一种用于水体毒性检测设备的微生物电极的制备方法

1.本发明涉及电极制备技术领域，具体涉及一种用于水体毒性检测设备的微生物电极的制备方法。


背景技术：

2.以微生物为毒性响应受试体的电化学水体毒性检测方法受到了越来越多的重视。我们在前期的工作中，开发了以悬浮微生物为毒性检测受试体的水体总毒性检测仪器(水体总毒性在线检测仪器的研制.分析化学,2017,45(9):1415-1419)。悬浮微生物对毒性的响应灵敏，但是其低温(4℃)保存时间短(2周)，因此增大了仪器的维护频率。虽然使用冻干技术可以延长悬浮微生物的存贮时间，但是使用冻干粉会显著的增加仪器的使用成本。为了降低仪器的维护频率，我们对仪器进行了改造，使用微生物电极，用来代替原有悬浮微生物进行毒性检测。固定后的微生物，其活性在低温(4℃)可以保存至少2个月，仪器的维护频率显著下降。
3.现有技术中实现微生物在电极表面的固定通常有两种方法，一种是采用原位生长的方式，即将电极放入微生物培养基中，促使微生物在电极表面原位生成生物膜。但由于生物膜中大量存在的胞外聚合物，这种原位培养的生物膜对毒性响应不灵敏。另外一种常用的固定微生物的方法是使用凝胶材料，比如壳聚糖、琼脂糖、聚乙烯醇、海藻酸钙等，利用凝胶材料孔道的空间位阻作用将微生物固定在电极表面。凝胶法固定的微生物对毒性的响应灵敏。但是，凝胶固定微生物需要培养、清洗微生物，然后将洗净的微生物与溶胶混合、分散均匀，最后还要通过降温或者化学反应固化。因此，制备过程繁琐。


技术实现要素：

4.本发明要解决现有技术中的技术问题，提供一种用于水体毒性检测设备的微生物电极的制备方法。
5.为了解决上述技术问题，本发明的技术方案具体如下：
6.本发明提供一种用于水体毒性检测设备的微生物电极的制备方法，包括以下步骤：
7.(1)配制蛋白胨、酵母浸出粉、氯化钠和水的混合溶液，该混合溶液经灭菌处理后，密封保存备用；
8.(2)将菌种接入到步骤(1)中得到的混合溶液中，经过培养得到微生物溶液；
9.(3)配制氯化钠的水溶液，将步骤(2)中得到的微生物溶液离心、去除上层溶液，然后加入氯化钠水溶液，将微生物重新分散，得到重新分散的微生物溶液；
10.(4)将步骤(3)得到的微生物溶液铺展到电极表面，待电极表面干燥后，得到用于水体毒性检测设备的微生物电极。
11.在上述技术方案中，步骤(1)中，在蛋白胨、酵母浸出粉、氯化钠和水的混合溶液中，蛋白胨与水的质量比为4～10：1000，酵母浸出粉与水的质量比为4～10：1000，氯化钠与
水的质量比为7～12：1000。
12.在上述技术方案中，步骤(2)中，微生物的培养温度为20～42℃，时间为12～24h。
13.在上述技术方案中，步骤(3)中，氯化钠水溶液中，氯化钠的质量百分含量为0.7％～1.2％。
14.在上述技术方案中，步骤(3)中，离心速度为5000rpm，离心时间为3～8min。
15.在上述技术方案中，步骤(3)中，用于重新分散微生物的氯化钠水溶液的体积与离心前的微生物溶液的体积比为1～2：10。
16.在上述技术方案中，步骤(4)中，干燥温度为30℃～60℃，干燥时间为15min～60min。
17.在上述技术方案中，步骤(4)中，电极为ito导电玻璃或者fto导电玻璃。
18.本发明的有益效果是：
19.本发明提供一种用于水体毒性检测设备的微生物电极的制备方法，该方法中，首先将培养好的微生物利用离心的方式沉积到试管的底部，然后将上层溶液倒掉。用生理盐水将微生物重新分散。随后将含有微生物的溶液滴在电极表面，溶液干燥后，残留在溶液中的胞外聚合物即可作为粘结剂，实现微生物在电极表面的固定。微生物在电极表面成膜稳定，可用于水体毒性的流动分析检测。原位培养微生物膜在形成过程中，微生物需要分泌并吸附大量的胞外聚合物以确保其在增值与生长过程中不会脱离微生物膜。与原位培养微生物膜中的微生物相比，悬浮微生物表面吸附的胞外聚合物量很少。因此，本发明提供的微生物膜中的胞外聚合物含量比原位生长的生物膜少，对毒性的响应比原位生长的生物膜更加灵敏。例如，1mg/l hg
2+
对本发明制备的微生物膜的活性抑制率为23％，而2mg/l hg
2+
对原位培养微生物膜的活性抑制率仅为13.99％(toxicity detection in water containing heavy metal ions with a self-powered microbial fuel cell-basedbiosensor.talanta,2017,168,210-216)。与凝胶法相比，本方法操作更加简单。
附图说明
20.下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明。
21.图1为实施例1制备的微生物电极用于毒性检测的示意图。
22.图2为实施例2制备的微生物电极用于毒性检测的示意图。
23.图3为实施例3制备的微生物电极用于毒性检测的示意图。
24.图4为实施例4制备的微生物电极用于毒性检测的示意图。
具体实施方式
25.实施例1
26.一种用于水体毒性检测设备的微生物电极的制备方法，包括如下步骤：
27.(1)在400ml二次水中加入1.6g蛋白胨，4g酵母浸出粉和4g氯化钠。将该溶液放入灭菌锅中，恒温121℃，时间15min，得到灭菌的溶液；
28.(2)将100μl自来水加入到步骤(1)获得的灭菌溶液中。随后将该溶液放入摇床中，温度30℃，转速200rpm，恒温培养16h。得到微生物溶液；
29.(3)将1g氯化钠溶解在100ml去离子水中得到氯化钠溶液。将10ml步骤(2)获得的
微生物溶液倒入离心管中，5000rpm条件下离心5min。将上层清液倒出离心管后，在离心管中加入2ml氯化钠溶液，震荡分散离心管底部的微生物。得到胞外聚合物含量低的微生物溶液；
30.(4)按照80μl/cm2的量，将步骤(3)中得到的胞外聚合物含量低的微生物溶液滴涂到ito电极上。50℃干燥15分钟，即可得到用于水体毒性检测设备的微生物电极。该电极用于毒性检测时，5mg/l hg
2+
的抑制率为76％，参见图1。
31.实施例2
32.一种用于水体毒性检测设备的微生物电极的制备方法，包括如下步骤：
33.(1)在400ml二次水中加入4.0g蛋白胨，1.6g酵母浸出粉和4.0g氯化钠。将该溶液放入灭菌锅中，恒温121℃，时间15min，得到灭菌的溶液；
34.(2)将e.coli加入到步骤(1)获得的灭菌溶液中。随后将该溶液放入摇床中，温度37℃，转速220rpm，恒温培养12h。得到微生物溶液；
35.(3)将0.8g氯化钠溶解在100ml去离子水中得到氯化钠溶液。将10ml步骤(2)获得的微生物溶液倒入离心管中，5000rpm条件下离心3min。将上层清液倒出离心管后，在离心管中加入1ml氯化钠溶液，震荡分散离心管底部的微生物。得到胞外聚合物含量低的微生物溶液；
36.(4)按照60μl/cm2的量，将步骤(3)中得到的胞外聚合物含量低的微生物溶液滴涂到fto电极上。40℃干燥60分钟，即可得到用于水体毒性检测设备的微生物电极。该电极用于毒性检测时，20mg/l hg
2+
的抑制率为76％，参见图2。
37.实施例3
38.一种用于水体毒性检测设备的微生物电极的制备方法，包括如下步骤：
39.(1)在200ml二次水中加入0.8g蛋白胨，2g酵母浸出粉和1.4g氯化钠。将该溶液放入灭菌锅中，恒温121℃，时间15min，得到灭菌的溶液；
40.(2)将bodseed加入到步骤(1)获得的灭菌溶液中。随后将该溶液放入摇床中，温度20℃，转速200rpm，恒温培养24h。得到微生物溶液；
41.(3)将1.2g氯化钠溶解在100ml去离子水中得到氯化钠溶液。将10ml步骤(2)获得的微生物溶液倒入离心管中，5000rpm条件下离心8min。将上层清液倒出离心管后，在离心管中加入2ml氯化钠溶液，震荡分散离心管底部的微生物。得到胞外聚合物含量低的微生物溶液；
42.(4)按照40μl/cm2的量，将步骤(3)中得到的胞外聚合物含量低的微生物溶液滴涂到ito电极上。30℃干燥60min，即可得到用于水体毒性检测设备的微生物电极。该电极用于毒性检测时，5mg/l hg
2+
的抑制率为98％，参见图3。
43.实施例4
44.一种用于水体毒性检测设备的微生物电极的制备方法，包括如下步骤：
45.(1)在400ml二次水中加入1.6g蛋白胨，3g酵母浸出粉和4.8g氯化钠。将该溶液放入灭菌锅中，恒温121℃，时间15min，得到灭菌的溶液；
46.(2)将100μl自来水加入到步骤(1)获得的灭菌溶液中。随后将该溶液放入摇床中，温度40℃，转速200rpm，恒温培养16h。得到微生物溶液；
47.(3)将1.0g氯化钠溶解在100ml去离子水中得到氯化钠溶液。将10ml步骤12)获得
的微生物溶液倒入离心管中，5000rpm条件下离心5min。将上层清液倒出离心管后，在离心管中加入1ml氯化钠溶液，震荡分散离心管底部的微生物。得到胞外聚合物含量低的微生物溶液；
48.(4)按照80μl/cm2的量，将步骤(3)中得到的胞外聚合物含量低的微生物溶液滴涂到ito电极上。60℃干燥15分钟，即可得到用于水体毒性检测设备的微生物电极。该电极用于毒性检测时，5mg/l hg
2+
的抑制率为94％，参见图4。
49.实施例5
50.一种用于水体毒性检测设备的微生物电极的制备方法，包括如下步骤：
51.(1)在400ml二次水中加入2.0g蛋白胨，2.0g酵母浸出粉和4.0g氯化钠。将该溶液放入灭菌锅中，恒温121℃，时间15min，得到灭菌的溶液；
52.(2)将100μl自来水加入到步骤(1)获得的灭菌溶液中。随后将该溶液放入摇床中，温度42℃，转速200rpm，恒温培养18h。得到微生物溶液；
53.(3)将1.2g氯化钠溶解在100ml去离子水中得到氯化钠溶液。将10ml步骤(2)获得的微生物溶液倒入离心管中，5000rpm条件下离心6min。将上层清液倒出离心管后，在离心管中加入1ml氯化钠溶液，震荡分散离心管底部的微生物。得到胞外聚合物含量低的微生物溶液；
54.(4)按照40μl/cm2的量，将步骤(3)中得到的胞外聚合物含量低的微生物溶液滴涂到ito电极上。60℃干燥15分钟，即可得到用于水体毒性检测设备的微生物电极。该电极用于毒性检测时，5mg/l hg
2+
的抑制率为96％。
55.实施例6
56.一种用于水体毒性检测设备的微生物电极的制备方法，包括如下步骤，
57.(1)在100ml二次水中加入0.6g蛋白胨，1.0g酵母浸出粉和1g氯化钠。将该溶液放入灭菌锅中，恒温121℃，时间15min，得到灭菌的溶液；
58.(2)将100μl自来水加入到步骤(1)获得的灭菌溶液中。随后将该溶液放入摇床中，温度37℃，转速180rpm，恒温培养18h。得到微生物溶液；
59.(3)将1.2g氯化钠溶解在100ml去离子水中得到氯化钠溶液。将10ml步骤(2)获得的微生物溶液倒入离心管中，5000rpm条件下离心7min。将上层清液倒出离心管后，在离心管中加入1ml氯化钠溶液，震荡分散离心管底部的微生物。得到胞外聚合物含量低的微生物溶液；
60.(4)按照40μl/cm2的量，将步骤(3)中得到的胞外聚合物含量低的微生物溶液滴涂到ito电极上。50℃干燥15分钟，即可得到用于水体毒性检测设备的微生物电极。该电极用于毒性检测时，5mg/l hg
2+
的抑制率为97％。
61.显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

技术特征：
1.一种用于水体毒性检测设备的微生物电极的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)配制蛋白胨、酵母浸出粉、氯化钠和水的混合溶液，该混合溶液经灭菌处理后，密封保存备用；(2)将菌种接入到步骤(1)中得到的混合溶液中，经过培养得到微生物溶液；(3)配制氯化钠的水溶液，将步骤(2)中得到的微生物溶液离心、去除上层溶液，然后加入氯化钠水溶液，将微生物重新分散，得到重新分散的微生物溶液；(4)将步骤(3)得到的微生物溶液铺展到电极表面，待电极表面干燥后，得到用于水体毒性检测设备的微生物电极。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，在蛋白胨、酵母浸出粉、氯化钠和水的混合溶液中，蛋白胨与水的质量比为4～10：1000，酵母浸出粉与水的质量比为4～10：1000，氯化钠与水的质量比为7～12：1000。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，微生物的培养温度为20～42℃，时间为12～24h。4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，氯化钠水溶液中，氯化钠的质量百分含量为0.7％～1.2％。5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，离心速度为5000rpm，离心时间为3～8min。6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，用于重新分散微生物的氯化钠水溶液的体积与离心前的微生物溶液的体积比为1～2：10。7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，干燥温度为30℃～60℃，干燥时间为15min～60min。8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，电极为ito导电玻璃或者fto导电玻璃。

技术总结
本发明涉及一种用于水体毒性检测设备的微生物电极的制备方法，涉及电极制备技术领域。本发明提供一种用于水体毒性检测设备的微生物电极的制备方法，该方法首先将培养好的微生物利用离心的方式沉积到试管的底部，然后将上层溶液倒掉。用生理盐水将微生物重新分散。随后将含有微生物的溶液滴在电极表面，溶液干燥后，残留在溶液中的胞外聚合物即可作为粘结剂，实现微生物在电极表面的固定。微生物在电极表面成膜稳定，可用于水体毒性的流动分析检测。此外，固定的生物膜内胞外聚合物比原位生长的生物膜少，因此对毒性的响应比原位生长的生物膜灵敏。与凝胶法相比，本方法操作更加简单。单。单。


技术研发人员：翟俊峰 董绍俊
受保护的技术使用者：中国科学院长春应用化学研究所
技术研发日：2022.03.14
技术公布日：2023/9/23