一种检测单纯疱疹病毒II型的CDA引物组、试剂盒及其应用的制作方法

一种检测单纯疱疹病毒ii型的cda引物组、试剂盒及其应用
技术领域
1.本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种检测单纯疱疹病毒ii型的cda引物组、试剂盒及其应用。


背景技术：

2.单纯疱疹病毒ii型(herpes simplex virus ii，hsv2)是一种双链dna病毒，属于人疱疹病毒α亚科，单纯疱疹病毒属，根据抗原性的不同，分为2个亚型，即hsv1和hsv2型。其中，单纯疱疹病毒二型(hsv2)，主要引起生殖器部位皮肤黏膜及新生儿的感染，主要通过性接触和母婴垂直传播。单纯疱疹病毒具有嗜感觉神经节而形成潜伏感染状态的特性。本病多呈散发或原有潜伏病毒感染的反复发作。单纯疱疹病毒ii型的经典检测方法为分离培养，经过2～3天培养后，观察细胞病变。而基于原位核酸杂交或pcr法检测标本中的hsv dna，敏感性和特异性均高。但rt-pcr方法需要在标准生化分析实验室，使用精密的实时荧光pcr仪，并需要试剂准备、标本制备和pcr扩增检测三个独立的试验区，并不适用于现场快速筛查。此外，免疫检测技术所制成的试纸条具有简便快捷的优势，但该方法误检率高、灵敏度低，难于检测处于潜伏期的hsv2携带者，可能造成疫情的扩散。因此，快速、灵敏、高特异性核酸标志物现场检测技术的研发，将对由单纯疱疹病毒ii型感染所导致的疾病提供快速有力的治疗手段。
3.基于闭合颈环介导的核酸恒温扩增技术(closed dumbbell mediated isothermal amplification of nucleic acids，cda)是由中国科学院大学宁波生命与健康产业研究院开发的新方法(中国专利号：zl202110473121.8)，可替代日本lamp核酸扩增方法。该方法主要利用2种不同的特异性引物识别靶基因的特定区域，在等温条件进行扩增反应。与常规基因检测手段(如pcr等)相比，cda反应在恒温水浴箱内便可完成，对仪器设备的要求较低，且操作简单，非专业人士也可准确地完成，适合于基层医疗机构及地方检验检疫部门。并且，cda还可以缩短操作时间，提高检测效率，降低样品污染的机率，适用于单纯疱疹病毒ii型的快速诊断。此外，cda所用关键成环引物约为30bp，较lamp(40bp)短，这将节省检测成本。


技术实现要素：

4.本发明的目的是，提供一种检测单纯疱疹病毒ii型的cda引物组、试剂盒及其应用。
5.本发明为实现上述目的所采用的技术方案如下：
6.本发明通过对表1所述的4对引物组进行筛选，获得对单纯疱疹病毒ii型检测效果最优的引物组为hsv2-mf-2/hsv2-mr-2。
7.表1
8.序列号引物名称核苷酸序列(5
’‑3’
)seq id no.1hsv2-mf-1atcggccatcgccaaatacgccttagcagacc
seq id no.2hsv2-mr-1cccaatcgatggctcggctgaatgtggtaseq id no.3hsv2-mf-2cccgcgaaatatacgccttagcagaccseq id no.4hsv2-mr-2aagaaccttctggtaaacacgcttcacseq id no.5hsv2-mf-3ggccatcttaaaatacgccttagcagaseq id no.6hsv2-mr-3gatcccaatcatgtggtaaacacgcttseq id no.7hsv2-mf-4ctggtccaaaccaaatacgccttagcaseq id no.8hsv2-mr-4ctgaccgaccctcggctgaatgtggta
9.本发明还提供一种检测单纯疱疹病毒ii型的试剂盒，所述试剂盒包括cda引物组hsv2-mf-2和hsv2-mr-2。
10.作为优选实施方案，所述cda引物组中的引物hsv2-mf和hsv2-mr在反应体系中的浓度均为1～2μm。
11.作为优选实施方案，所述试剂盒还包括bst聚合酶、cda反应缓冲液、超纯水、以及显色剂。
12.作为优选实施方案，所述显色剂选自sybr green i、eva green、羟基萘酚蓝或铬黑t。
13.作为优选实施方案，所述cda反应缓冲液包括tris-hcl、kcl、(nh4)2so4、mgso4和triton x-100。
14.作为优选实施方案，所述试剂盒反应体系的组成为：
15.2～50mm tris-hclph8.8
16.2～20mm kcl
17.2～20mm(nh4)2so418.2～20mm mgso419.0.1～0.5％tritonx-100
20.0.2～1m甜菜碱
21.1～1.6mm dntp
22.5～10u bst dna聚合酶
23.100～150μmol/l显色剂
24.1～2μm引物hsv2-mf-2
25.1～2μm引物hsv2-mr-2
26.反应溶剂为超纯水。
27.本发明还提供该试剂盒用于非疾病诊断目的的检测单纯疱疹病毒ii型的方法，包括以下步骤：
28.步骤1，将待检测核酸样本和试剂盒的反应体系混合，制得扩增反应液；
29.步骤2，将步骤1所得扩增反应液，于60～65℃反应20～80min，根据显色结果判断样品是否含有单纯疱疹病毒ii型。
30.本发明还提供所述的cda引物组在以非疾病诊断为目的的单纯疱疹病毒ii型检测中的应用。
31.本发明还提供上述试剂盒在以非疾病诊断为目的的单纯疱疹病毒ii型检测中的应用。
32.与现有技术相比，本发明的有益效果为：
33.1，本发明提供的cda引物组针对单纯疱疹病毒ii型的特异保守区域human alphaherpesvirus 2 strain ms,complete genome(genbank:mk855052.1)，由2条引物组成，为序列内引物对(hsv2-mf-2/hsv2-mr-2)。本发明提供的引物组敏感性高、特异性强，由其制成的试剂盒能够快速、准确的检测到待测样品中是否含有单纯疱疹病毒ii型。
34.2，由于本发明提供的引物组具有极高的特异性，cda扩增所需时间短，进一步缩短了检测时间，且操作简易。
35.3，本发明提供的方法或试剂盒无需昂贵的仪器、也无需复杂的操作就可完成相关检测，因此，本发明所提供的可视化试剂盒将为专业性不高的机场、海关、社区等地的现场检测提供极大便利，可实现对单纯疱疹病毒ii型快速准确的检测。
附图说明
36.图1为本发明实施1中四对引物组扩增反应的荧光强度随反应时间变化的曲线图。
37.图2为本发明实施2中第2组引物扩增反应的荧光强度随反应时间变化的曲线图。
38.图3为本发明实施3中应用hnb进行反应基于颜色变化的终点监测图。
具体实施方式
39.下面结合实施例对本发明的技术方案进行详细说明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，可参照《分子克隆实验指南》(第三版)j.萨姆布鲁克一书中的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
40.实施例1应用eva green分别验证四对引物组对单纯疱疹病毒ii型基因dna片段的扩增反应
41.eva green同sybr green i类似，是一种结合于所有dsdna双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料，其对pcr等核酸扩增反应的抑制远小于后者。eva green的荧光信号强度与双链dna的数量相关。在游离状态下，eva green发出微弱的荧光，但与双链dna结合后，其荧光大大增强。因此，可以根据荧光信号检测出核酸扩增体系存在的双链dna数量。
42.单管反应溶液组合如下(其余加入ddh2o至25μl)：
43.20mm tris-hcl ph8.8
44.10mm kcl
45.10mm(nh4)2so446.14mm mgso447.0.1％triton x-100
48.1m甜菜碱
49.1.25mm dntp
50.8u bst dna聚合酶(new england biolabs)
51.1x eva green(biotum)
52.单管使用引物：
53.1600nm hsv2-mf-1(seq id no.1所示)
54.1600nm hsv2-mr-1(seq id no.2所示)；
55.1600nm hsv2-mf-2(seq id no.3所示)
56.1600nm hsv2-mr-2(seq id no.4所示)；
57.1600nm hsv2-mf-3(seq id no.5所示)
58.1600nm hsv2-mr-3(seq id no.6所示)；
59.1600nm hsv2-mf-4(seq id no.7所示)
60.1600nm hsv2-mr-4(seq id no.8所示)。
61.靶：单纯疱疹病毒ii型基因组dna dsdna(seq id no.9所示)。
62.seq id no.9
[0063][0064][0065]
同时四对引物组分别设置无靶的阴性对照组。
[0066]
设置slan 96real time pcr反应温度恒定为63℃，反应时间为60min。检测结果参见图1，通过图1可以发现：引物组1/2/3/4的阳性对照组均出现扩增，而引物组3有假阳性出现，引物组2的扩增效率最快，引物组1和4扩增较慢。结果表明：本发明提供的引物组2可实现对单纯疱疹病毒ii型基因的快速扩增，且阴性对照组无假阳性出现，将荧光检测应用于其中可进行实时监测，通过实时扩增曲线可提前判断结果。
[0067]
实施例2应用eva green验证引物组2对单纯疱疹病毒ii型基因dna片段的扩增反应(重复实验)
[0068]
方法同实施例1。
[0069]
单管反应溶液组合如下(其余加入ddh2o至25μl)：
[0070]
20mm tris-hcl ph8.8
[0071]
10mm kcl
[0072]
10mm(nh4)2so4[0073]
14mm mgso4[0074]
0.1％triton x-100
[0075]
1m甜菜碱
[0076]
1.25mm dntp
[0077]
8u bst dna聚合酶(new england biolabs)
[0078]
1x eva green(biotum)
[0079]
单管使用引物：
[0080]
1600nm hsv2-mf-2(seq id no.3所示)
[0081]
1600nm hsv2-mr-2(seq id no.4所示)。
[0082]
同时引物组2设置有靶和无靶的对照组各4组，反应溶液组合同实施例1。靶:单纯疱疹病毒ii型基因组dna dsdna(seq id no.9)。
[0083]
设置slan 96real time pcr反应温度恒定为63℃，反应时间为60min。对引物组2进行4个阴性的重复实验，无假阳性出现，重复性较好，并进行4个阳性的对照实验，其荧光强度随反应时间变化的曲线如图2所示。图2结果表明：本发明提供的引物组2可实现对单纯疱疹病毒ii型基因的准确检测，荧光检测可实现实时监测，通过实时扩增曲线可提前判断结果。
[0084]
实施例3应用羟基萘酚兰(hnb)进行单纯疱疹病毒ii型cda扩增反应终点监测
[0085]
羟基萘酚兰(hnb)属于金属离子指示剂，是针对反应中与副产物焦磷酸盐结合的镁离子或者锰离子量的变化，从而呈现不同指示颜色以实现对结果的判断。
[0086]
应用羟基萘酚兰(hnb)进行单纯疱疹病毒ii型cda扩增的反应溶液的组合如下所示。
[0087]
方法同实施例1。
[0088]
单管反应溶液组合如下(其余加入ddh2o至25μl)：
[0089]
20mm tris-hcl ph8.8
[0090]
10mm kcl
[0091]
10mm(nh4)2so4[0092]
14mm mgso4[0093]
0.1％triton x-100
[0094]
1m甜菜碱
[0095]
1.25mm dntp
[0096]
8u bst dna聚合酶(ne w england biolabs)
[0097]
120μm hnb
[0098]
单管使用引物：
[0099]
1600nm hsv2-mf-2(seq id no.3所示)
[0100]
1600nm hsv2-mr-2(seq id no.4所示)；
[0101]
同时设置有靶和无靶的对照组各4组，反应溶液组合同实施例1。靶:单纯疱疹病毒ii型基因组dna dsdna(seq id no.9)。
[0102]
设置slan 96real time pcr反应温度恒定为63℃，反应时间为60min。
[0103]
扩增反应设置4个阴性对照和4个阳性对照。设置恒温水浴锅反应温度恒定为63℃，反应时间为60min。阴阳性反应终点结果如图3所示，其中，颜色为紫罗兰表示阴性，天蓝色表示阳性。实验结果表明：使用hnb可通过颜色直观地判断反应结果，无需仪器辅助即可进行判读。
[0104]
上述仅为本发明的部分优选实施例，本发明并不仅限于实施例的内容。对于本领域中的技术人员来说，在本发明技术方案的构思范围内可以有各种变化和更改，所作的任何变化和更改，均在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种非疾病诊断目的的检测单纯疱疹病毒ii型的cda引物组，其特征在于：所述引物组为hsv2-mf-2/hsv2-mr-2，其中hsv2-mf-2的核苷酸序列如seq id no.3所示，hsv2-mr-2的核苷酸序列如seq id no.4所示。2.一种检测单纯疱疹病毒ii型的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括权利要求1所述的cda引物组。3.如权利要求2所述的一种检测单纯疱疹病毒ii型的试剂盒，其特征在于：所述cda引物组中的引物hsv2-mf-2和hsv2-mr-2在反应体系中的浓度均为1～2μm。4.如权利要求2所述的一种检测单纯疱疹病毒ii型的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括bst聚合酶、cda反应缓冲液、超纯水和显色剂。5.如权利要求4所述的一种检测单纯疱疹病毒ii型的试剂盒，其特征在于：所述显色剂选自sybr green i、eva green、羟基萘酚蓝、铬黑t中的一种。6.如权利要求4所述的一种检测单纯疱疹病毒ii型的试剂盒，其特征在于：所述cda反应缓冲液包括tris-hcl、kcl、(nh4)2so4、mgso4和triton x-100。7.如权利要求2所述的一种检测单纯疱疹病毒ii型的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒反应体系的组成为：2～50mm tris-hcl ph8.82～20mm kcl2～20mm(nh4)2so42～20mm mgso40.1～0.5％triton x-1000.2～1m甜菜碱1～1.6mm dntp5～10u bst dna聚合酶100～150μmol/l显色剂1～2μm引物hsv2-mf-21～2μm引物hsv2-mr-2反应溶剂为超纯水。8.权利要求7所述的试剂盒用于非疾病诊断目的的检测单纯疱疹病毒ii型的方法，包括以下步骤：步骤1，将待检测核酸样本和试剂盒的反应体系混合，制得扩增反应液；步骤2，由步骤1制得的扩增反应液，于60～65℃反应20～80min，根据显色结果判断样品是否含有单纯疱疹病毒ii型。9.权利要求1所述的cda引物组在以非疾病诊断为目的的单纯疱疹病毒ii型检测中的应用。10.权利要求2-7任一项所述的试剂盒在以非疾病诊断为目的的单纯疱疹病毒ii型检测中的应用。

技术总结
本发明公开了一种检测单纯疱疹病毒II型(HerpesSimplexVirusII，HSV2)的CDA引物组、试剂盒及其应用。所述CDA引物组为针对单纯疱疹病毒II型的保守区片段扩增的引物组，即HSV2-MF-2/HSV2-MR-2；其中，HSV2-MF-2的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，HSV2-MR-2的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。本发明提供的引物组敏感性高、特异性强，由其制成的试剂盒能够快速、准确的检测到待测样品中是否含有单纯疱疹病毒II型。另外，本发明所提供的可视化试剂盒将为专业程度不高的海关、口岸、边远地区等地的现场检测提供极大便利。检测提供极大便利。检测提供极大便利。


技术研发人员：毛瑞 蔡挺
受保护的技术使用者：国科宁波生命与健康产业研究院
技术研发日：2022.07.18
技术公布日：2023/9/23