酶rna转录的抑制未得到证实。
[0173]
图16(d)示出通过esirnas抑制hmgcs和acaa2表达，并证实了由严重sars-cov-2衍生5'utr增强的荧光素酶蛋白表达的抑制。图17示出了由esirna靶向的序列的范围(mission(注册商标)esirna：由几百个21bp的sirna的异质库组成)。
[0174]
这些结果表明，脂质代谢的调节抑制了萤光素酶蛋白的表达，而来源于sars-cov-2的5'utr增强了萤光素蛋白的表达。在任何抑制系统中都没有证实对细胞系的毒性，也没有证实对荧光素酶mrna表达的抑制。因此，由sars-cov-2衍生的5'utr增强的萤光素酶蛋白表达的抑制是由于萤光素酶蛋白的翻译抑制。
[0175]
如图17所示，阿托伐他汀和瑞舒伐他汀在与hmg-coa结合时具有许多结合位点(s565)，这可能是它们抑制sars-cov-2生长的原因之一。
[0176]
图18是评估靶向sars-cov-2的trip分析方法性能的另一个示例，示出了sars-cov-2的非翻译区序列在宿主细胞(包括人类细胞)中形成复合物的规律。sars-cov-2的非翻译区序列(图中的cov19)和人类来源的rna的结合需要人侧的因子具有特定的序列，该序列预测介导sars-cov-2的非翻译区序列和人类rna结合的蛋白的存在。
[0177]
图19是trip方法中使用的dna免疫沉淀的概述，示出了提取和分析与xist rna结合的dna的程序。
[0178]
图20示出了光敏开关系统的演示测试。只有在光刺激的细胞中，通过dcas13-crrna才能纯化xist-dna复合物。对于已知的xist rna结合区，通过qpcr方法检测产生的基因组dna。
[0179]
除图19外，图21还示出了测试xist rna的结合区是否与组蛋白密码相关的示例的概述。
[0180]
图22a中左侧的图：xist rna的dna上的结合区在基因的转录起始区周围是否具有规律性的可视化的图。左起第二列示出了在xist上执行trip方法的测试结果。左起第一列为不含crrna的阴性测试。从左起第三列、第四列和第五列是靶向组蛋白修饰的堆积图。图22a中右侧的图是左侧图中转录起始区的堆积区的图形表示。上图示出了在xist上执行的trip方法的测试结果。上图示出了类似于顶部第三张图中h3k4me3的堆积模式，这表明xist是转录调节子。
[0181]
图22b示出了从xist靶向的基因组dna组的dna测序结果中确认堆积转录起始区的结果，其从靶向lncrna xist的grna-dcas13介导的下拉(trip)的结果中提取。分离的dna是与xist rna相互作用的dna，已知通过与组蛋白修饰相关参与基因的转录调节。该测试的结果表明，与现有技术(e.g.,chirp；reference:mol cell.2011nov 18；44(4):667-78)相比，可以以更高的堆积量(峰高)和更高的分辨率(峰窄度)提取xist靶序列。
[0182]
图23示出了在设计xist crrna时用作参考的rna结构分析数据、结构预测图和预测与xist序列结合的一组蛋白的图。
[0183]
图24示出了由dcas13对xist rna功能调节的验证测试结果。证实了dcas13在转染
有对应于图23上部图中所示的crrna数量的crrna的细胞中诱导xist rna的特定序列是否将抑制h3(组蛋白h3)通过xist rna诱导到基因组上。结果表明，在用crrna 1、2、3和5转染的细胞中，h3与基因组区的结合被抑制，因此表明当crrna 1，2、3、和5被靶向时，xist功能被抑制。
[0184]
图25示出了使用光活化cas13(padcas13)系统的应用。通过使用图24中的应用(图2中的精确rna序列修饰(prsm)方法)，全面的rna功能分析成为可能。作为应用示例，在使用ips细胞的分化诱导测试中，测试人员可以在期望的时间抑制靶rna的序列特异性功能。
[0185]
图26示出了杜氏肌营养不良导致肌营养不良蛋白基因突变的前体rna水平修复。为了研究cas13/dcas13对rna剪接机制的调控及其在治疗中的应用，尝试了肌营养不良蛋白基因的剪接调控。主要由异常rna剪接引起的疾病如附图所示。
[0186]
示例4：pd-1阳性t细胞/nk细胞的pd-1前体mrna(图31)
[0187]
具有识别和消除癌细胞能力的t细胞表达pd-1，从而将癌细胞误认为是自体细胞。通过使用dcas13，可以创造出未经基因修饰的嵌合抗原受体t细胞，该t细胞有意地抑制癌细胞周围t细胞pd-1的表达，并特异性攻击癌细胞，从而导致新免疫治疗的发展(图31)。
[0188]
靶是pd-1前体mrna的外显子2的表达。目的是通过改变与pd-1的内含子1和内含子2结合的剪接调节蛋白的功能序列的结构来控制pd-1前体mrna向成熟mrna的进展。靶向相应序列的向导rna的序列如图所示(图32)。
[0189]
产生具有攻击肿瘤细胞能力增强的基因未修饰嵌合抗原受体t细胞
[0190]
图33中左侧的图：将pa-dcas13组成表达系统引入作为pd-1表达细胞的人类cd8
+
t细胞系ebt-8中，然后引入靶向pd-1前体mrna的向导rna。通过慢病毒媒介引入向导rna，同时引入pd-1靶向向导rna 1-18。
[0191]
图33中右侧的图：在a区域的ebt-8中证实了pd-1表达的选择性抑制。
[0192]
从衍生自患者腹水的淋巴细胞制备成功抑制表达的嵌合抗原受体t细胞，并在腹膜传播的动物模型中评估其疗效和安全性。
[0193]
示例5：与衍生自sars-cov-2的5'utr rna基因信息融合的萤光素酶rna的翻译活性增加的观察(图34)
[0194]
图34a：sars-cov-2的rna基因组中的5'utr基因区对应于orf1a序列3'侧的261nt。将5'utr区的序列以融合方式插入到pgl3启动子媒介中的荧光素酶rna序列的kozak序列的3'侧。
[0195]
图34b：根据引入细胞中的pgl3启动子或pgl3-5'utr媒介的量，比较和测量hek 293t和a549细胞中荧光素酶蛋白的表达是否增加。在hek293t和a549细胞中，观察到与衍生自sars-cov-2的5'utr rna基因融合的萤光素酶蛋白的表达增加。这表明衍生自sars-cov-2的5'utr含有增强人类细胞中融合的mrna翻译活性的序列。
[0196]
图34c：在图34b中进行的测试中，萤光素酶mrna的表达水平是否发生变化，通过qpcr方法进行了确认。确认了荧光素酶mrna的转录没有增加。
[0197]
上述结果表明，衍生自sars-cov-2的5'utr包含增强人类细胞中融合的mrna翻译活性的序列。
[0198]
衍生自sars-cov-2的5'utr有望作为新的ires样序列用于分子遗传学研究，从而提高任何mrna的翻译效率。

技术特征：
1.一种衍生自crispr-dcas(死cas)蛋白或crispr-cas蛋白的crispr-dcas/cas蛋白衍生物或crispr-dcas/cas蛋白衍生物集，所述crispr-dcas(死cas)蛋白具有螺旋区，能够与向导rna和靶rna形成复合物，并且不具有核酸酶活性，以及所述crispr-cas蛋白具有螺旋区，能够与向导rna和靶rna形成复合物，并且具有核酸酶活性，所述crispr-dcas/cas蛋白衍生物或crispr-dcas/cas蛋白衍生物集包括：n结构域，所述n结构域包含crispr-dcas(死cas)蛋白或crispr-cas蛋白的螺旋区的n端侧，c结构域，所述c结构域包含crispr-dcas(死cas)蛋白或crispr-cas蛋白的螺旋区的c端侧，以及第一因子和第二因子，所述第一因子和所述第二因子能够响应刺激而结合，所述n结构域与所述第一因子连接，以及所述c结构域与所述第二因子连接，具有所述第一因子和所述第二因子的crispr-dcas/cas蛋白衍生物通过含有蛋白酶识别序列的连接子结合，或通过含有自裂解肽的连接子结合，或是非共价结合，所述crispr-dcas/cas蛋白衍生物因此具有：(n结构域)-(第一因子)-(含有蛋白酶识别序列的连接子)-(第二因子)-(c结构域)的结构，或(n结构域)-(第一因子)-(含有自裂解肽的连接子)-(第二因子)-(c结构域)的结构，或(n结构域)-(第一因子)-(非共价键)-(第二因子)-(c结构域)的结构，以及所述crispr-dcas/cas蛋白衍生物集包括(n结构域)-(第一因子)和(第二因子)-(c结构域)两部分。2.根据权利要求1所述的crispr-dcas/cas蛋白衍生物或crispr-dcas/cas蛋白衍生物集，其中，所述n结构域包含所述螺旋区的n端侧上的一部分氨基酸序列，以及所述c结构域包含所述螺旋区的c端侧上的一部分氨基酸序列。3.根据权利要求1所述的crispr-dcas/cas蛋白衍生物或crispr-dcas/cas蛋白衍生物集，其中，所述n结构域包含位于源自瓦氏纤毛菌(leptotrichia wadei)的cas13a(序列id:wp_21746774.1)的螺旋区的n端侧的一部分氨基酸序列中的164个氨基酸，以及所述c结构域包含位于源自瓦氏纤毛菌(leptotrichia wadei)的cas13a(序列id:wp_21746774.1)的螺旋区的c端侧的一部分氨基酸序列中的1003个氨基酸。4.根据权利要求1至3中任一项所述的crispr-dcas/cas蛋白衍生物或crispr-dcas/cas蛋白衍生物集，其中，所述第一因子含有nmag或pmag，以及所述第二因子含有pmag或nmag。5.一种编码权利要求1至4中任一项所述的crispr-dcas/cas蛋白衍生物或crispr-dcas/cas蛋白衍生物集的多核苷酸，或其互补链。6.一种或两种媒介，包含一个或两个权利要求5所述的多核苷酸或其互补链。7.根据权利要求6所述的一种或两种媒介，其中，各个媒介是腺病毒媒介、腺相关病毒媒介、或质粒媒介。
8.根据权利要求7所述的一种或两种媒介，其中，所述媒介为两种媒介，一种媒介具有(n结构域)-(第一因子)的结构，另一种媒介具有(第二因子)-(c结构域)的结构。9.根据权利要求6至8中任一项所述的一种或两种媒介，进一步包含编码对应于所述靶rna的向导rna的多核苷酸。10.一种由权利要求6至9中任一项所述的一种或两种媒介转化的转化体。11.根据权利要求1至4中任一项所述的crispr-dcas/cas蛋白衍生物或crispr-dcas/cas蛋白衍生物集、根据权利要求5所述的多核苷酸或其互补链、根据权利要求6至9中任一项所述的一种或两种媒介、或根据权利要求10所述的转化体，其中，所述靶rna是一组与生物功能和疾病都相关的长非编码rna(lncrna)和/或非编码rna(ncrna)。12.根据权利要求10或11所述的转化体，其中，所述转化体是转化的哺乳动物细胞或转化的非人类哺乳动物。13.根据权利要求1至4中任一项所述的crispr-dcas/cas蛋白衍生物或crispr-dcas/cas蛋白衍生物集、根据权利要求5所述的多核苷酸或其互补链、根据权利要求6至9中任一项所述的一种或两种媒介、或根据权利要求10至12中任一项所述的转化体，其中，所述靶rna是源自rna病毒的rna，新型冠状病毒rna、源自合成基因的rna、lncrna、能被向导rna靶向的30nt以上的ncrna、或前体rna。14.一种用于纯化靶rna的载体，包括：固体载体，以及crispr-dcas(死cas)蛋白，所述crispr-dcas(死cas)蛋白能够与向导rna和靶rna形成复合物并且不具有核酸酶活性，所述crispr-dcas(死cas)蛋白被支持在所述固体载体上。15.一种纯化靶rna的方法，包括：允许向导rna和靶rna作用于权利要求14所述的载体上，以在所述载体上形成包含所述靶rna、所述向导rna和所述crispr-dcas蛋白的复合物；以及从所述复合物中洗脱靶rna和靶rna结合因子，所述靶rna结合因子选自由基因组dna、蛋白、和除所述靶rna以外的rna组成的组中。16.一种用于分析细胞内环境的方法，包括：将多个向导rna引入或表达到权利要求10所述的转化体中；裂解所述转化体以用rna捕获颗粒来捕获靶rna；以及分析与所述rna捕获颗粒结合的靶rna。17.根据权利要求16所述的分析方法，其中，所述转化体是ips细胞。18.根据权利要求16或17所述的分析方法，包括提取由靶rna、向导rna和光活化dcas蛋白的复合物的形成而产生的细胞的表型。19.一种用于新型冠状病毒的预防剂或治疗剂，包含作为活性成分的脂质代谢调节剂。20.根据权利要求19所述的用于新型冠状病毒的预防剂或治疗剂，其中，所述脂质代谢调节剂具有hmg-coa还原酶抑制作用或乙酰coa还原酶抑制作用。21.根据权利要求19或20所述的用于新型冠状病毒的预防剂或治疗剂，其中，所述脂质代谢调节剂为阿托伐他汀或瑞舒伐他汀。22.一种用于基于mrna、rrna(核糖体rna)和lncrna的异常剪接的疾病的治疗剂，包含作为活性成分的权利要求6至9中任一项所述的一种或两种媒介。
23.根据权利要求1所述的crispr-dcas/cas蛋白衍生物或crispr-dcas/cas蛋白衍生物集，其中，所述crispr-dcas/cas蛋白是具有核酸酶活性的cas13蛋白。

技术总结
本发明提供了一种衍生自CRISPR-dCas(死Cas)蛋白或CRISPR-Cas蛋白的CRISPR-dCas/Cas蛋白衍生物或CRISPR-dCas/Cas蛋白衍生物集，所述CRISPR-dCas(死Cas)蛋白具有螺旋区，能够与向导RNA和靶RNA形成复合物，并且不具有核酸酶活性，以及所述CRISPR-Cas蛋白具有螺旋区，能够与向导RNA和靶RNA形成复合物，并且具有核酸酶活性，所述CRISPR-dCas/Cas蛋白衍生物或CRISPR-dCas/Cas蛋白衍生物集包括：N结构域，所述N结构域包含CRISPR-dCas(死Cas)蛋白或CRISPR-Cas蛋白的螺旋区的N端侧，C结构域，所述C结构域包含CRISPR-dCas(死Cas)蛋白或CRISPR-Cas蛋白的螺旋区的C端侧，以及第一因子和第二因子，所述第一因子和所述第二因子能够响应刺激结合，所述N结构域与所述第一因子连接，以及所述C结构域与所述第二因子连接，具有所述第一因子和所述第二因子的CRISPR-dCas/Cas蛋白衍生物通过含有蛋白酶识别序列的连接子结合，或通过含有自裂解肽的连接子结合，或非共价结合，所述CRISPR-dCas/Cas蛋白衍生物因此具有：(N结构域)-(第一因子)-(含有蛋白酶识别序列的连接子)-(第二因子)-(C结构域)的结构，或(N结构域)-(第一因子)-(含有自裂解肽的连接子)-(第二因子)-(C结构域)的结构，或(N结构域)-(第一因子)-(非共价键)-(第二因子)-(C结构域)的结构，以及所述CRISPR-dCas/Cas蛋白衍生物集包括(N结构域)-(第一因子)和(第二因子)-(C结构域)两部分。(C结构域)两部分。


技术研发人员：伊藤达男 清水由梨香
受保护的技术使用者：学校法人川崎学园
技术研发日：2022.01.04
技术公布日：2023/9/23