一种检测结核分枝杆菌的CDA引物组、试剂盒及其应用的制作方法

一种检测结核分枝杆菌的cda引物组、试剂盒及其应用
技术领域
1.本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种检测结核分枝杆菌的cda引物组、试剂盒及其应用。


背景技术：

2.结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis，mtb)是引起结核病的病原体，该菌可侵犯全身各器官，但以引起肺结核最多见。结核病是一种古老的疾病，全球广泛分布，是细菌感染性疾病致死的首位原因。
3.结核分枝杆菌的经典检测方法为分离培养，具体为将经中和集菌材料接种于固体培养基，器皿口加橡皮塞于37℃培养，每周观察1次。但结核分枝杆菌生长缓慢，一般需2～4周长成肉眼可见的落菌。其他较为快速和准确的方法，包括基于rt-pcr的针对结核分枝杆菌dna的扩增信号的检测，每毫升中只需含几个细菌即可检测到阳性，且1-2天即得出结果。但rt-pcr方法需要在标准生化分析实验室，使用精密的实时荧光pcr仪，并需要试剂准备、标本制备和pcr扩增检测三个独立的试验区，并不适用于现场快速筛查。此外，免疫检测技术所制成的试纸条具有简便快捷的优势，但该方法误检率高、灵敏度低，难于检测处于潜伏期的mtb携带者，可能造成疫情的扩散。因此，快速、灵敏、高特异性核酸标志物现场检测技术的研发，将对由结核分枝杆菌感染所导致的疾病提供快速有力的治疗手段。
4.基于闭合颈环介导的核酸恒温扩增技术(closed dumbbell mediated isothermal amplification of nucleic acids，cda)是由中国科学院大学宁波生命与健康产业研究院开发的新方法(中国专利号：zl202110473121.8)，可替代日本lamp核酸扩增方法。该方法主要利用2种不同的特异性引物识别靶基因的特定区域，在等温条件进行扩增反应。与常规基因检测手段(如pcr等)相比，cda反应在恒温水浴箱内便可完成，对仪器设备的要求较低，且操作简单，非专业人士也可准确地完成，适合于基层医疗机构及地方检验检疫部门。并且，cda还可以缩短操作时间，提高检测效率，降低样品污染的机率，适用于结核分枝杆菌的快速诊断。此外，cda所用关键成环引物约为30bp，较lamp(40bp)短，这将节省检测成本。


技术实现要素：

5.本发明的目的是，提供一种检测结核分枝杆菌的cda引物组、试剂盒及其应用。
6.本发明为实现上述目的所采用的技术方案如下：
7.本发明通过对表1所述的4对引物组进行筛选，获得对结核分枝杆菌检测效果最优的引物组为mtb-mf-3/mtb-mr-3。
8.表1
9.序列号引物名称核苷酸序列(5
’‑3‘’
)seq id no.1mtb-mf-1atcagccgcgtccagggttagccacactttgcgseq id no.2mtb-mr-1gtgctccttgagcctactacgaccacatcaaccg
tuberculosis strain sgf0702019chromosome(genbank:cp095023.1)，由2条引物组成，为序列内引物对(mtb-mf-3/mtb-mr-3)。本发明提供的引物组敏感性高、特异性强，由其制成的试剂盒能够快速、准确的检测到待测样品中是否含有结核分枝杆菌。
35.2，由于本发明提供的引物组具有极高的特异性，cda扩增所需时间短，进一步缩短了检测时间，且操作简易。
36.3，本发明提供的方法或试剂盒无需昂贵的仪器、也无需复杂的操作就可完成相关检测，因此，本发明所提供的可视化试剂盒将为专业性不高的机场、海关、社区等地的现场检测提供极大便利，可实现对结核分枝杆菌快速准确的检测。
附图说明
37.图1为本发明实施1中四对引物组扩增反应的荧光强度随反应时间变化的曲线图。
38.图2为本发明实施2中第3组引物扩增反应的荧光强度随反应时间变化的曲线图。
39.图3为本发明实施3中应用hnb进行反应基于颜色变化的终点监测图。
具体实施方式
40.下面结合实施例对本发明的技术方案进行详细说明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，可参照《分子克隆实验指南》(第三版)j.萨姆布鲁克一书中的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
41.实施例1应用eva green分别验证四对引物组对结核分枝杆菌基因dna片段的扩增反应
42.eva green同sybr green i类似，是一种结合于所有dsdna双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料，其对pcr等核酸扩增反应的抑制远小于后者。eva green的荧光信号强度与双链dna的数量相关。在游离状态下，eva green发出微弱的荧光，但与双链dna结合后，其荧光大大增强。因此，可以根据荧光信号检测出核酸扩增体系存在的双链dna数量。
43.单管反应溶液组合如下(其余加入ddh2o至25μl)：
44.20mm tris-hcl ph8.8
45.10mm kcl
46.10mm(nh4)2so447.14mm mgso448.0.1％triton x-100
49.1m甜菜碱
50.1.25mm dntp
51.8u bst dna聚合酶(new england biolabs)
52.1x eva green(biotum)
53.单管使用引物：
54.1600nm mtb-mf-1(seq id no.1所示)
55.1600nm mtb-mr-1(seq id no.2所示)；
56.1600nm mtb-mf-2(seq id no.3所示)
57.1600nm mtb-mr-2(seq id no.4所示)；
58.1600nm mtb-mf-3(seq id no.5所示)
59.1600nm mtb-mr-3(seq id no.6所示)；
60.1600nm mtb-mf-4(seq id no.7所示)
61.1600nm mtb-mr-4(seq id no.8所示)。
62.靶：结核分枝杆菌基因组dna dsdna(seq id no.9所示)。
63.seq id no.9：
64.gatcagcgatcgtggtcctgcgggctttgccgcgggtggtcccggacaggccgagtttggtcatcagccgttcgacggtgcatctggccacctcgatgccctcacggttcagggttagccacactttgcgggcaccgtaaacaccgtagttggcggcgtggacgcggctgatgtgctccttgagttcgccatcgcgcagctcgcggcggctgggctcccggttgatgtggtcgtagtaggtcgatggggcgatcggcacacccagctcggtcagctgtgtgcagatcgactcgacaccccaccgcaaaccatcggggcc
65.同时四对引物组分别设置无靶的对照组。
66.设置slan 96real time pcr反应温度恒定为63℃，反应时间为60min。检测结果如图1，通过图1可以发现：四组引物组的阳性组均出现扩增，而第2组引物组有假阳性出现，第3组引物组出现扩增ct值最快。结果表明：本发明提供的第3组引物组可实现对结核分枝杆菌基因的快速扩增，且阴性对照组无假阳性出现，将荧光检测应用于其中可进行实时监测，通过实时扩增曲线可提前判断结果。
67.实施例2应用eva green验证第3组引物组对结核分枝杆菌基因dna片段的扩增反应(重复实验)
68.方法同实施例1。
69.单管反应溶液组合如下(其余加入ddh2o至25μl)：
70.20mm tris-hcl ph8.8
71.10mm kcl
72.10mm(nh4)2so473.14mm mgso474.0.1％triton x-100
75.1m甜菜碱
76.1.25mm dntp
77.8u bst dna聚合酶(new england biolabs)
78.1x eva green(biotum)
79.单管使用引物：
80.1600nm mtb-mf-3(seq id no.5所示)
81.1600nm mtb-mr-3(seq id no.6所示)；
82.同时设置有靶和无靶的对照组各8组，反应溶液组合同实施例1。靶：结核分枝杆菌基因组dna dsdna(seq id no.9所示)。
83.设置slan 96real time pcr反应温度恒定为63℃，反应时间为60min。对引物组3进行8个阴性的重复实验，无假阳性出现，重复性较好，并进行8个阳性的对照实验，其荧光强度随反应时间变化的曲线如图2所示。图2结果表明：本发明提供的第3组引物组可实现对
结核分枝杆菌基因的准确检测，荧光检测可实现实时监测，通过实时扩增曲线可提前判断结果。
84.实施例3应用羟基萘酚兰(hnb)进行结核分枝杆菌cda扩增反应终点监测
85.羟基萘酚兰(hnb)属于金属离子指示剂，是针对反应中与副产物焦磷酸盐结合的镁离子或者锰离子量的变化，从而呈现不同指示颜色以实现对结果的判断。
86.应用羟基萘酚兰(hnb)进行结核分枝杆菌cda扩增的反应溶液的组合如下所示。
87.方法同实施例1。
88.单管反应溶液组合如下(其余加入ddh2o至25μl)：
89.20mm tris-hcl ph8.8
90.10mm kcl
91.10mm(nh4)2so492.14mm mgso493.0.1％triton x-100
94.1m甜菜碱
95.1.25mm dntp
96.8u bst dna聚合酶(ne w england biolabs)
97.120μm hnb
98.单管使用引物：
99.1600nm mtb-mf-3(seq id no.5所示)
100.1600nm mtb-mr-3(seq id no.6所示)；
101.同时设置有靶和无靶的对照组各8组，反应溶液组合同实施例1。靶：结核分枝杆菌基因组dna dsdna(seq id no.9所示)。
102.设置slan 96real time pcr反应温度恒定为63℃，反应时间为60min。
103.扩增反应设置8个阴性对照和8个阳性对照。设置恒温水浴锅反应温度恒定为63℃，反应时间为60min。阴阳性反应终点结果如图3所示，其中，颜色为紫罗兰表示阴性，天蓝色表示阳性。实验结果表明：使用hnb可通过颜色直观地判断反应结果，无需仪器辅助即可进行判读。
104.上述仅为本发明的部分优选实施例，本发明并不仅限于实施例的内容。对于本领域中的技术人员来说，在本发明技术方案的构思范围内可以有各种变化和更改，所作的任何变化和更改，均在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种非疾病诊断目的的检测结核分枝杆菌的cda引物组，其特征在于：所述引物组为mtb-mf-3/mtb-mr-3，其中mtb-mf-3的核苷酸序列如seq id no.5所示，mtb-mr-3的核苷酸序列如seq id no.6所示。2.一种检测结核分枝杆菌的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括权利要求1所述的cda引物组。3.如权利要求2所述的一种检测结核分枝杆菌的试剂盒，其特征在于：所述cda引物组中的引物mtb-mf-3和mtb-mr-3在反应体系中的浓度均为1～2μm。4.如权利要求2所述的一种检测结核分枝杆菌的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括bst聚合酶、cda反应缓冲液、超纯水和显色剂。5.如权利要求4所述的一种检测结核分枝杆菌的试剂盒，其特征在于：所述显色剂选自sybrgreeni、eva green、羟基萘酚蓝、铬黑t中的一种。6.如权利要求4所述的一种检测结核分枝杆菌的试剂盒，其特征在于：所述cda反应缓冲液包括tris-hcl、kcl、(nh4)2so4、mgso4和tritonx-100。7.如权利要求2所述的一种检测结核分枝杆菌的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒反应体系的组成为：2～50mm tris-hclph8.82～20mm kcl2～20mm(nh4)2so42～20mm mgso40.1～0.5％tritonx-1000.2～1m甜菜碱1～1.6mm dntp5～10u bst dna聚合酶100～150μmol/l显色剂1～2μm引物mtb-mf-31～2μm引物mtb-mr-3反应溶剂为超纯水。8.权利要求7所述的试剂盒用于非疾病诊断目的的检测结核分枝杆菌的方法，包括以下步骤：步骤1，将待检测核酸样本和试剂盒的反应体系混合，制得扩增反应液；步骤2，由步骤1制得的扩增反应液，于60～65℃反应20～80min，根据显色结果判断样品是否含有结核分枝杆菌。9.权利要求1所述的cda引物组在以非疾病诊断为目的的结核分枝杆菌检测中的应用。10.权利要求2-7任一项所述的试剂盒在以非疾病诊断为目的的结核分枝杆菌检测中的应用。

技术总结
本发明公开了一种检测结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)的CDA引物组、试剂盒及其应用。所述CDA引物组为针对结核分枝杆菌的保守区片段扩增的引物组，即MTB-MF-3/MTB-MR-3；其中，MTB-MF-3的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示，MTB-MR-3的核苷酸序列如SEQIDNO.6所示。本发明提供的引物组敏感性高、特异性强，由其制成的试剂盒能够快速、准确的检测到待测样品中是否含有结核分枝杆菌。另外，本发明所提供的可视化试剂盒将为专业程度不高的海关、口岸、边远地区等地的现场检测提供极大便利。供极大便利。供极大便利。


技术研发人员：毛瑞 蔡挺
受保护的技术使用者：国科宁波生命与健康产业研究院
技术研发日：2022.07.18
技术公布日：2023/9/23