弯曲芽胞杆菌在防治黄曲霉菌及毒素中的应用

1.本发明涉及植物病害生物防治技术领域，具体为弯曲芽胞杆菌在防治黄曲霉菌及毒素中的应用。


背景技术：

2.黄曲霉菌(aspergillus flavus)是自然界中常见的一种腐生性植物病原真菌，在田间和储藏期可侵染花生、玉米、大豆和小麦等多种粮食作物，导致作物霉变和污染，造成严重的经济损失。并且，黄曲霉菌还可产生高毒性的黄曲霉毒素，对人类和牲畜安全造成严重威胁。一次性摄入大量黄曲霉毒素可导致急性中毒事件，长期低剂量摄入黄曲霉毒素也会对健康造成损坏，诱发器官癌变反应等。有研究表明，2004年的肝癌患者中约有20％的患者是由黄曲霉毒素诱导患病的。另外，在2004-2005年间，肯尼亚有125人由于摄入黄曲霉毒素而死亡。黄曲霉菌对环境的适应能力强，并且菌丝生长迅速，菌核的抗逆性也很强，很容易侵染田间和储藏期的粮食作物。黄曲霉菌的产孢能力较强，其侵染作物后可产生大量的分生孢子，这些分生孢子可再次侵染作物导致发病，造成二次污染。因此，有效预防黄曲霉菌的侵染对作物的储藏条件要求较高，在实际生产中由于各种因素很难达到要求。据统计，在非洲的布隆迪和刚果地区，在244份当地市场购买的谷物、牛奶和其它食物样品中全部检测出了黄曲霉菌，并且在这些样品中，有一半以上的谷物中aft的含量超过了欧盟规定的最高限量标准。2014年国内各产区玉米抽样中均检出aft，其中，华中地区玉米样品的污染最严重，afb1检出率高达100％，超标率达85.7％(食用玉米及其制品》20μg/kg)。
3.黄曲霉菌通过污染粮食作物进一步危害人类的健康，目前多个国家已出台了食品中aft污染的最高限量标准，这在一定程度上减少了aft的危害，但无法从根源上解决黄曲霉的污染问题。目前主要可以通过控制储藏条件、培育抗病植株和化学药剂处理等来减少作物中黄曲霉菌的污染。粮食在储藏过程中籽粒的湿度、环境中的温度和湿度以及透气性都能影响黄曲霉菌的侵染，在实际生产过程中由于气候等环境因素的影响很难保证作物不被污染；目前培育抗病植株的研究进展缓慢，也不能成为防治黄曲霉菌污染的主要方法；化学药剂处理可有效预防黄曲霉菌的侵染，但是会导致有害物质的残留，污染环境。目前已报道多种微生物具有高效生防效果，并且已有菌株被注册为商品化生防菌株，利用微生物来抑制黄曲霉菌的侵染具有很高的应用前景。微生物具有个体小、生长迅速、繁殖快等优点，并且有些微生物能产生大量的抑菌性气体代谢物，这些代谢物质的分子量相对较小，可以穿过缝隙渗透到每个粮食作物籽粒上，从而高效预防黄曲霉菌的侵染。然而，目前筛选到的具有抑菌作用的菌株及抑菌挥发物较少，为了发现更多菌株的利用价值，进一步提高菌株的利用效率，我们从自然界中筛选出抑菌微生物，研究其产气特性和抑菌作用，研究其对储藏期黄曲霉菌的防治作用。


技术实现要素：

4.鉴于现有技术中所存在的问题，本发明公开了弯曲芽胞杆菌在防治黄曲霉菌及毒
素中的应用，弯曲芽胞杆菌tr-1及其产生的挥发性气体物质，能够高效抑制储藏期花生和玉米等作物中黄曲霉菌的侵染和毒素的产生，并且其具有高效的广谱抑菌能力，能够抑制多种病原真菌的生长。
5.一种弯曲芽胞杆菌tr-1，采用的技术方案是，弯曲芽孢杆菌tr-1于2022年07月13号保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no：m20221103，保藏地址为武汉大学。
6.弯曲芽胞杆菌(bacillus flexus)tr-1的菌学特征：弯曲芽胞杆菌tr-1为革兰氏阳性菌，可以利用葡聚糖、d-麦芽糖、d纤维二糖、龙胆二糖、肌苷等，可利用d-葡萄糖酸和柠檬酸等，能耐受nacl，不能耐受ph5的酸性环境，能耐受盐酸胍和氯化锂等。
7.对菌株tr-1的16s rdna序列进行测序分析，其核苷酸序列如序列表seq id no:1所示。
8.本发明从河南省信阳市信阳师范学院桃李园茶树根际采集土壤，采集土壤表层下大约10cm处土壤，通过微生物学方法，分离得到本发明的供试菌株tr-1。将菌株tr-1由20％(v/v)甘油保藏并置于-80℃冰箱进行长期保存。
9.菌株tr-1的筛选采用na纯化培养法，将1g新鲜的茶树根际土壤样品置于2ml离心管中，加入1ml无菌水混匀后梯度稀释至10-4
。取200μl菌悬液均匀涂布于na培养基表面，置于28℃培养箱中培养2天，挑取单菌落划线培养于na培养基上进行纯化。
10.na培养基为牛肉膏3.0g，胰蛋白胨10.0g，nacl、5.0g，琼脂15.0g，蒸馏水定容至1l，调ph至7.2。
11.一种弯曲芽胞杆菌tr-1，在抑制多种病原真菌的生长、及抑制储藏期作物黄曲霉菌及毒素方面的应用。
12.本发明的供试真菌为禾谷镰刀菌(fusarium graminearum)、轮状镰刀菌(fusarium verticillioides)、大豆炭疽菌(colletotrichum graminicola)、芒果炭疽菌(colletotrichum fructicola)、烟曲霉菌(alternaria alternata)和灰霉菌(botrytis cinerea)。
13.本发明使用的玉米品种为郑单958，花生品种为四粒红。
14.弯曲芽胞杆菌tr-1的代谢产物包括苯、硫代乙酸甲酯、二甲基二硫、硫代丁酸甲酯、3-甲基硫代丁酸s-甲酯和二甲基三硫。
15.弯曲芽胞杆菌tr-1的代谢产物在抑制黄曲霉菌中的应用。
16.本发明检测了菌株tr-1对黄曲霉菌菌丝以及其它六种真菌菌丝的高效抑制作用。鉴定了tr-1产生的挥发性抑菌代谢产物以及这些产物各自的抑菌能力。在密闭储藏条件下，分析了tr-1对作物黄曲霉的抑制作用及毒素残留量等相关内容。
17.本发明的有益效果：本发明通过分离的弯曲芽胞杆菌tr-1为土壤细菌，是从土壤中分离得到的一种高效抑菌微生物，可作为作物储藏期真菌病害的生防菌株应用；本发明首次证明分离的弯曲芽胞杆菌tr-1可产挥发性抑菌物质，且在密闭环境下可有效的抑制黄曲霉菌菌丝的生长；本发明分离到的弯曲芽胞杆菌tr-1抑菌效果显著，在密闭空间内，可高效抑制花生和玉米上的黄曲霉发病与毒素的合成；本发明得到的弯曲芽胞杆菌tr-1可产生挥发性抑菌物质，通过气相色谱-质谱联用仪确定硫代乙酸甲酯、二甲基二硫和3-甲基硫代丁酸s-甲酯为关键抑菌物质；本发明得到的弯曲芽胞杆菌tr-1产生的二甲基二硫、硫代丁
酸甲酯和二甲基三硫抑菌效果显著，分别在50μg/l(物质重量/空间体积)、200μg/l和10μg/l的浓度下可完全抑制黄曲霉菌菌丝生长和孢子萌发，抑菌率达100％；弯曲芽胞杆菌tr-1产生的苯和硫代乙酸甲酯的抑菌效果明显，分别在200μg/l和50μg/l的浓度下显著抑制黄曲霉菌菌丝生长和孢子萌发，抑制率达90％以上。
18.进一步的，本发明的弯曲芽胞杆菌tr-1具有很好的抑菌作用，在密闭储藏环境条件下可抑制作物黄曲霉的发病和产毒。该菌株可应用于防治作物储藏期的霉菌污染，同时可延伸应用于其他粮食作物和水果等的安全储藏和运输。
附图说明
19.图1为弯曲芽胞杆菌tr-1菌株与其近缘种菌株16s rdna序列的系统发育树分析；
20.图2为弯曲芽胞杆菌tr-1菌株的形态学观察；
21.图3为弯曲芽胞杆菌tr-1对af菌丝生长的抑制作用分析；
22.图4为添加活性炭后弯曲芽胞杆菌tr-1抑制作用分析；
23.图5为弯曲芽胞杆菌tr-1产挥发性物质的气相色谱质谱联用仪检测结果；
24.图6为tr-1挥发物对af菌丝生长的最低抑菌浓度分析；
25.图7为弯曲芽胞杆菌tr-1对不同水活度花生籽粒和玉米籽粒黄曲霉菌的抑制图；
26.图8为花生表面黄曲霉的扫描电镜分析；
27.图9为弯曲芽胞杆菌tr-1对六种不同真菌菌丝生长的抑制作用，其中fg为禾谷镰刀菌(fusarium graminearum)、fv为轮状镰刀菌(fusarium verticillioides)、cg为大豆炭疽菌(colletotrichum graminicola)、cf为芒果炭疽菌(colletotrichum fructicola)、aa为烟曲霉菌(alternaria alternata)、bc为灰霉菌(botrytis cinerea)。
具体实施方式
28.实施例1
29.菌株tr-1的分离和菌学鉴定
30.(1)供试菌株与植物材料
31.本发明从河南省信阳市信阳师范学院桃李园茶树根际采集土壤，采集土壤表层下大约10cm处土壤，通过微生物学方法，分离得到本发明的供试菌株tr-1。将菌株tr-1由20％(v/v)甘油保藏并置于-80℃冰箱进行长期保存。
32.菌株tr-1的筛选采用na纯化培养法，将1g新鲜的茶树根际土壤样品置于2ml离心管中，加入1ml无菌水混匀后梯度稀释至10-4
。取200μl菌悬液均匀涂布于na培养基(牛肉膏3.0g，胰蛋白胨10.0g，nacl 5.0g，琼脂15.0g，蒸馏水定容至1l，调ph至7.2)表面，置于28℃培养箱中培养2天，挑取单菌落划线培养于na培养基上进行纯化。
33.本发明的供试真菌为禾谷镰刀菌(fusarium graminearum)、轮状镰刀菌(fusarium verticillioides)、大豆炭疽菌(colletotrichum graminicola)、芒果炭疽菌(colletotrichum fructicola)、烟曲霉菌(alternaria alternata)和灰霉菌(botrytis cinerea)。
34.本发明使用的玉米品种为郑单958，花生品种为四粒红。
35.(2)tr-1菌株的形态特征鉴定
36.tr-1菌株于na培养基培养48h后，如图2所示，可见菌落呈圆形，黄色，表面光滑潮湿，革兰氏染色阳性。
37.tr-1的分子生物学鉴定
38.挑取tr-1单菌落，接种于10ml nb培养液(牛肉膏3.0g，胰蛋白胨10.0g，nacl 5.0g，蒸馏水定容至1l；调ph至7.2)中，在30℃，180rpm条件下摇培12h，收集2ml菌悬液并于12000rpm离心3min。弃去上清后收集沉淀物用于dna提取。采用tris-hcl(amresco公司)和edta法提取基因组dna，提取后用利用16s rdna通用引物27f(agagtttgatcctggctcag)和1541r(aaggaggtgatccagccgca)扩增保守序列，并送武汉天一辉远生物公司进行测序。测序显示菌株tr-1序列长度为1490bp，具体序列如seq id no.：1所示。
39.在genbank数据库中，将菌株tr-1的16s rdna序列进行blast检索，结果显示菌株tr-1与芽胞杆菌属细菌同源性较高，初步确定其为芽胞杆菌属细菌，选取该属中与tr-1同源性较高的菌株并利用mega软件进行系统发育树分析。菌株tr-1的16s rdna序列系统发育分析结果如图1所示，图1显示菌株tr-1与选取的高同源性菌株bacillus flexus sbmp3聚成一支，表明菌株tr-1与菌株bacillus flexus sbmp3亲缘关系最近，因此暂将该菌株命名为弯曲芽胞杆菌tr-1，bacillus flexus tr-1，并于2022年07月13号保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no：m20221103。
40.菌株tr-1的生理生化鉴定
41.为进一步确定该菌株的分类地位，使用biolog microstation
tm
system微生物鉴定仪进行生理生化特性分析。将菌株tr-1在na培养基上进行活化，12h后用棉签沾取单菌落并接种至if-a gen iii inoculating fluid培养液混合均匀，转接种到biolog gen iii培养板中，每孔加入120μl菌悬液，37℃下培养16h，用biolog微生物鉴定系统检测菌株tr-1的生理生化特性，与数据库中已鉴定微生物进行比对分析，选取生理生化反应相似度最高的种进行比对。生理生化检测结果如表1。
42.生理生化分析结果显示，菌株tr-1与biolog microstation
tm
system系统中的菌种bacillus flexus具有相似的生理生化特征。其中，在对d-麦芽糖、d-海藻糖、d-纤维二糖、龙胆二糖和d-甘露醇等的利用上，菌株tr-1反应与菌株bacillus flexus反应强烈度相同，在对醋竹桃霉素、二甲胺四环素、氨曲南和1％乳酸钠等物质的耐受性实验中，菌株tr-1与菌株bacillus flexus也具有相同的反应结果，菌株tr-1与bacillus flexus耐受不同浓度nacl溶液的能力相似，并且两种菌株都不能在ph5的酸性环境中生存，而都能在ph6的酸性环境中存在。因此，菌株tr-1具有与菌株bacillus flexus相似的生理生化反应，可能为同一分类单元。
43.表1菌株tr-1的生理生化鉴定
44.综上所述，经形态特征分析、系统发育树分析和生理生化特征分析，菌株tr-1与现有鉴定菌种相比，与bacillus flexus菌株存在明显相同点，推断tr-1可能与bacillus flexus位于同一种属，因此暂命名为弯曲芽胞杆菌(bacillus flexus)。
45.实施例2
46.弯曲芽胞杆菌tr-1对黄曲霉的抑菌作用
47.弯曲芽胞杆菌tr-1抑制黄曲霉菌丝生长的实验
48.本实验采用培养皿(直径9cm)对扣方式进行。挑取白色的黄曲霉菌丝团，接种于含pda(去皮马铃薯200.0g，沸水煮20min，纱布过滤收集滤液，添加葡萄糖20.0g，琼脂15.0g，蒸馏水定容至1l，不调ph)的培养皿中央。将纯化培养的菌株tr-1用无菌水从培养基上冲洗下来，并将其菌悬液(100μl,od600＝1.8)涂布于na培养基表面。将接种黄曲霉菌丝块的培养皿对扣于涂布tr-1的培养皿之上，透明胶带封口保存。对照组中仅接种黄曲霉菌丝块，na培养基表面不涂菌液，每个处理重复3次，28℃黑暗条件下培养4天后计算不同处理的菌丝直径并计算抑菌率。抑菌率的计算公式如下：抑菌率(％)＝(对照菌丝直径-处理菌丝直径)/对照菌丝直径
×
100。
49.实验结果分析
50.实验结果如图3所示，图3显示，对照组中的黄曲霉菌丝生长旺盛，菌丝直径达5cm，而接种菌株tr-1的处理组中黄曲霉菌丝没有生长，即菌株tr-1对黄曲霉菌丝的生长有显著抑制作用，抑制率达100％。培养过程中菌株tr-1在不与黄曲霉菌丝接触的情况下能完全抑制黄曲霉菌丝的生长，说明tr-1产生了挥发性气体物质，这些物质能抑制黄曲霉菌的生长。
51.实施例3
52.弯曲芽胞杆菌tr-1活性炭吸附实验
53.本实验采用分隔皿进行对扣培养(培养皿盖采用不分隔皿，用于接种真菌；培养皿底采用分隔皿，用于涂布细菌和添加活性炭)方式进行。活性炭(carbon,c)实验分为af，af+c，af+tr-1，af+tr-1+c四组进行处理。四组实验的不分隔皿盖均倒入15ml pda培养基，并接种大小均一的黄曲霉菌菌丝团。将纯化培养的菌株tr-1用无菌水冲洗后制成菌悬液，并涂布于na培养基上。af+c处理组中分隔皿底一侧放入6.0g活性炭，另一侧空白；af+tr-1组中
分隔皿底一侧倒入na培养基并均匀涂布tr-1(50μl，od600＝1.8)菌液，另一侧空白；af+tr-1+c组中分隔皿底一侧倒入na培养基并均匀涂布tr-1(50μl,od600＝1.8)，另一侧加入6.0g活性炭。将接种黄曲霉菌丝团的不分隔皿盖与不同处理的分隔皿底分别对扣，并用胶带封口保存，置于28℃培养箱中进行培养。每个处理有2个重复。培养4天后，统计菌丝直径，计算抑菌率。
54.活性炭吸附实验结果如图4所示，上方柱形图是在28℃条件下培养4天后统计的菌丝直径；下方图中，af为接种黄曲霉菌对照组，af+c为黄曲霉菌添加活性炭处理，af+tr-1为黄曲霉菌添加tr-1处理，af+c+tr-1为黄曲霉菌、活性炭和tr-1三者同时存在的抑菌效果分析。
55.四个处理中黄曲霉菌菌丝均有生长，尤其在af和af+c处理组中，菌丝生长最快，培养4天后，菌丝直径均达到5.1cm，二者之间没有显著差异，说明活性碳不影响黄曲霉菌丝的生长。在af+tr-1处理组中，培养4天后菌丝直径只有1.5cm，与对照组相比菌丝的生长明显受到抑制，表明菌株tr-1对黄曲霉菌丝的生长有抑制作用，且抑制率达70％；在af+tr-1+c处理组中，菌丝直径达2.6cm，与af组和af+c处理组相比菌丝生长受到抑制，但与af+tr-1处理组相比抑菌作用降低，抑菌率由70％降至47.06％，说明tr-1产生了挥发性抑菌物质，这些挥发性气体被活性炭吸附后浓度降低，抑菌率也降低。活性炭吸附实验充分证明弯曲芽胞杆菌tr-1产生的挥发性气体物质是其抑制黄曲霉菌丝生长的根本原因。
56.实施例4
57.弯曲芽胞杆菌tr-1挥发性气体检测
58.将100ml三角瓶中加入na培养基，灭菌后冷却至培养基凝固，将菌株tr-1均匀涂布于三角瓶中，将不接种tr-1的三角瓶作为对照，将所有三角瓶封口后置于28℃培养箱中培养24h，45℃的水浴锅中平衡20min，之后依次进行样品的萃取和gc-ms/ms检测，每个处理重复2次。
59.采用固相微萃取柱(spme)进行挥发性物质的富集。将spme的萃取头插入塑料薄膜之内，推出纤维头，使纤维头处于样品瓶上空的中间位置，吸附50min。将纤维头收回萃取头，并拔出样品瓶后转入气相色谱质谱联用仪(gc-ms)进样检测，检测参数设计如下。
60.gc-ms/ms条件：
61.a j&amp；whp-5ms弹性石英毛细管柱(30mm
×
0.25mm id，0.25μmthickness film)用于该实验。检测物质由国家标准与技术学会(nist 08)光谱库进行定性检索。
62.gc程序：进样口温度250℃；载气为氦气，柱流速1ml/min；不分流进样。程序升温条件：起始温度为60℃，保持2min后，以3℃/min的速度升温至150℃，保持3min后，再以10℃/min的速度升至280℃，保持2min，总时间为50min。
63.ms程序：离子源温度为230℃，四极杆温度150℃，电离方式：ei源，能量为70ev，采用全扫描的模式进行检测，检测范围为50-550amu。gc-ms检测后，通过观察对照组na培养基中气体物质和tr-1实验组中气体成分，即可对tr-1的挥发性化合物进行鉴定。检测结果如图5所示。
64.gc-ms/ms检测tr-1产生的挥发性气体物质，除去na培养基中检出的物质，即为tr-1产生的特异挥发性组分。由图5可知，实验中共检测到六种tr-1产生的特异性挥发物，分别为苯、硫代乙酸甲酯、二甲基二硫、硫代丁酸甲酯、3-甲基硫代丁酸s-甲酯和二甲基三硫，所
有物质都是分子量介于78-132道尔顿(d)之间的小分子物质(如表2所示)，易于挥发。其中，二甲基二硫的含量最高，达到39.72％，硫代乙酸甲酯的含量达到20％，3-甲基硫代丁酸s-甲酯的含量达到25.98％，其他三种物质的含量则不足5％。经分析，我们以这六种物质为主要产生代谢物质，分析其抑菌作用。目前购买到的标准品有五种，所以我们以组分1(苯)、组分2(硫代乙酸甲酯)、组分3(二甲基二硫)、组分4(硫代丁酸甲酯)和组分5(二甲基三硫)进行下一步的最低抑菌浓度实验。
65.表2.tr-1代谢产物的gc-ms/ms鉴定
66.*表示tr-1组检出特有挥发性物质，a:代谢物峰面积除以所有物质峰面积之和，b/c:代谢物质谱图与nist 17谱库中谱图的正向比对与反向比对结果得分值，最高值为1000。
67.实施例5
68.苯、硫代乙酸甲酯、二甲基二硫、硫代丁酸甲酯和二甲基三硫对黄曲霉菌的抑制作用分析
69.为分析菌株tr-1产生的挥发性气体物质的抑菌作用，购买苯、硫代乙酸甲酯、二甲基二硫、硫代丁酸甲酯和二甲基三硫标准品，进行抑菌试验。采用双皿对扣培养法，检测单成分对黄曲霉菌丝生长的抑制作用。将大小均一的黄曲霉菌丝团接种至pda培养基中央，分别取2μl、5μl、10μl、20μl、40μl购买的标准品加入不同的培养皿中，依次稀释至10μl/l，25μl/l，50μl/l、100μl/l和200μl/l(物质重量/空间体积)，然后将接种黄曲霉菌丝团的培养皿分别对扣于含不同标准品、同一标准品的不同浓度的培养皿之上(体积大约为200ml)，空白无菌水为对照。用胶布封口后，放在28℃条件下培养4天后，测量黄曲霉菌丝直径并计算抑菌率。
70.实验结果与分析：
71.不同浓度标准品对黄曲霉菌的抑制作用的结果如图6所示，测定不同稀释浓度下，每种化合物对黄曲霉菌菌丝的抑制活性，培养时间为4天。
72.五种物质均具有高效的抑菌作用，随着浓度的升高，抑菌效果逐渐增强。其中，二甲基三硫在10μg/l(物质质量/空间体积)，二甲基二硫在50μg/l，硫代丁酸甲酯在200μg/l时，即可完全抑制af菌丝的生长，表明其对af菌丝生长的最低抑菌浓度为别为10μg/l、50μg/l和200μg/l；苯和硫代乙酸甲酯虽然不能完全抑制af菌丝的生长，但是苯在200μg/l，硫代乙酸甲酯在50μg/l时，对af菌丝生长的抑制率可高达90％以上，表明其对af菌丝生长的最低抑菌浓度分别为200μg/l和50μg/l。其中，硫代丁酸甲酯和苯的最低抑菌浓度较高，而二甲基三硫、二甲基二硫和硫代乙酸甲酯的最低抑菌浓度较低。由表2可知，二甲基二硫在
抑菌气体中含量最高，推测二甲基二硫可能是tr-1菌株产生的主要抑菌气体。
73.实施例6
74.弯曲芽胞杆菌tr-1对花生和玉米黄曲霉菌和毒素的防治效果实验
75.样品制备：
76.1)分别称取两份花生籽粒和玉米籽粒于四个250ml三角瓶中，每份80g，于121℃和1.01mpa下灭菌20min，室温下静置冷却干燥；2)其中一份装有花生籽粒和玉米籽粒的两个三角瓶中接种新鲜收集的黄曲霉孢子液4ml(5
×
105cfu/ml)，调整水活度为0.8；另外一份三角瓶中接种黄曲霉孢子液8ml，调整水活度为0.9；3)将四个三角瓶均摇匀30min。
77.处理方法：
78.将不同水活度的花生和玉米分别分成两份，其中一份为对照组(ck)，另一份为tr-1实验组，所有实验均采用干燥器进行。干燥器底部和顶部均倒入40ml na培养基，凝固后向实验组培养基表面均匀涂布tr-1(200μl，od600＝1.8)菌液，空白na培养基为对照，实验组和对照组中部各放入四个培养皿，其中两皿中加入相同重量的接种黄曲霉孢子液的花生籽粒(分别在水活度0.8和0.9条件下进行)，另外两皿中加入相同重量的接种黄曲霉孢子液的玉米籽粒(分别在水活度0.8和0.9条件下进行)。凡士林封口，于28℃条件下培养7天，检测两种水活度下，处理组和对照组中花生籽粒和玉米籽粒的发病率。烘干后研磨检测黄曲霉毒素的含量。
79.黄曲霉毒素的提取：称取研磨的样品3g于聚丙烯塑料管中。用15ml已腈/水(84/16，v/v)抽提，拧紧管盖后蜗旋处理10min，超声处理60min后6000rpm离心10min。取上清1ml转移至新的离心管中，加入相同体积的正己烷后摇匀10min，静置20min分层后吸取下层有机相500μl，利用hplc-ms进行毒素定量分析。
80.实验结果与分析：
81.花生籽粒和玉米籽粒接种黄曲霉孢子培养后的结果如图7所示；图7中，ck为黄曲霉菌对照组，tr-1+ck为对照组中添加tr-1菌株处理，图为培养于28℃密闭条件下7天后的发病状况。
82.图7中，对照组中花生籽粒和玉米籽粒黄曲霉菌发病都很明显，两种水活度下花生籽粒和玉米籽粒均发病，且表面布满菌丝，发病率均高达100％。而tr-1处理组中，两种水活度下的花生籽粒和玉米籽粒表面均未见明显的发病现象，也未见有绿色孢子出现。这些结果表明，tr-1处理可显著抑制花生和玉米表面黄曲霉菌的侵染和发病。菌株tr-1产生的挥发性气体物质散布到黄生和玉米表面，高效抑制了黄曲霉菌的菌丝生长和孢子萌发，抑菌效果显著。
83.表3 tr-1对花生、玉米籽粒中黄曲霉产毒素的抑制作用
84.黄曲霉毒素检测结果如表3所示，在对照组花生和玉米中，水活度0.8和0.9条件下afb1和afb2均检出，并且花生中aft总量在两种水活度下分别为1785.64μg/kg和2438.69μg/kg，玉米中aft总量在两种水活度下分别为250.14μg/kg和144.37μg/kg。然而，在tr-1处理组中，两种水活度下花生籽粒和玉米籽粒中均未检测到afb1或afb2，表明tr-1对黄曲霉毒素的抑制率达到100％，在高水活度条件下，菌株tr-1依然能够完全抑制黄曲霉菌的生长和毒素的产生。
85.实施例7
86.弯曲芽胞杆菌tr-1对黄曲霉抑制作用的显微观察
87.为进一步观察黄曲霉菌的生长状况，选取水活度0.9条件下的花生籽粒进行扫描电镜观察。将培养7天后的对照组与tr-1处理组的花生籽粒取出，分别于0.1％(v/v)的锇酸中熏蒸固定1h，室温静置2h后用解剖刀切取一小块花生表皮，固定后将其表面喷金，干燥4h后进行扫描电镜观察(jsm-6390，日立，日本)。
88.花生表皮的扫描结果如图8所示。图8显示，对照组花生表面观察到大量黄曲霉菌丝和分生孢子头，分生孢子头着生有大量黄曲霉孢子，大多数孢子呈圆形，形态饱满，少数孢子表面有凹陷，表明孢子已经干燥，可能是由于长时间的培养导致缺水。tr-1处理组花生表面仅见少量孢子，为接种的原始孢子，且孢子未见萌发。因此，tr-1产生的挥发性物质可抑制花生表面黄曲霉菌孢子的萌发和菌丝的生长。
89.实施例8
90.弯曲芽胞杆菌tr-1的广谱抑菌作用
91.广谱抑菌实验采用培养皿(直径9cm)对扣培养法进行。将大小均一的不同真菌的菌丝块接种于pda培养皿中央。菌株tr-1(100μl，od600＝1.8)涂布于另一个含na培养基的培养皿表面。将接种真菌菌丝块的培养皿对扣于涂布tr-1的培养皿之上，以仅接种黄曲霉菌丝块的处理作为对照，胶带封口保存。每个处理有3个重复，28℃黑暗条件下培养4天后，统计菌丝直径，计算抑菌率。
92.抑菌率计算公式：抑菌率(％)＝(对照菌丝直径-处理菌丝直径)/对照菌丝直径
×
100。
93.广谱抑菌试验结果如图9所示，水活度为0.9的花生籽粒，接种黄曲霉孢子(ck)，以及接种后和tr-1共培养(tr-1+ck)，7天后的黄曲霉菌显微结构观察。
94.从图9中可以看出对照组中真菌菌丝生长迅速，菌丝覆盖培养基表面，tr-1处理组中菌丝生长受到抑制。菌株tr-1对病原真菌的生长均有显著的抑制作用，抑菌率为41.3％-98.7％，其中对禾谷镰刀菌的抑菌率为41.3％，对轮状镰刀菌的抑菌率为61.8％，对芒果炭疽菌的抑菌率达到73.6％，而对大豆炭疽菌、烟曲霉菌和灰霉菌的抑菌率高达90％以上。双皿对扣实验证实菌株tr-1能产生挥发性次级代谢产物，对多种植物病原真菌均具有显著抑制效应，广谱抑菌性效果良好。
95.上述虽然对本发明的具体实施例作了详细说明，但是本发明并不限于上述实施例，在本领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下做出各种变化，而不具备创造性劳动的修改或变形仍在本发明的保护范围以内。

技术特征：
1.一种弯曲芽胞杆菌tr-1，其特征在于，弯曲芽孢杆菌tr-1于2022年07月13号保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccno：m20221103，保藏地址为武汉大学。2.根据权利要求1所述的一种弯曲芽胞杆菌tr-1，在抑制多种病原真菌的生长、及抑制储藏期作物黄曲霉菌及毒素方面的应用。3.根据权利要求1所述的一种弯曲芽胞杆菌tr-1，其特征在于，所述弯曲芽胞杆菌tr-1的代谢产物包括苯、硫代乙酸甲酯、二甲基二硫、硫代丁酸甲酯、3-甲基硫代丁酸s-甲酯和二甲基三硫。4.根据权利要求3所述的一种弯曲芽胞杆菌tr-1的代谢产物在抑制黄曲霉菌中的应用。

技术总结
本发明提供了弯曲芽胞杆菌在防治黄曲霉菌及毒素中的应用，涉及植物病害生物防治技术领域，旨在解决目前培育抗病植株的研究进展缓慢，也不能成为防治黄曲霉菌污染的主要方法；化学药剂处理可有效预防黄曲霉菌的侵染，但是会导致有害物质的残留，污染环境的问题，采用的技术方案是，弯曲芽孢杆菌TR-1于2022年07月13号保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：M20221103，保藏地址为武汉大学，通过分离的弯曲芽胞杆菌TR-1为土壤细菌，是从土壤中分离得到的一种高效抑菌微生物，可作为作物储藏期真菌病害的生防菌株应用；本发明首次证明分离的弯曲芽胞杆菌TR-1可产挥发性抑菌物质，且在密闭环境下可有效的抑制黄曲霉菌菌丝的生长。丝的生长。丝的生长。


技术研发人员：宫安东 宋梦鸽 王高瞻 雷银玉 刘景榕 王大伟 张伟
受保护的技术使用者：信阳师范学院
技术研发日：2022.10.11
技术公布日：2023/9/25