JAZ蛋白及其衍生物在农业害虫防控中的应用

jaz蛋白及其衍生物在农业害虫防控中的应用
技术领域
1.本发明属于植物基因工程与生物防治技术领域，特别是涉及jaz蛋白及其衍生物在农业害虫防控中的应用。


背景技术：

2.昆虫害虫是造成全世界农作物损失的主要因素，它具有种类多、影响大、并时常暴发成灾的特点，其发生范围和严重程度对我国国民经济、特别是农业生产常造成重大损失。其中，草地贪夜蛾、棉铃虫、盲蝽蟓、玉米螟、棉蚜、麦蚜等，已成为严重影响世界各地农业生产的重大农业害虫。
3.草地贪夜蛾，拉丁学名：spodoptera frugiperda(j.e.smith)，俗称秋粘虫(fall armyworm)，属于鳞翅目(lepidoptera)夜蛾科(noctuidae)，是联合国粮农组织全球预警的重大农业害虫，2019年1月自缅甸传入中国云南省向北蔓延，成为我国“北迁南回、周年循环”的重大迁飞性害虫，可取食超过76个科、超过350种植物，造成严重的经济损失，严重威胁了世界各地粮食安全。长期以来对草地贪夜蛾的防治依赖于化学防治和转bt作物，但最新研究表明草地贪夜蛾已对多种农药及转bt玉米产生抗性。
4.棉铃虫，拉丁学名：helicoverpa armigera(h
ü
bner)，属于鳞翅目(lepidoptera)，夜蛾科(noctuidae)，广泛分布在中国及世界各地，寄主植物有30多科200余种，中国棉区和蔬菜种植区均有发生。在作物上是棉花、花生、大豆上的重要害虫，并且还可危害小麦、玉米、高粱、豆类、烟草、芝麻、向日葵、苹果、梨、桃、葡萄等。
5.传统上，防治昆虫害虫种群的主要方法是施用广谱化学杀昆虫剂，长期以来，大量喷施化学杀虫剂，不仅会增强害虫的抗药性，使益虫及其它生态区系遭受破坏，而且严重污染环境，提高生产成本，破坏生态平衡。因此，减少杀虫剂使用量，开展应急防治，开发新型绿色生物防控方法，将是当前一项非常重要的工作任务。
6.棉花是世界上最主要的经济作物之一，其纤维是纺织工业的重要原料。作为世界上四大产棉国之一，我国棉花的种植面积以及产量一直位居世界前列。植物激素茉莉酸(jasmonic acid,ja)在害虫侵袭时通过调控下游基因的表达在植物防御害虫中发挥重要作用。jaz蛋白作为茉莉酸信号传导的关键调节因子，主要抑制茉莉酸反应下游基因的转录表达，是一个重要的转录抑制因子。但是至今尚未见到有关植物转录抑制因子jaz蛋白在防控虫害中应用的报道。
7.ngr(asn-gly-arg)是通过噬菌体展示技术筛选出来的能够和肿瘤新生血管特异结合的三肽模体，可以通过内皮细胞上的氨肽酶n(aminopeptidase n，亦称apn/cd13)与新生血管发生特异性的结合。氨肽酶n(apn/cd13)是一种依赖于锌离子的二型金属外肽酶，隶属于m1氨肽酶大家族，其生理学功能是参与底物蛋白n端氨基酸的降解。
8.1996年全世界第一例转基因抗虫植物在美国获准应用，二十多年的商业化证明，转基因作物为全世界带来了农业、环境、经济、健康和社会效益，但它们通常仅对较窄范围的经济上重要的害虫具有抗性，某些昆虫已对这些经遗传工程改造的作物中的某些杀昆虫
多肽产生了抗性。
9.因此，仍然需要对昆虫害虫具有更大范围的杀昆虫活性的新杀虫蛋白，例如对更多种类的鳞翅目、同翅目、半翅目等昆虫具有活性的毒素，为转基因作物与工程菌株提供新的基因来源。此外，仍然需要具有改善的杀昆虫活性和对于多种对现有杀虫剂及杀虫蛋白已产生抗性的昆虫具有活性的生物杀虫剂，具有重要的经济、社会和生态效益。


技术实现要素：

10.本发明的一个目的是提供如下应用。
11.本发明提供了含有ngr结构域的ghjaz蛋白或其编码核酸或重组载体、表达盒或重组菌或以所述ghjaz蛋白为活性成分的物质在如下至少一种中的应用：
12.1)杀虫；
13.2)抗虫；
14.3)制备杀虫或抗虫产品；
15.4)提高植物抗虫性；
16.5)培养抗虫植物；
17.所述ngr结构域的氨基酸序列为seq id no:17。
18.所述ghjaz蛋白来源于棉属(gossypium)、雷公藤(tripterygium wilfordii)、木槿(hibiscus syriacus)、鼠尾草(durio zibethinus)、锦葵(herrania umbratica)、可可(theobroma cacao)、中国莲(nelumbo nucifera)、榴莲(durio zibethinus)。
19.上述应用中，所述含有ngr结构域的ghjaz蛋白为如下任一种：
20.1)seq id no:5、seq id no:7、seq id no:9、seq id no:11、seq id no:13或seq id no:15所示的蛋白；
21.2)将1)所示蛋白的氨基酸序列末端添加标签序列且具有相同活性的由a衍生的蛋白；
22.3)所述的蛋白为与1)具有至少95％，98％，99％的序列一致性，且含有seq id no:17所示多肽的蛋白。
23.上述应用中，所述编码核酸是如下1)-3)中任一种的dna分子：
24.1)编码区为seq id no:6、seq id no:8、seq id no:10、seq id no:12、seq id no:14或seq id no:16所示的dna分子；
25.2)在严格条件下与1)所示的限定的dna序列杂交且编码具有相同功能蛋白质的dna分子；
26.3)与1)所示的限定的dna序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且编码具有相同功能蛋白质的dna分子。
27.上述应用中，所述虫为植物害虫；
28.和/或，所述植物害虫为鳞翅目害虫。
29.本发明另一个目的是提供一种培育抗虫性转基因植物的方法。
30.本发明提供的方法，为如下1)或2)：
31.1)所述的方法包括如下步骤：提高目的植物中含有ngr结构域的ghjaz蛋白的含量
和/或活性，得到转基因植物；
32.2)所述的方法包括如下步骤：提高目的植物中编码含有ngr结构域的ghjaz蛋白的核酸分子的表达，得到转基因植物；
33.所述转基因植物的抗虫性高于所述目的植物。
34.上述方法中，所述虫为植物害虫；
35.和/或，所述植物害虫为鳞翅目害虫。
36.本发明还有一个目的是提供一种杀虫或抗虫方法，包括如下步骤：对虫施加含有ngr结构域的ghjaz蛋白，实现杀虫或抗虫。
37.抑制含有ngr结构域的ghjaz蛋白中ngr结构域的表达的物质在降低含有ngr结构域的ghjaz蛋白杀虫力或抗虫性中的应用也是本发明保护的范围；
38.或突变含有ngr结构域的ghjaz蛋白中ngr结构域的物质在降低含有ngr结构域的ghjaz蛋白杀虫力或抗虫性中的应用也是本发明保护的范围。
39.上述抑制含有ngr结构域的ghjaz蛋白中ngr结构域的表达的物质为使ngr结构域中第43位的n突变为l，且45位的r突变为k，在本发明的实施例中为将ghjaz8突变为ghjaz8
lgk
。
40.上述虫为鳞翅目害虫；在本发明的实施例中以草地贪夜蛾、棉铃虫、盲蝽蟓、蚜虫为例，也可以为spodoptera litura、helicoverpa armigera、trichoplusia ni、hyposmocoma kahamanoa、galleria mellonella、maniola hyperantus、aricia agestis、manduca sexta、brenthis ino、arctia plantaginis、chilo suppressalis、pararge aegeria、vanessa tameamea、bicyclus anynana、amyelois transitella、melitaea cinxia、leptidea sinapis、pieris rapae或pieris brassicae。
41.在本发明中，植物为玉蜀黍、高粱、小麦、向日葵、番茄、十字花科物种、辣椒属物种、马铃薯、棉花、水稻、大豆、甜菜、甘蔗、烟草或大麦。
42.本发明在一个方面，提供了将杀虫活性赋予细菌、植物、植物细胞、组织和种子的jaz及其衍生物(含多肽)和基于上述物质的修饰产物的组合物和方法。jaz及其衍生物(含多肽)和基于上述物质的修饰产物的组合物包含编码杀虫和杀昆虫多肽的序列的核酸分子、含有那些核酸分子的载体以及含有所述载体的宿主细胞。jaz及其衍生物(含多肽)和基于上述物质的修饰产物的组合物还包含杀虫多肽序列以及那些多肽的抗体。核酸序列可用于dna构建体或表达盒中，该dna构建体或表达盒用于在生物体(包括微生物、植物和动物)中转化和表达。核苷酸或氨基酸序列可以为设计用于在生物体(包括但不限于微生物、植物和动物)中表达的合成序列。组合物还包含转化的植物、植物细胞、组织、种子和动物、微生物。
43.具体地讲，提供了编码jaz及其衍生物(含多肽)和基于上述物质的修饰产物(包括氨基酸置换、缺失、插入的分离或重组的核酸分子。此外，涵盖了与asn-gly-arg多肽对应的核苷酸序列。还涵盖了与所述实施例的核酸序列互补或杂交至所述实施例的序列的核酸序列。
44.本发明在一个具体的实施例中，可使用已被优化以使在宿主生物体中的表达提高的核酸来产生转化生物材料。例如，可将本发明实施例的jaz及其衍生物(含多肽)和基于上述物质的修饰产物之一进行反翻译，以产生包括为了在特定宿主中表达而优化的密码子的
核酸，所述宿主例如玉米(zea mays)、水稻(oryza sativa)、棉花(gossypium hirsutum)等受体植物。这种转化的植物(例如双子叶植物或者单子叶植物)对编码序列的表达将导致产生杀虫jaz及其衍生物(含多肽)和基于上述物质的修饰产物并给生物体赋予提高的抗虫性。
45.本发明在另一方面，提供了用于产生多肽以及使用那些多肽防治或杀灭重大农业害虫的方法。所述实施例的转基因生物体表达本文所公开的杀虫序列中的一者或多者。在各种实施例中，所述转基因生物体还包含具有昆虫抗性的一个或多个另外的基因，例如，用于防治鳞翅目、同翅目、半翅目害虫的一个或多个另外的基因。本领域技术人员应当理解，所述转基因生物体可包含赋予所关注的农艺性状的任何基因。
46.本发明首次对棉花30个jaz(jasmonate zim domain)蛋白(sun h,chen l,li j,hu m,ullah a,he x,yang x,zhang x.the jasmonate zim-domain gene family mediates ja signaling and stress response in cotton.plant cell physiol.2017dec 1；58(12):2139-2154.doi:10.1093/pcp/pcx148.pmid:29036515.)中代表性的ghjaz5、ghjaz8和ghjaz16进行表达，均表现出一定杀虫效果，其中ghjaz8效果最好。进一步分析发现，ghjaz8含有ngr(即asn-gly-arg氨基酸)结构域，ngr是医学上已广泛应用、可特异靶向受体蛋白apn(aminopeptidase n)的结构域，jaz是典型的植物源转录抑制蛋白，ngr-jaz是指含有ngr结构域的植物源jaz蛋白。ngr结构域在植物jaz中存在属首次发现。进一步分析发现，以ghjaz8为代表的ngr-jaz在棉花基因组含有6个成员。ngr-jaz蛋白能毒杀草地贪夜蛾等重大农业害虫，属首次发现。通过对草地贪夜蛾细胞系毒性实验，以及活体幼虫饲喂实验，结果表明ngr-jaz蛋白对其均具有显著的毒杀作用。通过酵母双杂y2h(yeasttwo-hybrid)、免疫共沉淀coip(co-immunoprecipitation)实验发现ngr靶向草地贪夜蛾细胞表面受体apns进入昆虫细胞，与细胞周期关键蛋白sfhdac3互作扰乱有丝分裂，从而对害虫产生毒杀作用。大数据分析还发现apn在棉铃虫(鳞翅目)、盲蝽蟓(半翅目，绿盲蝽)、蚜虫(同翅目，棉蚜虫)等重大农业害虫中具有高度保守性，经对棉铃虫进行活体饲喂实验，发现ngr-jaz同样对其具有毒杀作用，据此推断，基于ngr-jaz及其衍生物(含多肽)对盲蝽蟓、蚜虫等重大农业害虫同样具有毒杀作用。为此，创制了ghjaz8过表达载体，并获得了转基因水稻、玉米、棉花和烟草，均对草地贪夜蛾和多种鳞翅目害虫具有良好抗性。
47.综上，本发明首次发现jaz蛋白尤其是ngr-jaz及其衍生多肽具有广谱抗虫性，国内外尚未见到相关报道，在重大农业害虫防控中具有重大应用价值。
附图说明
48.图1为western blot分析ghjaz5、ghjaz8和ghjaz16的蛋白表达；ghjaz5(a)蛋白大小为27.28kda，ghjaz8(b)蛋白大小为14.7kda，ghjaz16(c)蛋白大小为40.7kda。
49.图2为ghjaz5、ghjaz8和ghjaz16蛋白梯度浓度溶液对草地贪夜蛾卵巢细胞系sf9的细胞毒性。
50.图3为ngr-ghjazs与陆地棉(gossypium hirsutum)中jaz蛋白家族成员的氨基酸序列比对。
51.图4为ngr-ghjazs与sfapn4互作；图4a显示强调了sfapn4的n-terminal signal peptide、gamen motif、hex2hx18e motif、gpi anchor signal功能保守域；图4b酵母双杂
y2h实验显示强调了含有ngr结构域的ghjazs蛋白通过ngr与sfapn4互作；图4c免疫共沉淀coip(co-immunoprecipitation)实验显示强调了含有ngr结构域的ghjaz8与sfapn4互作。
52.图5为sfapn4(seq id no:21)和如下物种同源物中apn4的氨基酸比对。
53.图6为ghjaz8蛋白对重大农业害虫草地贪夜蛾、棉铃虫的生物测定；图6a、6b示出了ghjaz8、ghjaz8
lgk
蛋白纯化后的sds-page(左图)和western blot(右图)结果；图6c、6d示出了ghjaz8蛋白及突变“ngr”结构域的ghjaz8
lgk
蛋白对草地贪夜蛾、棉铃虫的生长抑制表型；图6e、6f示出了ghjaz8蛋白及突变“ngr”结构域的ghjaz8
lgk
蛋白对草地贪夜蛾、棉铃虫的生长抑制率数据。
54.图7为ghjaz13,ghjaz14,ghjaz24,ghjaz27,ghjaz28对草地贪夜蛾细胞sf9的细胞凋亡测定。
55.图8为coip实验示出了ghjaz8蛋白和sfhdac3蛋白的体内互作。
56.图9为sfhdac3(seq id no:23)与其他物种害虫的氨基酸序列同源性结果。相同氨基酸在序列下方标出。
57.图10为植物表达载体pmdc100-ghjaz8结构图。
58.图11为ghjaz8转基因水稻、玉米、棉花和烟草的pcr鉴定。
59.图12为ghjaz8转基因水稻和野生型水稻在草地贪夜蛾取食后第7天的表型。
60.图13为稻纵卷叶螟取食ghjaz8转基因水稻后的校正死亡率。
61.图14为取食ghjaz8转基因棉花后的棉铃虫幼虫的中肠组织切片，棉铃虫中肠组织结构tunnel-if染色；+wt：取食野生型棉花叶片后的棉铃虫中肠组织表型；+oe：取食ghjaz8转基因棉花叶片后的棉铃虫中肠组织表型。
62.图15为取食ghjaz8转基因玉米后的草地贪夜蛾幼虫的中肠组织切片，草地贪夜蛾中肠组织结构tunnel染色；+wt：取食野生型玉米叶片后的草地贪夜蛾中肠组织表型；+oe：取食ghjaz8转基因玉米叶片后的草地贪夜蛾中肠组织表型。
63.图16为取食ghjaz8转基因烟草后的草地贪夜蛾幼虫的中肠组织切片，草地贪夜蛾中肠组织结构he染色(40倍)。
具体实施方式
64.下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
65.下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
66.下述实施例中的pbs来自生工，货号e607016-0500，使用1倍的pbs，ph 7.2。
67.草地贪夜蛾，来源：河南省农业科学院植物保护研究所，记载在如下文献中，gui f,lan t,zhao y,guo w,dong y,fang d,liu h,li h,wang h,hao r,cheng x,li y,yang p,sahu sk,chen y,cheng l,he s,liu p,fan g,lu h,hu g,dong w,chen b,jiang y,zhang y,xu h,lin f,slippers b,postma a,jackson m,abate ba,tesfaye k,demie al,bayeleygne md,degefu dt,chen f,kuria pk,kinyua zm,liu tx,yang h,huang f,liu x,sheng j,kang l.genomic and transcriptomic analysis unveils population evolution and development of pesticide resistance in fall armyworm spodoptera frugiperda.protein cell.2020oct 27.doi:10.1007/s13238-020-00795-7.epub ahead of print.pmid:33108584.文献中的该材料的名称为fall armyworm。
id no：18)的核心残基ngr(asn43-gly44-arg45)在序列中用框线标出。
90.使用blast和psi-blast在美国国家生物技术信息中心(ncbi)的非冗余数据库(nr)，在“organism”条件框分别依次输入植物物种，用含有ngr结构域的棉花6个jaz最保守氨基酸序列qqqqltifyngrvcv(seq id no：17)在ncbi进行全物种基因组blast发现，玉米(zea mays)、油菜(brassica napus)、大豆(glycine max)、小麦(triticum aestivum)、水稻(oryza sativa)、甘薯(ipomoea batatas)、马铃薯(solanum tuberosum)、蚕豆(vicia faba)、豌豆(pisum sativum)、绿豆(phaseolus radiatus)、拟南芥(arabidopsis thaliana)、烟草(nicotiana tabacum)等植物的jaz家族中均无qqqqltifyngrvcv结构域。
91.表1为列出了qqqqltifyngrvcv在ncbi进行全物种基因组blast部分结果，显示强调了qqqqltifyngrvcv(seq id no：17)和如下同源物中的氨基酸序列比对。
92.表1为列出了qqqqltifyngrvcv在ncbi进行全物种基因组blast部分结果
[0093][0094][0095]
同样的，使用blast和psi-blast在美国国家生物技术信息中心(ncbi)的非冗余数据库(nr)，不限定“organism”条件框物种，用含有ngr结构域的棉花6个jaz最保守氨基酸序列qqqqltifyngrvcv在ncbi进行全物种基因组blast发现，仅棉属(gossypium)、雷公藤(tripterygium wilfordii)、木槿(hibiscus syriacus)、鼠尾草(durio zibethinus)、锦葵(herrania umbratica)、可可(theobroma cacao)、中国莲(nelumbo nucifera)、榴莲(durio zibethinus)基因组序列中存在qqqqltifyngrvcv结构域，其中，雷公藤、木槿、鼠尾
no.12)、pgadt7::ghjaz27(seq id no.14)和pgadt7::ghjaz28(seq id no.16)所示dna片段分别插入到pgadt7质粒(优宝生物，vt1639)的bamh1和ecor1之间，得到pgadt7+ghjaz8、pgadt7+ghjaz8
lgk
、pgadt7+ghjaz13、pgadt7+ghjaz14、pgadt7+ghjaz24、pgadt7+ghjaz27和pgadt7+ghjaz28。
[0104]
pgbkt7::sfapn4所示dna片段(seq id no:22)插入到pgbkt7质粒(优宝生物，货号：vt1638)的bamh1和ecor1之间，得到的载体质粒，命名为pgbkt7+sfapn4。
[0105]
pgadt7+不同基因质粒分别与pgbkt7+sfapn4质粒共转酵母感受态y2hgold(上海唯地公司，货号：yc1002)，再加入carrier dna(95℃，5min)、peg/liac并混匀，30℃水浴30min(15min时翻转6-8次混匀)，42℃水浴15min(7.5min时翻转8次混匀)，5000rpm离心40s，弃上清，加入ddh2o重悬，5000rpm离心30s，弃上清，加入ddh2o重悬，涂于二缺培养基(sd/-leu/-trp)，28℃培养2天，长斑后，挑斑点在四缺培养基中(sd-ade/-his/-leu/-trp，添加aba、x-α-gal)，28℃培养4天后观察互作情况。
[0106]
结果如图4b所示，看出sfapn4能与ghjaz8、ghjaz13、ghjaz14、ghjaz24、ghjaz27、ghjaz28分别互作，但是与ghjaz8
lgk
(n43g44r45突变为l43g44k45)失去互作，表明ngr结构域引导ghjaz8靶向sfapn4。
[0107]
2、免疫共沉淀coip(co-immunoprecipitation)实验
[0108]
pcdna3.1-ghjaz8载体：将ghjaz8-flag标签(在seq id no.4的第358位的t前面插入flag标签(gactacaaagacgatgacgacaaa)，即在ghjaz8基因的终止密码子前加入flag标签)构建到pcdna3.1载体(优宝生物，vt1001)中得到的载体；
[0109]
pcdna3.1-sfapn4载体：将sfapn4-flag标签(在seq id no.22的第2857位的t前面插入ha标签(tacccatacgatgttccagattacgcttga)，即在sfapn4基因的终止密码子前加入flag标签)构建到pcdna3.1载体(优宝生物，vt1001)中得到的载体；
[0110]
将上述2个载体共转293t细胞(普诺赛，货号：cl-0005)，得到共转染细胞。
[0111]
将上述共转染细胞ip-wb验证：将非变性裂解液添加至上述共转染细胞培养板，4℃下完全裂解细胞。将裂解物以12,000rpm离心10分钟，收集上清液。将相应的抗体添加到得到的非变性蛋白溶液中，将其在4℃下孵育过夜。用裂解缓冲液洗涤pierce tm蛋白a/g琼脂糖珠(thermo fisher scientific，inc.)，将预处理过的珠子加入到细胞裂解物中，并在室温下孵育2小时。将混合液在4℃下以2500rpm离心5分钟，除去上清液，并用1ml裂解缓冲液洗涤琼脂糖珠5次。在沉淀物中加入适量蛋白质上样缓冲液，并将样品在100℃水浴10分钟，蛋白质印迹法(western blot)检测目的条带。
[0112]
结果如图4c所示，验证sfapn4与ghjaz8的体内互作。
[0113]
四、sfapn4在害虫中的序列保守性
[0114]
使用blast和psi-blast在美国国家生物技术信息中心(ncbi)的非冗余数据库(nr)中通过相似性搜索识别出了sfapn4的直系同源序列，结果如图5所示，这些直系同源蛋白存在于各生物界，绝大多数为鳞翅目害虫，例如与pxapn4a(plutella xylostella吊丝虫，genbank:mg873050)，pxapn4b(plutella xylostella，genbank:mg873051)，cmapn4(cnaphalocrocis medinalis稻纵卷叶螟，genbank:adz05468)，csapn4(chilo suppressalis二化螟，genbank:adz57273)，haapn4(helicoverpa armigera棉铃虫，genbank:aap37950)，hpapn4(helicoverpa punctigera斑叶螟，genbank:aaf37559)，
ofapn4(ostrinia furnacalis亚洲玉米螟，genbank:acb87202)，onapn4(ostrinia nubilalis玉米螟，genbank:acv74256)，seapn4(spodoptera exigua甜菜夜蛾，genbank:aap44967)，slituapn4(spodoptera litura斜纹夜蛾，genbank:aak69605)，序列比对高度同源，可能表明它们都能作为特异性靶标被ngr-jaz和含有ngr的植物源转录抑制蛋白及其衍生多肽和修饰产物识别，另外，表明它们与sfapn4在进化和功能上具有相关性，被认为具有相似的作用模式。
[0115]
实施例2、ngr-ghjaz蛋白在杀草地贪夜蛾、棉铃虫中的应用
[0116]
1、ghjaz8、ghjaz8
lgk
蛋白表达及纯化
[0117]
pet-30a-ghjaz8将seq id no.4所示ghjaz8的编码基因dna序列插入到pet-30a(+)载体(优宝生物，货号：vt1212)的ndei和hindiii之间，得到的载体，ghjaz8基因与6
×
his标签(6
×
his标签位于ghjaz8启动子atg后面)融合表达ghjaz8融合蛋白；
[0118]
pet-30a-ghjaz8
lgk
将seq id no.25所示ghjaz8
lgk
(n43g44r45突变为l43g44k45)的编码基因dna序列插入到pet-30a(+)载体(优宝生物，货号：vt1212)的ndei和hindiii之间，得到的载体，ghjaz8
lgk
基因与6
×
his标签(6
×
his标签位于ghjaz8
lgk
启动子atg后面)融合表达ghjaz8
lgk
融合蛋白；
[0119]
将上述pet-30a-ghjaz8和pet-30a-ghjaz8
lgk
分别转化大肠杆菌bl21，冰上30min，42℃热激60s，冰上2min，加入lb培养基，37℃，200rpm，1h，涂到相应抗生素的lb平板上，37℃培养。长斑后挑取单克隆摇菌，然后扩大培养，直到培养基开始稍微变白后，加入iptg(具体为0.5mm终浓度)进行诱导，并设置37℃温度过夜培养。然后5000rpm，4℃，离心10min，等体积pbs重悬(加入pmsf、dtt)。将其超声波破碎(超声时间：20分钟，间隔时间：5秒，超声功率：200w)，破碎5s，冰上5s，直至重悬液有明显变清。离心13000rpm，4℃，10min，分离上清和包涵体。
[0120]
将上清转入蛋白纯化柱(金斯瑞，货号：l00250-25；用低ph缓冲液、咪唑溶液洗脱，收集洗脱液为目的蛋白)，进行孵育后洗涤并洗脱，利用蛋白预染液逐滴和sds-page进行检测并收集蛋白。
[0121]
结果如图6a和图6b所示，得到2.39mg/ml浓度ghjaz8融合蛋白(n端融合his标签)和1.99mg/ml浓度ghjaz8
lgk
融合蛋白(n端融合his标签)。
[0122]
2、杀虫
[0123]
处理组：将配制好的昆虫饲料(河南省济源白云实业有限公司，产品名称为草地贪夜蛾人工饲料)加入到24孔板中，每孔200微升量；运用覆膜法将已稀释的不同浓度的ghjaz8蛋白溶液(用pbs稀释)加到饲料表面，并在培养箱中震荡直至蛋白浸入培养基中。取初孵12h内、未进食的草地贪夜蛾、棉铃虫幼虫作为实验对象，放入培养箱，每个浓度蛋白对应100只。
[0124]
每个蛋白浓度设置16次重复，每种剂量设置3个平行测定组。
[0125]
对照组：与实验组不同的是运用覆膜法将pbs溶液加到饲料表面，其余均相同。
[0126]
7天后统计龄期和体重，并且进行统计分析。
[0127]
抑制率＝(1-处理组幼虫平均单只体重/对照组幼虫平均单只体重)*100
[0128]
结果如图6c、6d、6e、6f所示，结果显示，ghjaz8蛋白处理后重大农业害虫草地贪夜蛾、棉铃虫表型生长迟缓，具有非常好的抑制活性；但是，突变“ngr”结构域的ghjaz8
lgk
蛋白
对草地贪夜蛾、棉铃虫生长的抑制作用减弱。
[0129]
为了进一步探究另外5种ngr-ghjaz蛋白ghjaz13、ghjaz14、ghjaz24、ghjaz27、ghjaz28的抗虫性作用，进行如下实验：
[0130]
实验组：将5种ngr-ghjaz蛋白分别溶解与pbs溶液中，得到浓度都为0.5μm的蛋白溶液，再将不同蛋白溶液加入sf9细胞培养液(5*104个/ml)中(按照每100微升细胞培养基加5微升蛋白溶液)，培养24小时，进行凋亡检测。
[0131]
对照组：与实验组不同的是，向sf9细胞培养液中添加pbs为对照。
[0132]
检测方法如下：用胰酶消化贴壁细胞，收集到离心管内，离心沉淀细胞，去除上清，并用pbs洗涤一遍，用细胞凋亡检测试剂盒(武汉普诺赛生命科技有限公司，货号：p-ca-201)流式检测细胞凋亡。
[0133]
结果如图7所示，与对照组(ctrl)相比，5种ngr-ghjaz蛋白处理过sf9细胞的细胞凋亡率极显著高于对照，说明5种ngr-ghjaz蛋白对草地贪夜蛾细胞都是有毒性的。
[0134]
实施例3、ghjaz8通过与sfhdac3互作抑制细胞周期
[0135]
根据现有的spodoptera frugiperda转录组和基因组数据库，结合ncbi基因组数据库，经设计引物pcr扩增(模板为玉米型草地贪夜蛾幼虫全组织cdna，sfhdac3-f：5
’‑
atgcttctcggtgacatcgagc-3’，sfhdac3-r：5
’‑
ctaagggtccttgttctcaacc-3’)获得sfhdac3全长序列(氨基酸序列见seq id no:23，核苷酸序列见seq id no:24)。前人研究表明，rnai介导的人结肠癌细胞系或hela细胞中hdac3的敲低导致了g2期和/或m期细胞的积累，中期组蛋白h3ser10磷酸化缺失，有丝分裂崩溃。
[0136]
进一步地，通过coip实验验证了ghjaz8和sfhdac3的体内互作(图8，实验方法同实施例1的三)。
[0137]
因此，可能表明jaz蛋白及其衍生物(含多肽)和基于上述物质的修饰产物通过细胞表面受体apn4进入细胞后，抑制hdac3转录，使细胞周期阻滞在g2期和/或m期，导致有丝分裂崩溃，从而对害虫细胞产生毒性。
[0138]
使用blast和psi-blast在美国国家生物技术信息中心(ncbi)的非冗余数据库(nr)中通过相似性搜索识别出了sfhdac3的直系同源序列，这些直系同源蛋白存在于各生物界，绝大多数为鳞翅目害虫，例如与slhdac3(genbank:xp_022831573.1,spodoptera litura),hahdac3(genbank:xp_021195587.1,helicoverpa armigera),tnhdac3(genbank:xp_026740888.1,trichoplusia ni),hkhdac3(genbank:xp_026333196.1,hyposmocoma kahamanoa),gmhdac3(genbank:xp_026754881.1,galleria mellonella),mhhdac3(genbank:xp_034827651.1,maniola hyperantus),aahdac3(genbank:xp_041972205.1,aricia agestis),mshdac3(genbank:kag6455343.1,manduca sexta),bihdac3(genbank:cah0713927.1,brenthis ino),aphdac3(genbank:cab3219866.1,arctia plantaginis),cshdac3(genbank:rve44174.1,chilo suppressalis),pahdac3(genbank:xp_039752448.1,pararge aegeria),vthdac3(genbank:xp_026489054.1,vanessa tameamea),bahdac3(genbank:xp_023947594.1,bicyclus anynana),athdac3(genbank:xp_013193311.1,amyelois transitella),mchdac3(genbank:xp_045454150.1,melitaea cinxia),lshdac3(genbank:vvd00622.1,leptidea sinapis),prhdac3(genbank:xp_022129510.1,pieris rapae),pbhdac3(genbank:xp_045518296.1,pieris brassicae)序
列比较结果高度保守(图9)，可能表明它们都能作为特异性靶标被ngr-jaz和含有ngr的植物源转录抑制蛋白及其衍生多肽和修饰产物识别，另外，表明它们与sfhdac3在进化和功能上具有相关性，被认为具有同样的作用模式。
[0139]
实施例4、转ghjaz8植物的制备及其抗虫性鉴定
[0140]
1、转ghjaz8植物的构建
[0141]
植物表达载体为pmdc100载体(biovector，货号：cd3-746)，该植物表达载体含有1套camv35s启动子控制nptii基因的植物表达元件、1套ghjaz8自身启动子、终止子控制目标基因ghjaz8的植物表达元件。
[0142]
pmdc100-ghjaz8(如图10所示)为将seq id no.4所示的ghjaz8基因插入pmdc100载体的attr1和attr2位点间得到的载体。pro：ghjaz8的启动子(seq id no:19)；term：ghjaz8的终止子(seq id no:20)。35s：来源于花椰菜花叶病毒camv的植物组成性启动子(seq id no:26)；nptii代表新霉素磷酸转移酶基因，具有卡拉霉素抗性(seq id no:27)；t-nos：nos终止子(seq id no:28)；lb：t-dna左边界；rb：t-dna右边界；植物表达载体为pmdc100载体。
[0143]
再将pmdc100-ghjaz8用电激法导入农杆菌lba4404菌株，得到重组农杆菌。
[0144]
再将重组农杆菌用下胚轴转化方法分别转化水稻(受体品种：日本晴，转化方法文献：zhao w,zheng s,ling h q.an efficient regeneration system and agrobacterium-mediated transformation of chinese upland rice cultivar handao297.plant cell tissue&organ culture.2011,106(3):475.)、玉米(受体品种：b73，转化方法文献：lee h,zhang zj.agrobacterium-mediated transformation of maize(zea mays)immature embryos.methods mol biol.2014；1099:273-280.)、棉花(受体品种：zm24，转化方法文献：yang z,ge x,yang z,qin w,sun g,wang z,li z,liu j,wu j,wang y,lu l,wang p,mo h,zhang x,li f.extensive intraspecific gene order and gene structural variations in upland cotton cultivars.nat commun.2019jul 5；10(1):2989.doi:10.1038/s41467-019-10820-x.pmid:31278252；pmcid:pmc6611876.)和烟草(受体品种：本氏烟，转化方法文献：sunilkumar g,vijayachandra k,veluthambi k.preincubation of cut tobacco leaf explants promotes agrobacterium-mediated transformation by increasing vir gene induction.plant science,1999.141(1):51-58.)：依次为培养无菌苗、制备外植体，农杆菌液浸染植物外植体，然后经过脱分化形成抗性愈伤组织，再生成苗，最后获得抗性植株，得到t0代转ghjaz8水稻、t0代转ghjaz8玉米、t0代转ghjaz8棉花和t0代转ghjaz8烟草。
[0145]
2、分子鉴定
[0146]
待t0代转ghjaz8水稻(ghjaz8转基因水稻)、t0代转ghjaz8玉米(ghjaz8转基因玉米)、t0代转ghjaz8棉花(ghjaz8转基因棉花)和t0代转ghjaz8烟草(ghjaz8转基因烟草)移栽成活并生长到营养生长期，取0.5g叶片提取基因组dna，以跨载体引物(ghjaz8-f：ggtttacccgccaatatatcc，ghjaz8-r：tcaattcgaacatggctataac进行pcr扩增。
[0147]
检测扩增产物，结果如图11所示，m为dna marker，从上到下依次为5000、3000、2000、1000、750、500、250、100bp。引物为跨载体引物，得到产物大小为967bp为阳性转基因植物，说明植物表达载体的t-dna区段已经整合到转基因水稻、玉米、棉花和烟草基因组中，
转基因植物构建成功。
[0148]
3、抗虫鉴定
[0149]
分别培育t0代阳性转基因材料至t3代转ghjaz8水稻、t1代转ghjaz8玉米、t2代转ghjaz8棉花和t3代转ghjaz8烟草。
[0150]
1)转ghjaz8水稻
[0151]
t3代转ghjaz8水稻和野生型水稻(品种名称：日本晴)长势一致(生长约1月龄)的整盆的水稻幼苗，每盆接入初孵化草地贪夜蛾取幼虫50头，设置3次重复，置于人工温室，接虫第7天拍照。
[0152]
ghjaz8转基因水稻和野生型水稻在草地贪夜蛾取食后第7天的表型差异明显，如图12所示，左侧为野生型水稻，右侧为t3代转ghjaz8水稻，被草地贪夜蛾取食的野生型水稻整盆植株死亡，幼虫已生长至3龄，幼虫发育良好；相比较的，t3代转ghjaz8水稻生长受影响不明显，且t3代转ghjaz8水稻植株上未观察到活虫。
[0153]
采用室内离体稻株测定法，取足量的t3代转ghjaz8水稻不同株系(株系1、株系2和株系3)幼嫩的稻株(生长约1月龄)叶片放入大的培养皿中，每皿接入初孵化稻纵卷叶螟幼虫30头，设置10次重复，置于人工气候箱，隔天更换对应生育期的新鲜叶片，接虫第7天记录幼虫存活数，计算幼虫死亡率。校正死亡率％＝(取食ghjaz8转基因材料试虫死亡率％-取食野生型对照试虫死亡率％)/(1-取食野生型对照试虫死亡率％)
×
100。
[0154]
结果如图13所示，对照：取食野生型水稻后的稻纵卷叶螟校正死亡率；株系1-3分别为t3代转ghjaz8水稻不同株系编号，稻纵卷叶螟取食ghjaz8转基因水稻后的校正死亡率达到了高抗级别，株系1对稻纵卷叶螟的校正死亡率达到82.33％。
[0155]
2)转ghjaz8棉花
[0156]
t2代转ghjaz8棉花(oe)和野生型棉花(wt，品种名称：zm24)长势一致的整盆的棉花幼苗，每盆接入初孵化草地贪夜蛾取幼虫50头，设置3次重复，置于人工温室，接虫第7天对幼虫取材并解剖肠道。制作中肠组织切片，棉铃虫中肠组织结构tunnel-if染色，绿色荧光标记为死亡细胞，蓝色为细胞核信号，绿色为死亡细胞的阳性着色。
[0157]
结果如图14所示，取食野生型棉花叶片的棉铃虫的中肠细胞表型正常，而取食ghjaz8转基因棉花的棉铃虫的中肠细胞大量死亡，死亡细胞(右图圈内)的绿色荧光信号很强。
[0158]
3)转ghjaz8玉米
[0159]
t1代转ghjaz8玉米(oe)和野生型玉米(wt，品种名称：b73)长势一致的整盆的玉米幼苗，每盆接入初孵化草地贪夜蛾取幼虫50头，设置3次重复，置于人工温室，接虫第7天对幼虫取材并解剖肠道。方法同转ghjaz8棉花，草地贪夜蛾中肠组织结构tunnel染色。tunel，(tdt-mediated dutp nick-end labeling，脱氧核苷酸末端转移酶介导的dutp缺口末端标记技术)。tunnel明场染色：蓝紫色为细胞核着色，棕色着色为阳性着色(细胞凋亡)。
[0160]
结果如图15所示，取食t1代转ghjaz8玉米叶片后的草地贪夜蛾的中肠细胞也出现了大量死亡的表型(右图圈内)。
[0161]
4)转ghjaz8烟草
[0162]
t3代转ghjaz8烟草(oe)和野生型烟草(wt，品种名称：本氏烟)长势一致的整盆的烟草幼苗，每盆接入初孵化草地贪夜蛾取幼虫50头，设置3次重复，置于人工温室，接虫第7
天对幼虫取材并解剖肠道。草地贪夜蛾中肠组织结构he染色(40倍)。he染色即为苏木素-伊红染色；苏木素染细胞核，着色本身为蓝色；伊红染细胞质，着色为紫红色。
[0163]
结果如图16所示，a为取食野生型烟草叶片后的草地贪夜蛾中肠组织表型，b为取食t3代转ghjaz8烟草叶片后的草地贪夜蛾中肠组织表型；对取食t3代转ghjaz8烟草后的草地贪夜蛾幼虫的中肠组织切片发现，草地贪取食t3代转ghjaz8烟草后的中肠肠壁细胞层出现明显的衰退，柱状细胞脱落、膨大，杯状细胞裂解，细胞间出现间隙(右图圈内)。
[0164]
综上，表明ghjaz8转基因水稻、玉米、棉花和烟草对草地贪夜蛾、棉铃虫、稻纵卷叶螟等多种鳞翅目害虫具有良好抗性。

技术特征：
1.含有ngr结构域的ghjaz蛋白或其编码核酸或重组载体、表达盒或重组菌或以所述ghjaz蛋白为活性成分的物质在如下至少一种中的应用：1)杀虫；2)抗虫；3)制备杀虫或抗虫产品；4)提高植物抗虫性；5)培养抗虫植物；所述ngr结构域的氨基酸序列为seq id no:17。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述含有ngr结构域的ghjaz蛋白为如下任一种：1)seq id no:5、seq id no:7、seq id no:9、seq id no:11、seq id no:13或seq id no:15所示的蛋白；2)将1)所示蛋白的氨基酸序列末端添加标签序列且具有相同活性的由a衍生的蛋白；3)所述的蛋白为与1)具有至少95％，98％，99％的序列一致性，且含有seq id no:17所示多肽的蛋白。3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述编码核酸是如下1)-3)中任一种的dna分子：1)编码区为seq id no:6、seq id no:8、seq id no:10、seq id no:12、seq id no:14或seq id no:16所示的dna分子；2)在严格条件下与1)所示的限定的dna序列杂交且编码具有相同功能蛋白质的dna分子；3)与1)所示的限定的dna序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且编码具有相同功能蛋白质的dna分子。4.根据权利要求1-3中任一所述的应用，其特征在于：所述虫为植物害虫；和/或，所述植物害虫为鳞翅目害虫。5.一种培育抗虫性转基因植物的方法，为如下1)或2)：1)所述的方法包括如下步骤：提高目的植物中含有ngr结构域的ghjaz蛋白的含量和/或活性，得到转基因植物；2)所述的方法包括如下步骤：提高目的植物中编码含有ngr结构域的ghjaz蛋白的核酸分子的表达，得到转基因植物；所述转基因植物的抗虫性高于所述目的植物。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述虫为植物害虫；和/或，所述植物害虫为鳞翅目害虫。7.一种杀虫或抗虫方法，包括如下步骤：对虫施加含有ngr结构域的ghjaz蛋白，实现杀虫或抗虫。8.抑制含有ngr结构域的ghjaz蛋白中ngr结构域的表达的物质在降低含有ngr结构域
的ghjaz蛋白杀虫或抗虫性中的应用；或突变含有ngr结构域的ghjaz蛋白中ngr结构域的物质在降低含有ngr结构域的ghjaz蛋白杀虫或抗虫性中的应用。

技术总结
本发明公开了JAZ蛋白及其衍生物在农业害虫防控中的应用。本发明提供了含有NGR结构域的GhJAZ蛋白或其编码核酸或重组载体、表达盒或重组菌或以所述GhJAZ蛋白蛋白为活性成分的物质在如下至少一种中的应用：1)杀虫；2)抗虫；3)制备杀虫或抗虫产品；4)提高植物抗虫性；5)培养抗虫植物；本发明首次发现JAZ蛋白尤其是NGR-JAZ及其衍生多肽具有广谱抗虫性，国内外尚未见到相关报道，在重大农业害虫防控中具有重大应用价值。重大应用价值。


技术研发人员：李付广 任茂智 默辉娟
受保护的技术使用者：中国农业科学院棉花研究所
技术研发日：2022.03.17
技术公布日：2023/9/23