与水稻香味性状相关的分子标记、引物对及其应用

1.本发明属于分子生物技术和分子标记技术领域，涉及水稻种质资源的筛选及分子育种，特别涉及一种与水稻香味有关紧密连锁或共分离的分子标记及其应用。


背景技术：

2.香味是重要的水稻品质性状之一，直接影响着稻米的蒸煮食味品质。具有香味的水稻更加受消费者喜爱，在市场上也具有更高的经济价值。水稻香味性状主要是由第8号染色体上的badh2基因所控制，其编码产物甜菜碱醛脱氢酶可以将4-氨基丁醛转化为4-氨基丁酸。当该基因发生功能型突变时，则产生失去活性的无功能蛋白，从而引起 4-氨基丁醛的积累，进而导致香味物质2-ap的积累，使水稻产生香味。


技术实现要素：

3.针对上述问题，本发明的目的一在于提供一种与水稻香味性状相关的分子标记，目的二在于提供扩增上述分子标记的引物对，目的三在于提供包含上述引物对的试剂盒，目的四在于提供上述的分子标记、引物对或包含所述引物对的试剂盒在鉴定水稻香味性状和遗传育种等中的应用，目的五在于提供一种水稻香味性状的鉴定方法，目的六在于提供一种水稻香味性状的遗传改良的方法。
4.为了实现上述目的，本发明采用的具体方案为：一种与水稻香味性状相关的分子标记，所述分子标记为badh2新等位基因，位于水稻第8号染色体上，其序列对应于日本晴参考基因组8号染色体上第20384875-20384929位点的55bp片段缺失，导致水稻中香味物质2-ap的积累产生香味。
5.所述badh2新等位基因突变位点的目的片段采用核苷酸序列如seq id no：01~02所示的引物扩增，产物为seq id no：03所示的一段195bp的基因片段。
6.扩增上述分子标记的引物对，包含上游引物primer-f和下游引物primer-r，其核苷酸序列如下：上游引物primer-f：5
,
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,
（seq id no：01）；下游引物primer-r：5
,
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, （seq id no：02）.一种试剂盒，包含上述的引物对。
7.上述的分子标记、引物对或包含所述引物对的试剂盒在如下任意一种中的应用：（1）鉴定水稻香味性状；（2）水稻遗传育种；（3）改良水稻香味性状。
8.一种水稻香味性状的鉴定方法，通过与水稻香味物质2-ap合成相关的分子标记进行鉴定；所述分子标记位于水稻第8号染色体上，其序列对应于日本晴参考基因组8号染色体上第20384875-20384929位点，鉴定所述第20384875-20384929位点是否存在55bp片段缺失。
9.一种水稻香味性状的遗传改良的方法，包含如下步骤：确定水稻育种群体中上述的位于水稻 8 号染色体上与水稻香味性状相关的分子标记，并根据所述分子标记做出筛选：对于日本晴参考基因组第8号染色体上第20384875-20384929的核苷酸片段缺失的纯合水稻单株进行保留，以获得具有香味的水稻个体，提高水稻的稻米品质。
10.本发明对于现有技术具有如下的优点及效果；（1）本发明研究并确定了第8号染色体上badh2新等位基因的序列对应于国际日本晴参考基因组8号染色体上第20384875-20384929位点发生55bp的缺失，该片段的缺失，导致badh2新等位基因的编码产物发生选择性剪接，进而产生无功能蛋白，导致水稻产生2-ap，从而使水稻产生香味。验证该位点的缺失对水稻中香味物质2-ap的影响效应，最终建立对水稻香味性状快速鉴定及遗传改良的分子标记辅助选择育种技术，发掘了新的影响香味性状的新的等位基因变异位点，适应市场中对稻米优质性状的要求，加速香稻育种的研究进展。
11.（2）本发明提供了位于第8号染色体上与水稻香味性状相关分子标记的引物对，通过该引物对，可以建立高效便捷的分子标记辅助育种技术，快速准确的对具有香味性状的水稻进行选育，加速育种进程，将其应用到水稻香味性状的遗传改良中，从而使无香的水稻品种产生香味，提高稻米的商品价值，为企业和农户增益，增加水稻品种的核心竞争力。
附图说明
12.图1是携带badh2新等位基因香稻品种与日本晴的badh2核苷酸序列作对比的突变位点及序列对比图。
13.图2是分子标记在携带badh2新等位基因香稻品种、日本晴和华航48号中的扩增带型结果图；m:marker；1: 携带badh2新等位基因香稻品种；2：日本晴；3：华航48号。
14.图3是针对badh2新等位基因特异位点设计的分子标记引物对检测badh2新等位基因香稻品种与非香稻品种华航48号以及两亲本构建的f2群体结果图。
具体实施方式
15.本发明通过测序分析发现一个badh2新的等位变异，其序列对应于国际日本晴参考基因组8号染色体上第20384875-20384929区间发生55bp的缺失，导致该badh2新等位基因的编码产物发生选择性剪接，进而产生无功能蛋白，导致水稻产生2-ap香味，从而使水稻产生香味。该等位基因从未有过报道。通过把此位点开发为分子标记，可以大量检测具有该突变位点的材料，并且可以在种子或者苗期阶段对水稻香味未的有无进行判断，提高香味性状的筛选效率及加速香稻育种的进程。
16.一种与水稻香味性状相关的分子标记，该分子标记针对水稻日本晴基因组的第8号染色体上第20384875-20384929位点的55bp片段缺失。
17.所述的位于水稻第8号染色体上的与香味性状相关的分子标记的核苷酸序列，该分子标记位点的缺失导致水稻中香味物质2-ap的产生。
18.所述的位于水稻第8号染色体上的与香味性状相关的分子标记的位点为图1序列标注位置，为55bp的片段缺失。
19.所述的位于水稻第8号染色体上的与香味性状相关的分子标记在鉴定水稻香味性状和遗传育种中的应用。
20.一种检测水稻香味性状的方法，包含如下步骤：检测水稻第8号染色体上的与香味性状相关的分子标记，所述的分子标记针对第8号染色体上20384875-20384929位核苷酸的缺失与否。
21.一种用于鉴定上述水稻第8号染色体上的与香味性状相关的分子标记的引物对，包含引物primer-f和primer-r，其核苷酸序列如下：上游引物primer-f：5
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,
；下游引物primer-r：5
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。
22.所述的引物对在鉴定水稻中香味性状的应用。
23.所述引物对在水稻分子标记辅助育种中的应用。
24.所述引物对在使水稻稻米产生香味中的应用。
25.一种水稻的香味性状遗传改良方法，包含如下步骤：确定水稻中的上述第8号染色体上与水稻香味性状相关的分子标记，并根据所述的分子标记做出相应的选择，在水稻群体中选择存在55bp片段缺失的水稻单株，以获得具有香味的水稻个体，提高水稻的稻米品质；下面将结合本发明实施例及附图，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。
26.实施例1标记的发现一、植物材料：（1）携带badh2新等位基因香稻品种：用于检测香味物质2-ap的含量及badh2基因序列突变位点的筛选。
27.（2）以携带badh2新等位基因香稻品种为母本和非香稻品种华航48号分别为母本和父本，构建f2群体（n=400）用于后代分离比的鉴定及香味性状的鉴定。
28.二、香味表型鉴定。
29.通过同步蒸馏萃取法（sde）和gcms-qp 2010 plus （shimadzu corporation, japan）法测定水稻中2-乙酰基-1-吡咯啉（2-ap），通过2-ap的含量来判断水稻香味有无。数据分析：选取所需要的目标峰进行自动锋积分，并导出结果；以2-乙酰基-1-吡咯啉（25mg/ml）为标准物制定标准曲线，换算出具体的2-ap含量。
30.三、dna提取。
31.采用ctab法提取水稻全基因组dna，用nanodrop1000分光光度计检测所提取的dna质量和浓度。260/280比值在1 .8～2 .0，a260/230比值在1 .7～1 .9判定为合格。最后将合格的dna样品统一稀释成100纳克/微升。
32.四、badh2新等位基因突变位点的挖掘。
33.扩增badh2新等位基因全长序列，共十对引物，引物序列参照表1。反应体系为30μl：2x taq pcr mix 15μl， dna (100 ng/μl) 1ul，primer-f、primer-r各2μl，ddh2o 11.6μl。pcr的扩增程序为95℃ 5 min；95℃ 15 s，55℃ 15 s，72℃1 min 20s，33个循环； 72℃ 5min。扩增出产物用1 %的琼脂糖电泳检测,进行测序分析。利用snapgene对测序结果进行比对，参照日本晴的badh2基因组序列（国家水稻数据中心）。
34.表1：badh2基因全长扩增引物：
badh2基因序列测序结果与日本晴badh2参考序列进行比对发现，该badh2新等位基因对应于日本晴参考基因组8号染色体上第20384875-20384929区间发生55bp的缺失（图1）。
35.五、badh2新等位基因的分子标记对水稻香味性状筛选的验证与应用。
36.实例1 以携带badh2新等位基因香稻品种、日本晴和非香稻品种华航48号为对象，利用鉴定该新等位基因的分子标记引物对以上三个水稻种质进行基因分型分析，发现分子标记在badh2新等位基因香稻品种中与日本晴和华航48号中不同（图2）。叶片中香味物质2-ap测定结果显示，携带badh2新等位基因种质中存在2-ap香味物质，含量为172ug/kg，而日本晴和华航48号中不存在香味物质2-ap，测定含量均为 0 ug/kg。
37.实例2具体解释发明检测badh2新等位基因标记的发明过程。
38.一、含有与水稻香味物质2-ap合成显著相关的badh2新等位基因突变位点的目的片段为8号染色体中的一段195bp的核苷酸序列（具体核苷酸序列如seq id no：03所示），序列扩增的上下游引物为primer-f和primer-r，其核苷酸序列如下：上游引物primer-f：5
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,
；下游引物primer-r：5
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。
39.（二）pcr扩增的体系与条件设置。
40.反应体系为30μl：2x taq pcr mix 15μl， dna (100 ng/μl) 1ul，primer-f、primer-r各2μl，ddh2o 11.6μl。pcr的扩增程序为95℃ 5 min；95℃ 15 s，55℃ 15 s，72℃ 35s，33个循环； 72℃ 5min。扩增出的pcr产物用3%的琼脂糖电泳检测结果。
41.实例3 标记的应用。
42.以携带badh2新等位基因香稻品种为母本、非香稻品种华航48号父本构建杂交群体，利用鉴定该新等位基因的分子标记引物对f2进行基因分型分析，发现群体中存在三种带型：
①
与携带badh2新等位基因种质相同；
②
同时出现badh2新等位基因和华航48号的杂合带型；
③
与华航48号相同（图3）。香味物质2-ap测定结果显示，携带
①
型标记的单株，存在2-ap香味物质，而携带
②
和
③
型分子标记的单株不存在香味物质2-ap（表2）。
43.表2：分子标记在f2群体检测的不同类型与2-ap含量的测定结：
根据上述基因分型及判定结果，统计出新等位基因分子标记在群体中的准确率为100%，因此本专利开发的分子标记可应用于水稻幼苗阶段由于新等位基因分子标记的存在而使水稻产生香味的性状鉴定。
44.需要说明的是，以上所述的实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对本发明作出的一些非本质的改进和调整仍属于本发明的保护范围。

技术特征：
1.一种与水稻香味性状相关的分子标记，其特征在于：所述分子标记为badh2新等位基因，位于水稻第8号染色体上，其序列对应于日本晴参考基因组8号染色体上第20384875-20384929位点的55bp片段缺失，导致水稻中香味物质2-ap的积累产生香味。2.根据权利要求1所述的分子标记，其特征在于：所述badh2新等位基因突变位点的目的片段采用核苷酸序列如seq id no：01~02所示的引物扩增，产物为seq id no：03所示的一段195bp的基因片段。3.一种引物对，其特征在于：所述引物对用于扩增权利要求1所述的分子标记，所述引物对包含上游引物primer-f和下游引物primer-r，所述上游引物primer-f的核苷酸序列如seq id no：01所示，所述下游引物primer-r的核苷酸序列如seq id no：02所示。4.一种试剂盒，包含权利要求3所述的引物对。5.权利要求1所述的分子标记、权利要求3所述的引物对或权利要求4所述的试剂盒在如下任意一种中的应用：鉴定水稻香味性状；水稻遗传育种；改良水稻香味性状。6.一种水稻香味性状的鉴定方法，其特征在于：通过与水稻香味物质2-ap合成相关的分子标记进行鉴定；所述分子标记位于水稻第8号染色体上，其序列对应于日本晴参考基因组8号染色体上第20384875-20384929位点，鉴定所述第20384875-20384929位点是否存在55bp片段缺失。7.一种水稻香味性状的遗传改良的方法，其特征在于：包含如下步骤：确定水稻育种群体中位于水稻 8 号染色体上与水稻香味性状相关的如权利要求1所述的分子标记，并根据所述分子标记做出筛选：对于日本晴参考基因组第8号染色体上第20384875-20384929的核苷酸片段缺失的纯合水稻单株进行保留。

技术总结
本发明涉及与水稻香味性状相关的分子标记、引物对及其应用，属于分子生物技术和分子标记技术领域，本发明具体涉及位于水稻第8号染色体上一个Badh2新等位基因，序列对应于日本晴水稻参考基因组第8号染色体第20384875-20384929区间发生的55bp缺失。该片段的缺失导致Badh2新等位基因的编码产物发生选择性剪接，产生无功能蛋白，导致水稻产生2-AP，使水稻产生香味。本发明利用该特异等位基因的序列开发了分子标记，并提供了鉴定该分子标记的引物对，利用分子标记和引物对可建立高效准确的分子标记辅助育种技术，将其应用于水稻香味性状的改良中，从而提高稻米的品质及商品价值，提高水稻种植户的利润。高水稻种植户的利润。高水稻种植户的利润。


技术研发人员：杨瑰丽 梁雪雨 王慧 刘永柱 郭涛 陈淳 黄翠红 周丹华 胡明珠
受保护的技术使用者：华南农业大学
技术研发日：2022.12.09
技术公布日：2023/9/25