抗Siglec-15抗体及其用途的制作方法

抗siglec-15抗体及其用途
技术领域
1.本发明属于生物医药领域，涉及一种抗siglec-15抗体。


背景技术：

2.唾液酸结合性免疫球蛋白样凝集素(sialic acid-binding immunoglobulin-like lectin，siglec)是一类经典的免疫球蛋白样凝集素，属于一次穿膜的ⅰ型膜蛋白，在结构上具有非常典型和保守的结构特征，其穿膜区由2-17个胞外ig结构域组成，n端由一个结合唾液酸的v-set ig结构域和一定数目的c2-set ig结构域组成。目前已发现15种人源和9种鼠源siglec分子，主要特异性表达于髓系细胞和免疫细胞表面，可通过识别含有唾液酸的糖链结构，介导细胞与细胞或病原体间的相互作用，在固有免疫和适应性免疫中发挥重要的调控作用。
3.近年来研究表明，siglec家族成员参与免疫细胞活化、增殖以及凋亡的调控。同时，siglec家族成员也参与免疫耐受的调控,并在自身免疫病、炎症反应以及肿瘤发生中发挥重要的免疫调控作用。因此，越来越多的靶向siglecs的抗体或糖基化配体的治疗药物被相继研发并用于淋巴瘤、白血病和自身免疫疾病等多种siglecs相关疾病的治疗。
4.siglec-15生理状态下表达于一些myeloid细胞(如巨噬细胞)，在肿瘤微环境中，siglec-15于m2型巨噬细胞以及在包括肺癌、卵巢癌和头颈癌等在内多种人体肿瘤细胞中的表达上调，通过识别t细胞表面未知配体参与抑制抗原特异性t细胞反应。siglec-15作为一种新的免疫调节靶点，在肿瘤微环境中抑制免疫反应，抗siglec-15抗体是肿瘤微环境中免疫细胞激活的新途径。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种能与siglec-15特异性结合的抗siglec-15抗体，为药物研发提供新的选择。
6.第一个方面，本发明提供结合siglec-15或其片段的抗siglec-15抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包括重链可变区和轻链可变区，重链可变区包括三个cdr，分别为vh cdr1、vh cdr2和vh cdr3，轻链可变区包括三个cdr，分别为vl cdr1、vl cdr2和vl cdr3；其中，vh cdr1包含seq id no：2、10、18、26、34或42所示的氨基酸序列或由其组成，vh cdr2包含seq id no：3、11、19、27、35或43所示的氨基酸序列或由其组成，vh cdr3包含seq id no：4、12、20、28、36或44所示的氨基酸序列或由其组成，vl cdr1包含seq id no：6、14、22、30、38或46所示的氨基酸序列或由其组成，vl cdr2包含seq id no：7、15、23、31、39或47所示的氨基酸序列或由其组成，vl cdr3包含seq id no：8、16、24、32、40或48所示的氨基酸序列或由其组成。
7.在优选的实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段包括vh cdr1、vh cdr2和vh cdr3，以及vl cdr1、vl cdr2和vl cdr3；其中，
8.vh cdr1的氨基酸序列如seq id no:2所示；
9.vh cdr2的氨基酸序列如seq id no:3所示；
10.vh cdr3的氨基酸序列如seq id no:4所示；
11.vl cdr1的氨基酸序列如seq id no:6所示；
12.vl cdr2的氨基酸序列如seq id no:7所示；
13.vl cdr3的氨基酸序列如seq id no:8所示。
14.在优选的实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段包括vh cdr1、vh cdr2和vh cdr3，以及vl cdr1、vl cdr2和vl cdr3；其中，
15.vh cdr1的氨基酸序列如seq id no:10所示；
16.vh cdr2的氨基酸序列如seq id no:11所示；
17.vh cdr3的氨基酸序列如seq id no:12所示；
18.vl cdr1的氨基酸序列如seq id no:14所示；
19.vl cdr2的氨基酸序列如seq id no:15所示；
20.vl cdr3的氨基酸序列如seq id no:16所示。
21.在优选的实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段包括vh cdr1、vh cdr2和vh cdr3，以及vl cdr1、vl cdr2和vl cdr3；其中，
22.vh cdr1的氨基酸序列如seq id no:18所示；
23.vh cdr2的氨基酸序列如seq id no:19所示；
24.vh cdr3的氨基酸序列如seq id no:20所示；
25.vl cdr1的氨基酸序列如seq id no:22所示；
26.vl cdr2的氨基酸序列如seq id no:23所示；
27.vl cdr3的氨基酸序列如seq id no:24所示。
28.在优选的实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段包括vh cdr1、vh cdr2和vh cdr3，以及vl cdr1、vl cdr2和vl cdr3；其中，
29.vh cdr1的氨基酸序列如seq id no:26所示；
30.vh cdr2的氨基酸序列如seq id no:27所示；
31.vh cdr3的氨基酸序列如seq id no:28所示；
32.vl cdr1的氨基酸序列如seq id no:30所示；
33.vl cdr2的氨基酸序列如seq id no:31所示；
34.vl cdr3的氨基酸序列如seq id no:32所示。
35.在优选的实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段包括vh cdr1、vh cdr2和vh cdr3，以及vl cdr1、vl cdr2和vl cdr3；其中，
36.vh cdr1的氨基酸序列如seq id no:34所示；
37.vh cdr2的氨基酸序列如seq id no:35所示；
38.vh cdr3的氨基酸序列如seq id no:36所示；
39.vl cdr1的氨基酸序列如seq id no:38所示；
40.vl cdr2的氨基酸序列如seq id no:39所示；
41.vl cdr3的氨基酸序列如seq id no:40所示。
42.在优选的实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段包括vh cdr1、vh cdr2和vh cdr3，以及vl cdr1、vl cdr2和vl cdr3；其中，
43.vh cdr1的氨基酸序列如seq id no:42所示；
44.vh cdr2的氨基酸序列如seq id no:43所示；
45.vh cdr3的氨基酸序列如seq id no:44所示；
46.vl cdr1的氨基酸序列如seq id no:46所示；
47.vl cdr2的氨基酸序列如seq id no:47所示；
48.vl cdr3的氨基酸序列如seq id no:48所示。
49.在优选的实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段包括vh cdr1、vh cdr2和vh cdr3，以及vl cdr1、vl cdr2和vl cdr3；其中，
50.vh cdr1的氨基酸序列如seq id no:2所示；
51.vh cdr2的氨基酸序列如seq id no:3所示；
52.vh cdr3的氨基酸序列如seq id no:4所示；
53.vl cdr1的氨基酸序列如seq id no:38所示；
54.vl cdr2的氨基酸序列如seq id no:39所示；
55.vl cdr3的氨基酸序列如seq id no:40所示。
56.在某些优选的实施方案中，所述重链可变区中含有的3个cdr，和/或所述轻链可变区中含有的3个cdr，由kabat或chothia编号系统定义。
57.在一些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段的重链可变区的氨基酸序列如seq id no:1、9、17、25、33、41或49所示，或与上述序列具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性。
58.在一些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的氨基酸序列如seq id no:5、13、21、29、37、45或50所示，或与上述序列具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性。
59.在一种优选的实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中，所述重链可变区的氨基酸序列如seq id no:1所示，或与seq id no:1所示序列具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性；所述轻链可变区的氨基酸序列如seq id no:5所示，或与seq id no:5所示序列具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性。
60.在一种优选的实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中，所述重链可变区的氨基酸序列如seq id no:9所示，或与seq id no:9所示序列具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性；所述轻链可变区的氨基酸序列如seq id no:13所示，或与seq id no:13所示序列具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性。
61.在一种优选的实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中，所述重链可变区的氨基酸序列如seq id no:17所示，或与seq id no:17所示序列具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性；所述轻链可变区的氨基酸序列如seq id no:21所示，或与seq id no:21所示序列具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性。
62.在一种优选的实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中，所述重链可变区的氨基酸序列如seq id no:25所示，或与seq id no:25所示序
列具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性；所述轻链可变区的氨基酸序列如seq id no:29所示，或与seq id no:29所示序列具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性。
63.在一种优选的实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中，所述重链可变区的氨基酸序列如seq id no:33所示，或与seq id no:33所示序列具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性；所述轻链可变区的氨基酸序列如seq id no:37所示，或与seq id no:37所示序列具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性。
64.在一种优选的实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中，所述重链可变区的氨基酸序列如seq id no:41所示，或与seq id no:41所示序列具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性；所述轻链可变区的氨基酸序列如seq id no:45所示，或与seq id no:45所示序列具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性。
65.在一种优选的实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中，所述重链可变区的氨基酸序列如seq id no:49所示，或与seq id no:49所示序列具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性；所述轻链可变区的氨基酸序列如seq id no:50所示，或与seq id no:50所示序列具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性。
66.在一些实施方式中，本发明的抗体或其抗原结合片段可进一步包含重链恒定区、轻链恒定区、fc区中的一种或多种。在进一步优选的实施方式中，所述轻链恒定区是λ链或κ链恒定区。在一些优选的实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段是igg1、igg2、igg3或igg4型。
67.在一些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段是嵌合抗体或人源化抗体或其抗原结合片段。
68.在优选实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段进一步包含重链恒定区和/或轻链恒定区，所述重链恒定区的氨基酸序列如seq id no:51所示，所述轻链恒定区的氨基酸序列如seq id no:52所示。
69.第二个方面，本发明提供一种生物材料，为：
70.1)核酸分子，编码本发明的抗体或其抗原结合片段；在优选实施方式中，所述核酸分子编码所述抗体或其抗原结合片段的重链可变区和/或轻链可变区；
71.2)载体，其包含本发明所述的核酸分子；
72.3)宿主细胞或微生物，其包含本发明的核酸分子或载体；
73.4)上述3)的表达产物、表达上清液或表达悬浮液。
74.本领域技术人员根据抗体或其抗原结合片段的氨基酸序列能够容易地获得编码实施抗体或其抗原结合片段的核酸分子，选择并制备包含所述核酸分子的载体、宿主细胞或微生物，并能够知道如何培养这样的宿主细胞或微生物，从而获得相应的表达产物、悬浮液、上清液等，以获得相应的抗体。这都是本领域常规技术手段。
75.第三个方面，提供一种组合物，其包含本发明的抗体或其抗原结合片段；优选地，所述组合物为药物组合物，进一步包含制药学上可接受的载体。
76.第四个方面，提供制备本发明的抗体或其抗原结合片段的方法，包括：培养上述的宿主细胞使抗体或抗原结合片段表达，及分离所述抗体或其抗原结合片段。
77.第五个方面，提供本发明的抗体或其抗原结合片段或本发明的生物材料或本发明的组合物在制备用于治疗肿瘤的药物中的应用。
78.在本发明中，所述肿瘤为siglec-15表达阳性的肿瘤；进一步优选地，所述肿瘤是各种血液肿瘤和实体瘤，如白血病、淋巴瘤、膀胱癌、乳腺癌、头颈癌、胃癌、黑色素瘤、胰腺癌、结直肠癌、食管癌、肝癌、肾癌、肺癌、前列腺癌、卵巢癌、甲状腺癌、神经胶质瘤。
79.第七个方面，提供本发明的抗体或其抗原结合片段或本发明的生物材料或本发明的组合物在制备阻断siglec-15蛋白对t细胞增殖抑制的制剂中的应用。
80.本发明的抗siglec-15抗体或其抗原结合片段对其抗原具高亲和力，在体外实验中能够有效逆转siglec-15 fc融合蛋白对t细胞的增殖抑制作用，可通过有效促进t细胞增殖而发挥肿瘤杀伤功能，有效抑制肿瘤的生长，具有良好的成药前景。
附图说明
81.图1：嵌合抗体对人siglec-15蛋白的elisa结果。
82.图2：嵌合抗体对稳转人siglec-15细胞的facs结果。
83.图3：嵌合抗体在供体a来源pbmc的t细胞激活活性。
84.图4：嵌合抗体在供体b来源pbmc的t细胞激活活性。
85.图5：嵌合抗体的表位竞争实验。
86.图6：候选人源化抗体对人siglec-15蛋白的elisa结果。
87.图7：候选人源化抗体对稳转人siglec-15细胞的facs结果。
88.图8：候选人源化抗体b609415在供体a来源pbmc的t细胞激活活性。
89.图9：候选人源化抗体b609415对人siglec-1/2/4蛋白和猴、鼠siglec-15蛋白的elisa结果。
具体实施方式
90.定义
91.本发明中，术语“抗体”是能特异识别并结合抗原的免疫球蛋白，其涵盖多种抗体结构物，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、双特异抗体或抗体片段。
92.术语“可变区”指识别并特异结合抗原表位的抗体重链或轻链的结构域。
93.cdr区或称“互补决定区”指抗体可变区中在序列上高变并形成在结构上确定的环和/或含有抗原接触氨基酸残基的区域。cdr主要负责抗体与抗原表位的结合，决定了抗体的特异性。在一个给定的重链或轻链可变区氨基酸序列中，各cdr的具体氨基酸序列使用许多公知的编号规则的任一种或其组合确定，所述编号规则包括例如kabat、contact、abm和chothia。
94.本发明的抗体
95.本发明提供了对人siglec-5蛋白具有高亲和力的抗siglec-15抗体，在体外实验中可有效逆转siglec-15 fc融合蛋白对t细胞的增殖抑制作用，进而发挥有效肿瘤杀伤功能。
96.本发明的抗siglec-15抗体或其抗原结合片段包含取代、插入或缺失。本发明的抗siglec-15抗体包括对轻链可变区、重链可变区、轻链或重链的修饰，修饰后其氨基酸序列不同于衍生出该抗体的氨基酸序列。例如，衍生自同一指定蛋白质的氨基酸序列可以是与起始序列相似的，例如具有一定的百分比同一性，例如它可以与起始序列的百分比同一性是60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％。
97.本发明中，“同一性”是指两个肽之间或两个核酸分子之间序列比对时，所比较的两个序列中该百分比的碱基(或氨基酸)相同。可以使用本领域已知的软件程序来确定该比对和同源性百分比或序列同一性，比如ausubel et al.eds.(2007)在current protocols in molecular biology中所述的软件程序。优选使用默认参数进行比对。其中一种比对程序是使用默认参数的blast。特别地，程序是blastn和blastp。
98.在某些实施方案中，可在本文所提供抗体的fc区引入氨基酸修饰，所述氨基酸修饰可以是一个或多个，以此产生fc变体。fc变体可包含在一个或多个氨基酸位置处包含氨基酸修饰的人fc区序列。
99.适用于本发明的“抗体或其抗原结合片段”包括但不限于多克隆、单克隆、单价、双 特异性、多特异性、重组、异源、嵌合、人源化、去免疫原性的抗体，或fab片段、fab’片段、f(ab’)2片段、单链抗体、纳米抗体和上述任一种的表位结合片段。
100.在一些实施方案中，本发明的抗体可以是单特异的、双特异的或多特异性的。抗siglec-15抗体可以与另一种抗体或抗体片段连接以产生具有第二或更多结合特异性的双特异性或多特异性抗体。
101.在某些实施方案中，抗体可经进一步修饰以添加功能性组分，适合抗体衍生作用的部分包括但不限于以下实例，peg、葡聚糖、蛋白质、脂类、治疗剂或毒素。抗体可以通过磷 酸化、乙酰化、糖基化、聚乙二醇化、酰胺化、或与其它蛋白连接等进行修饰。
102.肿瘤治疗方法和抗体用途
103.本发明提供的抗siglec-15抗体及其抗原结合片段和包含其的药物组合物可用于诊断、预后、治疗或抑制癌症。本发明涉及向有需要的受试者施用本发明的抗siglec-15抗体或其片段而提供治疗受试者癌症的方法。本发明的治疗性化合物包括但不限于本发明所述抗体(包括本发明所述的变体和衍生物)和编码本发明所述抗体(包括本发明所述的变体和衍生物)的核酸或多核苷酸。
104.本发明的抗体可以通过任何合适的方式给药，包括但不限于腹腔内、静脉内、皮下、鼻内、肌肉内注射。抗体及其变体或组合物可以通过任何方便的途径施用，例如通过推注或输注，通过上皮或皮肤黏膜的吸收。
105.本发明示例下的抗siglec-15抗体序列
106.表1：本发明抗体的vh、vh cdr1、vh cdr2、vh cdr3、vl、vl cdr1、vl cdr2、vl cdr3氨基酸序列编号
107.[0108][0109]
实施例
[0110]
实施例1：抗siglec-15鼠源单抗制备
[0111]
用商业化人siglec-15 fc融合蛋白(acrobiosystems，货号sg5-h5253)50μg对6-8周龄的balb/c或sjl小鼠(上海斯莱克实验动物有限公司)进行初次免疫，之后于第14天和第35天分别用25μg上述融合蛋白进行再次免疫。并在免疫后第56天，用25μg上述融合蛋白进行加强免疫，所得小鼠用于融合。
[0112]
免疫后小鼠血清效价以酶联免疫吸附反应(elisa)法进行检测。将人siglec-15 his蛋白(acrobiosystems，sg5-h52h3)以pbs稀释至1μg/ml，100μl/孔加入至酶标板，4℃包被过夜。以封闭液(2％ bsa-pbs缓冲液)37℃封闭1h，1
×
pbst洗板3次，将小鼠血清稀释液(1:100；1:1k；1:10k)加入板中并37℃孵育2h。以1
×
pbst洗板加入抗鼠fab-hrp(sigma，a3862，1:10000)，37℃反应1h后，洗板3次，加入底物tmb溶液，室温避光反应5分钟后终止反应，于酶标仪检测od450吸光值。免疫结束后，准备骨髓瘤细胞sp2/0(atcc)悬液和免疫后小鼠的脾细胞悬液，血球计数板计数后按照1：3的比例混合，以电融合仪进行细胞融合。在融合管中加入hat筛选培养基中，混匀稀释后，按100μl/孔加入到96孔细胞培养板中，于5％co
2 37℃培养箱中培养10-14天后用elisa实验检测杂交瘤上清液中抗体。多个不同的杂交瘤被鉴定出，其中选择mab006、mab009、mab010、mab044、mab060和mab070克隆用于进一步分析。最终，分析出抗体的cdr区、重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列，具体序列如表1所示。
[0113]
实施例2：鼠源嵌合抗体亲和力检测
[0114]
将克隆mab006、mab009、mab010、mab044、mab060和mab070的可变区基因与人igg恒定区基因(重链恒定区序列为seq id no:51；轻链恒定区序列为seq id no:52)嵌合并克隆至表达载体中，并分别命名为ch006、ch009、ch010、ch044、ch060和ch070。于hek293细胞中瞬转表达一周，收获培养上清经蛋白a亲和纯化后，利用elisa和facs实验检测候选抗体对人源siglec-15蛋白(acrobiosystems，sg5-h52h3)和稳转人siglec-15细胞(human siglec-15-8d2，睿智化学，细胞克隆号8d2)的亲和力。
[0115]
将人源siglec-15蛋白用pbs稀释到2μg/ml，于4℃孵育包被酶标板过夜后，用pbst
bsa的pbst)37℃孵育2h后以pbst洗板3次。加入50μl梯度浓度稀释的生物素-人siglec-15 his蛋白(acro，sg5-h82e9)(起始浓度为1μg/ml，按5倍梯度稀释)，37℃孵育1h后以pbst洗板3次，每孔加入50μl sa-hrp(sigma，s2438)，于37℃孵育0.5h。以pbst清洗6次，每孔加入100μl底物tmb(innoreagents，el0009)，37℃孵育15min后，每孔加入50μl终止液，显色后用酶标仪450nm测定od值，计算与各抗体结合率为ec80的生物素-人siglec-15 his蛋白浓度。
[0122]
将参照抗体nc318-5g12稀释至1μg/ml，按每孔50μl加入包被板中，37℃孵育1.5h后以pbst洗板3次。加入100μl封闭液于37℃孵育2h后以pbst洗板3次。等比混合生物素-人siglec-15 his和待测竞争性抗体至终浓度分别为ec80值浓度及20μg/ml，37℃孵育1h后，按每孔100μl加入包被孔，于37℃孵育1h后以pbst洗板3次。每孔加入sa-hrp(1:5000稀释度)100μl，37℃温育0.5h，以pbst洗板6次后，加入100μl底物tmb，37℃孵育15min后，每孔加入50μl终止液，显色后用酶标仪450nm测定od值，通过计算竞争抗体对包被抗体的结合抑制将各候选抗体进行分类。由图5可知，候选分子ch044和ch070与参照抗体nc318-5g12具有较高的竞争效率，表明ch044和ch070与参照抗体表位较相近；而ch006、ch009、ch010和ch060与参照抗体竞争率低，表明与参照抗体表位差异较大。
[0123]
实施例5候选抗体人源化
[0124]
本项目中ch006、ch009、ch010和ch060抗体与参照抗体nc318-5g12的表位差异较大，作为本项目主要候选分子开展后续研究。经序列分析，相关抗体的序列同源很高，最终选定以ch006-vh为重链可变区和ch060-vl为轻链可变区进行组合，开展后续抗体人源化工作。
[0125]
具体地，将抗体的重链可变区和轻链可变区与可用的人igg基因序列数据库进行比较，以鉴定最佳匹配的人种系ig基因序列。具体地，重链序列选择了人种系igg重链ighv1-2*02；轻链序列选择了人种系igg轻链：igkv4-1*01。将ch006的重链cdr和ch060的轻链cdr区分别移植到匹配的框架序列，所得vh和vl氨基酸序列分别为序列49和序列50，所用的抗体重链恒定区和轻链恒定区分别为序列51和序列52。
[0126]
将设计的重、轻链质粒进行组合，新的抗体分子分别命名为b609415。本领域技术人员根据上述披露的信息完全可以知晓相关人源化抗体的重链和轻链的完整氨基酸序列。
[0127]
实施例6人源化抗体亲和力及活性检测
[0128]
同前所述，针对嵌合抗体ch006和ch060开展人源化设计获得的b609415经hek293瞬转表达后由蛋白a亲和纯化后获得。利用elisa和facs实验检测人源化抗体、ch006鼠源嵌合抗体和对照抗体nc318-5g12对人源siglec-15蛋白(acrobiosystems，sg5-h52h3)和稳转人siglec-15细胞(睿智化学，细胞克隆号8d2)的亲和力，实验方法同实施例2。由结果图6、图7可知，相关人源化抗体对人源siglec-15蛋白以及稳转人siglec-15细胞均有高亲和力，与参照药物nc318-5g12无显著差异。
[0129]
抗体的t细胞激活实验方法同实施例3所述，结果如图8表明，人源化抗体b609415高效逆转了siglec-15蛋白对cd4+t细胞和cd8+t细胞的增殖抑制作用，其功能活性与参照抗体nc318-5g12相比略优。
[0130]
实施例7人源化抗体特异性结合
[0131]
对候选分子b609415开展特异性结合检测实验。其中，以elisa方法检测其对鼠源siglec-15蛋白(acro，sg5-m52h7)、猴源siglec-15蛋白(acro，sg5-c52h6)，以及同系的人
源siglec-1蛋白(r&d，5197-sl-050)、人源siglec-2蛋白(r&d，10191-sl-050)、人源siglec-4蛋白(r&d，8940-mg-050)的亲和力。
[0132]
相关实验方法见实施例2，结果如图9所示：人源化抗体b609415对人源siglec家族的siglec-1/2/4蛋白均无非特异性结合，表明候选抗体对siglec-15的识别具高度特异性；同时该分子对稳转鼠源和猴源siglec-15蛋白保持了高亲和力，可为后续药效模型和猴体毒理实验模式动物的选择提供参考依据。
[0133]
序列表
[0134]
1：mab006-vh
[0135]
qvqlqqsgpelvkpgtsvkisckasgysftdyfinwmkqrpgqglewigwifpgsgdtyynekfkgkatltvdnssstaymllssltsedsavffcartgdyfdywgqgttltvss
[0136]
2：mab006-vh cdr1
[0137]
dyfin
[0138]
3：mab006-vh cdr2
[0139]
wifpgsgdtyynekfkg
[0140]
4：mab006-vh cdr3
[0141]
tgdyfdy
[0142]
5：mab006-vl
[0143]
dvvmtqtplslpvslgdqasiscrssqslvhsngntylhwylqkpgqspklliykvsnrfsgvpdrfsgsgsgtdftlkisrveaedlgvyfcsqsthvppwtfgggtkleik
[0144]
6：mab006-vl cdr1
[0145]
rssqslvhsngntylh
[0146]
7：mab006-vl cdr2
[0147]
kvsnrfs
[0148]
8：mab006-vl cdr3
[0149]
sqsthvppwt
[0150]
9：mab009-vh
[0151]
qvqlqqsgpelvkpgasvkisckasgytftdyyfnwvkqrpgqglewigwifpgsgdayynanfkgqatltvdnssstaymllssltsedsavylcarsgdyfdywgqgttltvss
[0152]
10：mab009-vh cdr1
[0153]
dyyfn
[0154]
11：mab009-vh cdr2
[0155]
wifpgsgdayynanfkg
[0156]
12：mab009-vh cdr3
[0157]
sgdyfdy
[0158]
13：mab009-vl
[0159]
dvvmtqtplslpvslgdqasiscrssqslvhsngntylhwylqkpgqspklliykvsnrfsgvpdrfsgsgsgtdftlkisrveaedlgvyfcsqsthvpwtfgggtkleik
[0160]
14：mab009-vl cdr1
[0161]
rssqslvhsngntylh
[0162]
15：mab009-vl cdr2
[0163]
kvsnrfs
[0164]
16：mab009-vl cdr3
[0165]
sqsthvpwt
[0166]
17：mab010-vh
[0167]
qvqlqqsgpelvkpgtsvkisckasgytftdyyinwvkqrpgqrlewigwifpgsgdtyynetfkgkatlnvdnssstaymllssltsedsavyfcarwgdfddywgqgttltvss
[0168]
18：mab010-vh cdr1
[0169]
dyyin
[0170]
19：mab010-vh cdr2
[0171]
wifpgsgdtyynetfkg
[0172]
20：mab010-vh cdr3
[0173]
wgdfddy
[0174]
21：mab010-vl
[0175]
dvvmtqtplslpvslgdqtsiscrssqslvhnngntylhwylqkpgqspkllifkvsnrfsgvpdrfsgsgsgtdftlkisrveaedlgvyfcsqsshvpltfgagtklelk
[0176]
22：mab010-vl cdr1
[0177]
rssqslvhnngntylh
[0178]
23：mab010-vl cdr2
[0179]
kvsnrfs
[0180]
24：mab010-vl cdr3
[0181]
sqsshvplt
[0182]
25：mab044-vh
[0183]
evqlvesggglvkpggslklscaasgftfsdygihwvrqapekglewvayissgsstiyfadtvkgrftisrdnakntlflqmtslrsedtamyycarrddyhamdfwgqgtsvtvss
[0184]
26：mab044-vh cdr1
[0185]
dygih
[0186]
27：mab044-vh cdr2
[0187]
yissgsstiyfadtvkg
[0188]
28：mab044-vh cdr3
[0189]
rddyhamdf
[0190]
29：mab044-vl
[0191]
divmtqshkfmstsvgdrvsitckasqdvstaaawyqqkpgqspklliysasyrytgvpdrfngsgsgtdftftistvqaedlavyycqqhdsppytfgggtkleik
[0192]
30：mab044-vl cdr1
[0193]
kasqdvstaaa
[0194]
31：mab044-vl cdr2
[0195]
sasyryt
[0196]
32：mab044-vl cdr3
[0197]
qqhdsppyt
[0198]
33：mab060-vh
[0199]
qvqlqqsgpelvkpgasvkisckasdytftdyyinwvkqrpgqglewigwifpgsgstyynekfegkatltvdnssstacmllssltsedsavyfcartgdyfdywgqgttltvss
[0200]
34：mab060-vh cdr1
[0201]
dyyin
[0202]
35：mab060-vh cdr2
[0203]
wifpgsgstyynekfeg
[0204]
36：mab060-vh cdr3
[0205]
tgdyfdy
[0206]
37：mab060-vl
[0207]
dvvmtqtplslpvslgdqasiscrssqslvhsngntylhwylqkpgqspklliykvsnrfsgvpdrfsgsgsgtdftlkisrveaedlgvyfcsqsthvpwtfgggtkleik
[0208]
38：mab060-vl cdr1
[0209]
rssqslvhsngntylh
[0210]
39：mab060-vl cdr2
[0211]
kvsnrfs
[0212]
40：mab060-vl cdr3
[0213]
sqsthvpwt
[0214]
41：mab070-vh
[0215]
evqlvesggglvkpggslklscaasgftfsdygmnwvrqgpekglewvalitsgssaiyfadtvkgrftisgdnakntlflqmtslrsedtaiyyctrrddyhamdfwgqgtsvtvss
[0216]
42：mab070-vh cdr1
[0217]
dygmn
[0218]
43：mab070-vh cdr2
[0219]
litsgssaiyfadtvkg
[0220]
44：mab070-vh cdr3
[0221]
rddyhamdf
[0222]
45：mab070-vl
[0223]
divmtqshkfmstsvgdrvsvtckasqhvstavawyqqkpgqspkllifsasyrytgvpdrfngsgygtdftftissvqaedlavyycqqhdttpytfgggtklein
[0224]
46：mab070-vl cdr1
[0225]
kasqhvstava
[0226]
47：mab070-vl cdr2
[0227]
sasyryt
[0228]
48：mab070-vl cdr3
[0229]
qqhdttpyt
[0230]
49：b609415-vh
[0231]
qvqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgysftdyfinwvrqapgqglewmgwifpgsgdtyynekfkgrvt
mtvdnststaymelsslrsedtavyycartgdyfdywgqgtlvtvss
[0232]
50：b609415-vl
[0233]
dvvmtqspdslavslgeratincrssqslvhsngntylhwyqqkpgqppklliykvsnrfsgvpdrfsgsgsgtdftltisslqaedlavyfcsqsthvpwtfgggtkveik
[0234]
51：重链恒定区
[0235]
astkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspg
[0236]
52：轻链恒定区
[0237]
rtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec

技术特征：
1.抗siglec-15抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包括重链可变区和轻链可变区，重链可变区包括三个cdr，分别为vh cdr1、vh cdr2和vh cdr3，轻链可变区包括三个cdr，分别为vl cdr1、vl cdr2和vl cdr3；其中，vh cdr1包含seq id no：2、10、18、26、34或42所示的氨基酸序列或由其组成，vh cdr2包含seq id no：3、11、19、27、35或43所示的氨基酸序列或由其组成，vh cdr3包含seq id no：4、12、20、28、36或44所示的氨基酸序列或由其组成，vl cdr1包含seq id no：6、14、22、30、38或46所示的氨基酸序列或由其组成，vl cdr2包含seq id no：7、15、23、31、39或47所示的氨基酸序列或由其组成，vl cdr3包含seq id no：8、16、24、32、40或48所示的氨基酸序列或由其组成；优选地，所述抗体或其抗原结合片段包括vh cdr1、vh cdr2和vh cdr3，以及vl cdr1、vl cdr2和vl cdr3；其中，vh cdr1的氨基酸序列如seq id no:2所示；vh cdr2的氨基酸序列如seq id no:3所示；vh cdr3的氨基酸序列如seq id no:4所示；vl cdr1的氨基酸序列如seq id no:6所示；vl cdr2的氨基酸序列如seq id no:7所示；vl cdr3的氨基酸序列如seq id no:8所示；或者，vh cdr1的氨基酸序列如seq id no:10所示；vh cdr2的氨基酸序列如seq id no:11所示；vh cdr3的氨基酸序列如seq id no:12所示；vl cdr1的氨基酸序列如seq id no:14所示；vl cdr2的氨基酸序列如seq id no:15所示；vl cdr3的氨基酸序列如seq id no:16所示；或者，vh cdr1的氨基酸序列如seq id no:18所示；vh cdr2的氨基酸序列如seq id no:19所示；vh cdr3的氨基酸序列如seq id no:20所示；vl cdr1的氨基酸序列如seq id no:22所示；vl cdr2的氨基酸序列如seq id no:23所示；vl cdr3的氨基酸序列如seq id no:24所示；或者，vh cdr1的氨基酸序列如seq id no:26所示；vh cdr2的氨基酸序列如seq id no:27所示；vh cdr3的氨基酸序列如seq id no:28所示；vl cdr1的氨基酸序列如seq id no:30所示；vl cdr2的氨基酸序列如seq id no:31所示；vl cdr3的氨基酸序列如seq id no:32所示；或者，vh cdr1的氨基酸序列如seq id no:34所示；vh cdr2的氨基酸序列如seq id no:35所示；vh cdr3的氨基酸序列如seq id no:36所示；vl cdr1的氨基酸序列如seq id no:38所示；vl cdr2的氨基酸序列如seq id no:39所示；
vl cdr3的氨基酸序列如seq id no:40所示；或者，vh cdr1的氨基酸序列如seq id no:42所示；vh cdr2的氨基酸序列如seq id no:43所示；vh cdr3的氨基酸序列如seq id no:44所示；vl cdr1的氨基酸序列如seq id no:46所示；vl cdr2的氨基酸序列如seq id no:47所示；vl cdr3的氨基酸序列如seq id no:48所示；或者，vh cdr1的氨基酸序列如seq id no:2所示；vh cdr2的氨基酸序列如seq id no:3所示；vh cdr3的氨基酸序列如seq id no:4所示；vl cdr1的氨基酸序列如seq id no:38所示；vl cdr2的氨基酸序列如seq id no:39所示；vl cdr3的氨基酸序列如seq id no:40所示。2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结合片段的重链可变区的氨基酸序列如seq id no:1、9、17、25、33、41或49所示，或与上述序列具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性；和/或，所述抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的氨基酸序列如seq id no:5、13、21、29、37、45或50所示，或与上述序列具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性；优选地，所述抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中，所述重链可变区的氨基酸序列如seq id no:1所示，或与seq id no:1所示序列具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性；所述轻链可变区的氨基酸序列如seq id no:5所示，或与seq id no:5所示序列具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性；或者，所述重链可变区的氨基酸序列如seq id no:9所示，或与seq id no:9所示序列具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性；所述轻链可变区的氨基酸序列如seq id no:13所示，或与seq id no:13所示序列具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性；或者，所述重链可变区的氨基酸序列如seq id no:17所示，或与seq id no:17所示序列具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性；所述轻链可变区的氨基酸序列如seq id no:21所示，或与seq id no:21所示序列具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性；或者，所述重链可变区的氨基酸序列如seq id no:25所示，或与seq id no:25所示序列具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性；所述轻链可变区的氨基酸序列如seq id no:29所示，或与seq id no:29所示序列具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性；或者，所述重链可变区的氨基酸序列如seq id no:33所示，或与seq id no:33所示序列具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性；所述轻链可变区的氨基酸序列如seq id no:37所示，或与seq id no:37所示序列具有至少90％、至少
95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性；或者，所述重链可变区的氨基酸序列如seq id no:41所示，或与seq id no:41所示序列具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性；所述轻链可变区的氨基酸序列如seq id no:45所示，或与seq id no:45所示序列具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性；或者，所述重链可变区的氨基酸序列如seq id no:49所示，或与seq id no:49所示序列具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性；所述轻链可变区的氨基酸序列如seq id no:50所示，或与seq id no:50所示序列具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性。3.根据权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结合片段进一步包含重链恒定区、轻链恒定区、fc区中的一种或多种；所述轻链恒定区是λ链或κ链恒定区，所述抗体或其抗原结合片段是igg1、igg2、igg3或igg4型；优选地，所述抗体或其抗原结合片段进一步包含重链恒定区和/或轻链恒定区，所述重链恒定区的氨基酸序列如seq id no:51所示，所述轻链恒定区的氨基酸序列如seq id no:52所示。4.一种生物材料，为：1)核酸分子，编码权利要求1～3任一项所述的抗体或其抗原结合片段；优选地，所述核酸分子编码所述抗体或其抗原结合片段的重链可变区和/或轻链可变区；2)载体，其包含1)所述的核酸分子；3)宿主细胞或微生物，其包含1)所述的核酸分子或2)所述的载体；4)上述3)的表达产物、表达上清液或表达悬浮液。5.一种组合物，其包含权利要求1～3任一项所述的抗体或其抗原结合片段；优选地，所述组合物为药物组合物，进一步包含制药学上可接受的载体。6.权利要求1～3任一项所述的抗体或其抗原结合片段的制备方法，包括：培养权利要求4中的宿主细胞使抗体或其抗原结合片段表达，及分离所述抗体或其抗原结合片段。7.权利要求1～3任一项所述的抗体或其抗原结合片段或权利要求4所述的生物材料或权利要求5所述的组合物在制备用于治疗肿瘤的药物中的应用；优选地，所述肿瘤为siglec-15表达阳性的肿瘤。8.根据权利要求7所述的应用，其中，所述肿瘤是各种血液肿瘤和实体瘤，如白血病、淋巴瘤、膀胱癌、乳腺癌、头颈癌、胃癌、黑色素瘤、胰腺癌、结直肠癌、食管癌、肝癌、肾癌、肺癌、前列腺癌、卵巢癌、甲状腺癌、神经胶质瘤。9.权利要求1～3任一项所述的抗体或其抗原结合片段或权利要求4所述的生物材料或权利要求5所述的组合物在制备阻断siglec-15蛋白对t细胞增殖抑制的制剂中的应用。

技术总结
本发明属于生物医药领域，涉及一种抗Siglec-15抗体，包括VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，以及VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。本发明的抗Siglec-15抗体或其抗原结合片段对其抗原具高亲和力，能够有效逆转Siglec-15Fc融合蛋白对T细胞的增殖抑制作用，具有良好的成药前景。景。


技术研发人员：高章照 周雅琼 聂磊 王海彬 陈刚 吴振华 李娜 高栋 齐健 朱珊珊 郭婷婷 章熠
受保护的技术使用者：海正生物制药有限公司
技术研发日：2022.11.22
技术公布日：2023/9/25