一种用于检测HCMV病毒的核酸适配体、试剂盒及应用的制作方法

一种用于检测hcmv病毒的核酸适配体、试剂盒及应用
技术领域
1.本发明属于hcmv病毒检测技术领域，具体涉及一种用于检测hcmv病毒的核酸适配体、试剂盒及应用。


背景技术：

2.巨细胞病毒(cytomegalovirus，cmv)，又称为细胞包涵体病毒，是疱疹病毒科的一种病毒，是一种dna病毒。感染巨细胞病毒的细胞会产生肿大，并具有巨大的核内包涵体。巨细胞病毒对宿主或者培养的细胞有高度的种特异性。人巨细胞病毒(human cytomegalovirus，hcmv)是疱疹病毒家族中基因组最大的成员，其分布广泛，其他动物皆可遭受感染，从而引起以生殖泌尿系统，中枢神经系统和肝脏疾患为主的各系统感染，从轻微无症状感染直到严重缺陷或死亡。hcmv在人群中感染非常广泛，中国成人感染率达95％以上，通常呈隐性感染，多数感染者无临床症状，但在一定条件下侵袭多个器官和系统可产生严重疾病。hcmv感染的实验室诊断依赖于：
①
检测感染组织中hcmv细胞病理学、抗原或dna；
②
检测体液中病毒dna或抗原；
③
血清学转换验证；
④
分离来自组织或分泌物中的病毒。
3.对于hcmv病毒的样品检测在临床检测以及实验研究中十分重要，现有的技术中对于病毒感染或者病毒蛋白的检测多采用特异性的抗体进行识别，如中国专利cn105277695a公开了一种免疫磁微粒化学发光法hcmvpp65抗原检测试剂盒，cn101580537b公开了一种人巨细胞病毒ul49基因抗原肽、及其抗体与应用，cn108218982a公开了人巨细胞病毒anti-ul148多克隆抗体及其制备方法与应用。但是利用特异性抗体检测时制备过程较为复杂、检测步骤繁琐，成本较高，难以进行大规模的推广应用；同时抗体作为一种蛋白成本，具有不易表达合成、易降解、存在非特异性免疫圆形等缺点。目前也有采用pcr技术进行hcmv病毒的检测工作的，例如cn116042919a、cn105779644b、cn110846439b、cn101760560a等，但是其检测过程对实验仪器的要求较高，检测过程仍然较为繁琐。因此迫切的需要一种简单高效、特异性高、灵敏度高的hcmv病毒检测体系。
4.核酸适配体是一段单链核酸(一般大小在20～60个碱基左右)，能通过折叠形成特定的三维结构并与相对应的靶分子进行高亲和力、高特异性的结合；其可以通过模拟自然进化过程的人工筛选技术-指数富集配体系统进化技术(systematic evolution of ligands by exponential enrichment，selex)筛选得到，是一种具有识别功能的新型核酸分子。利用selex技术可以从随机单链核酸序列库中筛选出特异性的与靶物质高度亲和的核酸适配体，该技术已经成功的运用于许多靶物质的筛选，包括金属离子、有机染料、药物、蛋白质、氨基酸以及各种细胞因子等。该技术具有库容量大、适应范围广泛、分辨率高、亲和力高，筛选过程相对简便、快速、经济，实用性高等特点。同时筛选得到的核酸适配体对应靶标物质的高特异性和高亲和性的特点与抗体的功能类似，但是核酸适配体的靶标范围更加的广泛，可以很好地运用于医学检测、诊断和治疗等多个方面。
5.核酸适配体具有特异性和高亲和力的原因是单链核酸在遇到靶标分子时可以形成例如口袋、发卡、g-四聚体等独特的三维结构，这些结构在结合靶标分子时的原理与抗体
特异性识别相应抗原决定簇的原理类似，例如通过氢键、疏水结构、离子键等与靶标分子特异性的结合。基于适配体具有较高特异性地识别病原微生物或者病变细胞的生物学特性，核酸适配体能被广泛的应用于检测技术以及生物传感器的构建，能够实现对于病原体或者疾病的精准诊断。因此可以开发一种利用核酸适配体对hcmv病毒的检测体系。


技术实现要素：

6.针对上述技术问题，本发明提供一种用于检测hcmv病毒的核酸适配体、试剂盒及其应用，通过selex技术反复筛选得到一个能特异性的与hcmv病毒靶蛋白结合的核酸适配体，并用其制备试剂盒，可以快速检测hcmv病毒，并且具有检测灵敏度高、特异性好等优点，可以进行大规模推广。
7.本发明采用的技术方案如下：
8.本发明提供一种用于检测hcmv病毒的核酸适配体，所述核酸适配体的核苷酸序列为seq id no:1。
9.优选的，所述核酸适配体的核苷酸序列上结合有荧光基团、纳米发光材料、生物素、地高辛和酶标记中的任一种。
10.优选的，所述荧光基团为fam荧光基团或cy5荧光基团；
11.所述纳米发光材料为纳米发光量子点；
12.所述酶标记为辣根过氧化物酶。
13.优选的，所述核酸适配体的核苷酸序列上具有磷酸化、甲基化、氨基化、巯基化或同位素化修饰中的任一种修饰。
14.本发明还提供了一种用于检测hcmv病毒的试剂盒，包含上述的核酸适配体。
15.优选的，所述核酸适配体的工作浓度为200nm，核酸适配体的溶解液为te缓冲液。
16.优选的，所述试剂盒还包括以下组分：
17.(a)固定样本溶液的蛋白包被板；
18.(b)蛋白包被液；
19.(c)封闭液；
20.(d)漂洗液；
21.(e)样本前处理液。
22.优选的，所述蛋白包被液的配方为30mm nahco3，15mm na2co3，ph 9.3-9.9；
23.所述封闭液的配方为136mm nacl，2.6mm kcl，2mm kh2po4，8mm na2hpo4，0.05％ tween-20，1％ bsa，ph 7.1-7.7；
24.所述漂洗液的配方为136mm nacl，2.6mm kcl，2mm kh2po4，8mm na2hpo4，0.05％ tween-20，ph 7.1-7.7；
25.所述样本前处理液的配方为：150mm nacl，1％ triton x-100，50mm tris，ph7.8-8.2。
26.本发明还提供了一种核酸适配体或含有该核酸适配体的试剂盒在检测hcmv病毒中的应用。
27.本发明的有益效果在于：
28.1、利用selex技术反复筛选得到的一条核酸适配体，核苷酸序列为seq id no:1，
其对hcmv病毒靶蛋白抗原表位具有较高的特异性和亲和力，与常规的特异性抗体相比，本发明筛选得到的核酸适配体具有无免疫原性、分子小、合成容易、可进行修饰、稳定性高不易降解、无毒害等优点。
29.2、利用筛选得到的核酸适配体制备得到了一种试剂盒，可以高灵敏度、高特异性、简单快速的检测hcmv病毒的感染情况，在hcmv病毒感染样本中检测灵敏度为94％，在未感染hcmv病毒的样本中阳性检出率为0，检测准确度高。本发明制备的试剂盒检测范围宽、操作简单、适用于大规模推广，具有良好的市场前景。
附图说明
30.图1为实施例12中hcmv病毒-aptamer核苷酸序列的二级结构示意图。
具体实施方式
31.下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案做进一步解释说明，值得注意的是，下述实施例仅为本发明的优选实施例，而不应理解为对本发明的限制，本发明的保护范围应以权利要求记载的内容为准。本领域技术人员在没有做出创造性劳动而对本发明的技术方案做出的修改、替换均落入到本发明的保护范围之内。
32.下述实施例中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。
33.除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买获得或者可通过现有方法获得。
34.实施例1hcmv病毒靶蛋白的获取
35.(1)根据文献查阅与生物信息学分析，确定适合作为核酸适配体检测靶点的靶蛋白上的具体抗原表位区域；
36.(2)选择hcmv病毒pp65蛋白和gb蛋白上具有较强免疫原性的区域(pp65蛋白的第490～508位氨基酸和gb蛋白的第607～621位氨基酸)作为适配体筛选靶蛋白，构建出融合表达蛋白，融合表达蛋白的氨基酸序列为seq id no.2；
37.(3)根据(2)中确定的融合表蛋白的氨基酸序列，直接在公司进行核苷酸序列的合成以及原核密码子的优化；
38.(4)将合成的核苷酸序列利用双酶切连接法插入至原核表达载体pet32a的bamh i和hind iii的酶切位点之间，得到重组原核表达载体pet32a；
39.(5)将重组原核表达载体pet32a转入工程菌中，并用iptg诱导出融合表达蛋白，即为hcmv病毒靶蛋白。
40.实施例2核酸适配体文库的构建与引物设计
41.核酸适配体文库的构建需要满足以下条件：具有足够长的序列片段，便于后续识别、酶切、纯化；中间具有足够长的随机序列片段，使之有充分多的可能性与目标物相识别；两端引物不能形成二聚体，tm值基本一致，以满足短链pcr扩增的效率。
42.(1)基于以上的设计条件，通过公司体外合成含有45个随机序列的初始单链dna文库，其核苷酸序列为seq id no:3，初始单链dna文库在5’端和3’端均具有固定序列；
43.(2)针对核酸适配体5’端固定序列，设计合成的上游引物p1，其序列为seq id no:4；
44.(3)针对核酸适配体3’端固定序列，设计合成的下游引物p2，其序列为seq id no.5，其中p2的5’端连接有生物素基团biotin。
45.实施例3核酸适配体的筛选
46.利用selex筛选技术，从文库中筛选得到能有效结合hcmv病毒靶蛋白的核酸适配体序列，具体方法如下：
47.(1)阳性筛选：取10nmol的初始单链dna文库溶解在500μl的pbs溶液中，用92℃的恒温水浴锅水浴5min，之后迅速的插入冰中冰浴10min；然后与实施例1中诱导得到的hcmv病毒靶蛋白在冰上孵育1h，再加入ni-nta magnetic agarose beads，继续孵育1h；孵育完成后用磁性分离器吸附，去除上清，用2ml的pbs溶液洗涤beads；最后用10ml预冷的pbs重悬beads，充分吹打混匀后置于92℃恒温水浴中10min，13000
×
g离心后收集上清，即为第一轮筛选后特异性识别hcmv病毒靶蛋白的单链dna文库；
48.(2)pcr扩增：对步骤(1)中筛选得到的单链dna文库进行pcr扩增，制备次级双链dna文库；pcr反应体系见表1，反应程序见表2：
49.表1pcr反应体系
[0050][0051][0052]
表2 pcr反应程序
[0053]
温度时间循环数95℃3min195℃30s3555℃30s3572℃30s3572℃10min116℃∞-[0054]
将pcr产物取出进行琼脂糖凝胶电泳，选取清晰的电泳条带进行切胶回收，得到纯化的双链dna文库片段，即为次级双链dna文库；
[0055]
(3)次级单链dna文库的制备：将步骤(2)中得到的次级双链dna文库与100μl链酶亲和素标记的磁珠常温孵育20min，利用双链dna文库上的生物素与链酶亲和素的亲和作用将双链dna文库结合到磁珠的表面，然后用磁性分离器吸附，去除上清，用2ml的pbs洗涤磁
珠；再加入终浓度为200mm的naoh溶液常温反应10min使得双链dna文库变性成为单链，其中带有生物素标记的一条链会结合在磁珠上，不带生物素标记的另一条链会脱离到上清液中；收集上清液，用脱盐柱除去naoh，最后加入500μl的pbs溶液，收集到的溶液即为下一轮筛选所需要用到的次级单链dna文库；
[0056]
(4)重复上述的阳性筛选、pcr扩增以及次级单链dna文库的制备过程15次，最后筛选得到的单链dna文库对靶蛋白的识别能力最强，将得到的单链dna文库进行克隆测序，得到能够与hcmv病毒靶蛋白结合的单链dna，即为核酸适配体，命名为hcmv病毒-aptamer，dna序列为seq id no:1。
[0057]
实施例4 fam标记的核酸适配体
[0058]
(1)利用基因合成技术，在实施例3中筛选得到的hcmv病毒-aptamer的5’端用fam荧光基团标记，合成fam-hcmv病毒-aptamer；
[0059]
(2)在缓冲溶液中将fam-hcmv病毒-aptamer与不同浓度的hcmv病毒靶蛋白混合，在25℃下孵育，然后测定荧光各向异性，结果显示，可以检测到荧光。
[0060]
实施例5cy5标记的核酸适配体
[0061]
(1)利用基因合成技术，在实施例3中筛选得到的hcmv病毒-aptamer的5’端用cy5荧光基团标记，合成cy5-hcmv病毒-aptamer；
[0062]
(2)在缓冲溶液中将cy5-hcmv病毒-aptamer与不同浓度的hcmv病毒靶蛋白混合，在25℃下孵育，然后测定荧光各向异性，结果显示，可以检测到荧光。
[0063]
实施例6纳米荧光量子点标记的核酸适配体
[0064]
用荧光强度高、荧光半衰期长、化学稳定好的纳米荧光量子点(qd)对核酸适配体进行标记，使核酸适配体具有灵敏度高、特异性强、标记显影时间长等优点，具体方法如下：
[0065]
取实施例3中筛选得到的hcmv病毒-aptamer与纳米荧光量子点混合，在催化剂的作用下，于37℃振摇4h，使核酸适配体的5’端标记上纳米荧光量子点，命名为qd-hcmv病毒-aptamer；
[0066]
实施例7辣根过氧化物酶标记的核酸适配体
[0067]
(1)取20mg辣根过氧化酶(hpr)溶于90mmol/l pbs(ph 6.0)220μl中，加入3％ pbq乙醇溶液60μl，37℃黑暗条件下反应1h，过sephadex g100柱，收集棕色洗脱液；
[0068]
(2)在棕色洗脱液中加入1/10体积的1mol/l nahco3和2.7μl 5％ pei，轻柔混匀后以5mmol/l pbs(ph 6.0)于37℃黑暗条件下透析20h，得到酶标复合物，4℃保存备用；
[0069]
(3)取核酸适配体加入5mmol/l pbs(ph 6.0)至20μl，煮沸变形后加入(1)中制备得到的酶标复合物20μl以及5％戊二醛6μl，37℃下反应10min，得到辣根过氧化物酶标记的核酸适配体，命名为hrp-hcmv病毒-aptamer；
[0070]
(4)将(3)中得到的标记的核酸适配体用ddh2o稀释至不同浓度后煮沸变性，进行斑点杂交。
[0071]
实施例8核酸适配体的磷酸化修饰
[0072]
对实施例3中筛选得到的核酸适配体进行磷酸化修饰，得到p-hcmv病毒-aptamer；
[0073]
实施例9核酸适配体的甲基化修饰
[0074]
对实施例3中筛选得到的核酸适配体的进行甲基化，得到甲基化-hcmv病毒-aptamer。
[0075]
实施例10核酸适配体的氨基化修饰
[0076]
对实施例3中筛选得到的核酸适配体送至公司合成时进行氨基化修饰，得到amino-hcmv病毒-aptamer，然后进行灵敏度检测。
[0077]
实施例11hcmv病毒-aptamer核酸适配体的巯基化修饰
[0078]
对实施例3中筛选得到的核酸适配体送至公司合成时进行巯基化修饰，得到sh-hcmv病毒-aptamer，然后进行灵敏度检测。
[0079]
实施例12核酸适配体验证
[0080]
(1)二级结构的预测：
[0081]
利用结构预测软件rna structure program对实施例3筛选得到的核酸适配体进行二级结构的预测，结果如图1所示，hcmv病毒-aptamer可以形成特殊的颈环结构和发卡结构。
[0082]
(2)核酸适配体与靶蛋白结合力的验证
[0083]
使用fortebio octet red96相互作用分析仪检测核酸适配体与hcmv病毒靶蛋白的结合力，并以pbs溶液为对照，具体检测方法参考胡妍，陈玲，基于生物膜干涉技术检测pdl1抗体与pdl1抗原的亲和力；生物技术进展，2021，11(6)：795-801。检测结果见表3：
[0084]
表3核酸适配体与靶蛋白的亲和力
[0085]
样品与靶蛋白的解离常数kd(nm)hcmv病毒-aptamer8.3pbs对照无结合
[0086]
结果显示，hcmv病毒-aptamer与hcmv病毒靶蛋白的解离常数在纳摩尔级别，表明核酸适配体与靶蛋白的结合能力很强。
[0087]
(3)特异性检测
[0088]
分别用人血白蛋白、免疫血清球蛋白以及hcmv病毒靶蛋白与实施例2筛选得到的核酸适配体进行特异性检测，检测方法同样参考胡妍，陈玲，基于生物膜干涉技术检测pdl1抗体与pdl1抗原的亲和力；生物技术进展，2021，11(6)：795-801，检测结果见表4：
[0089]
表4核酸适配体的特异性检测结果
[0090]
样品与核酸适配体的解离常数kd(nm)人血白蛋白无结合免疫血清球蛋白无结合hcmv病毒靶蛋白有结合pbs对照无结合
[0091]
结果显示，核酸适配体仅与hcmv病毒靶蛋白结合，且其解离常数为纳摩尔级别，结合能力强；而并不与人血白蛋白、免疫血清球蛋白产生结合，表明筛选得到的核酸适配体特异性强。
[0092]
(4)稳定性检测
[0093]
取实施例3中筛选得到的核酸适配体0.2μg，分别放置于1ml常温血清、1ml水溶液中，4周后用rt-pcr检测核酸适配体的降解情况，同时以新鲜的0.2μg核酸适配体作为阳性对照，以无菌水作为阴性对照。
[0094]
检测结果显示，放置4周后的核酸适配体仍能够扩增出完整的条带，且条带亮度与
阳性对照组条带亮度一致，而阴性对照组未扩增出条带，表明核酸适配体结构稳定。
[0095]
实施例13病毒感染实验
[0096]
(1)感染细胞的获得：用hcmv病毒感染敏感宿主细胞，感染36h后用胰酶消化细胞，离心得到细胞沉淀并去除上清液，再用pbs重悬得到的感染细胞；
[0097]
(2)细胞的固定与透化处理：分别选取感染细胞和未感染细胞，用2-4％多聚甲醛固定，然后用0.1％皂角苷进行通透，得到感染细胞悬液和未感染细胞悬液；
[0098]
(3)将实施例3获得的带有fam荧光基团的核酸适配体分别与(2)中得到的感染细胞悬液、未感染细胞悬液混合处理1h，上流式细胞分析仪进行分析计算，结果见表5：
[0099]
表5细胞的荧光强度
[0100][0101][0102]
结果如表5所示，感染了hcmv病毒的细胞样品所对应的核酸适配体标记的荧光强度是未感染细胞的6.73倍，荧光强度显著升高，说明筛选得到的核酸适配体能够进行hcmv病毒感染的检测。
[0103]
实施例14检测hcmv病毒的试剂盒
[0104]
用于检测hcmv病毒的试剂盒主要包括以下几个组成部分：
[0105]
(a)用于固定样本溶液的96孔蛋白包被板：为具有蛋白吸附能力的elisa酶标板；
[0106]
(b)蛋白包被液：配方为30mm nahco3、15mm na2co3，ph为9.3-9.9，使用双蒸水配置；
[0107]
(c)封闭液：配方为136mm nacl，2.6mm kcl，2mm kh2po4，8mm na2hpo4，0.05％ tween-20，1％ bsa，ph为7.1-7.7，使用双蒸水配置；
[0108]
(d)漂洗液：配方为136mm nacl，2.6mm kcl，2mm kh2po4，8mm na2hpo4，0.05％ tween-20，ph为7.1-7.7，使用双蒸水配置；
[0109]
(e)核酸适配体：为实施例4合成的带有fam荧光基团标记的核酸适配体，并用te缓冲液溶解并配置成浓度为200nm的工作浓度；
[0110]
(f)样本前处理液：配方为150mm nacl，1％ triton x-100，50mm tris，ph7.8-8.2；
[0111]
将上述(b)-(f)组分按照混合，并置于(a)中包被板中，即制备得到检测hcmv病毒的试剂盒。
[0112]
实施例15hcmv病毒检测试剂盒应用
[0113]
取50份确定感染hcmv病毒阳性的样本与50份确定未感染hcmv病毒的阴性样本，分别用三个市售hcmv病毒抗原检测试剂盒与实施例14制备得到的检测试剂盒同时进行hcmv病毒检测，检测方法如下：
[0114]
(1)检测前将样本和所有试剂恢复至室温，将待测样本稀释作为待检测液；
[0115]
(2)向96蛋白包被板中相应的孔内加入100μl待检测液，室温孵育；
[0116]
(3)弃溶液并用漂洗液洗涤2次，每次在样品孔中加入200μl漂洗液，完成最后一次
洗涤后，通过吸取或倾倒而将残留的漂洗液进行去除；
[0117]
(4)向样品孔中添加200μl封闭液，室温孵育；然后弃溶液，重复步骤(3)；
[0118]
(5)向样品孔中添加100μl带有fam荧光基团标记的核酸适配体，避光室温孵育，然后弃溶液，重复步骤(3)中的洗涤4次；
[0119]
(6)使用全波段激光酶标仪对样品孔进行检测。
[0120]
其中三个市售的hcmv病毒抗原检测试剂盒分别为d3 dfa cmv identification kit，购买于quidel公司；cmvpp65 kit购买于mybiosource公司；cmv brite turbo kit购买于products公司，结果见表6：
[0121]
表6不同试剂盒对hcmv病毒的检测结果
[0122][0123]
由表6可以看出，实施例14制备的hcmv病毒检测试剂盒能够有效检测出hcmv病毒阳性样本，其灵敏度为94％，而对于未感染的hcmv病毒的阴性样本没有假阳性检出。三个市售的hcmv病毒抗原检测试剂盒对hcmv病毒阳性样本的灵敏度都低于实施例14制备的含有核酸适配体的试剂盒，并且products公司购买的cmv brite turbo kit存在假阳性检测。

技术特征：
1.一种用于检测hcmv病毒的核酸适配体，其特征在于：所述核酸适配体的核苷酸序列为seq id no:1。2.根据权利要求1所述的一种用于检测hcmv病毒的核酸适配体，其特征在于：所述核酸适配体的核苷酸序列上结合有荧光基团、纳米发光材料、生物素、地高辛和酶标记中的任一种。3.根据权利要求2所述的一种用于检测hcmv病毒的核酸适配体，其特征在于：所述荧光基团为fam荧光基团或cy5荧光基团；所述纳米发光材料为纳米发光量子点；所述酶标记为辣根过氧化物酶。4.根据权利要求1-3任一项所述的一种用于检测hcmv病毒的核酸适配体，其特征在于：所述核酸适配体的核苷酸序列上具有磷酸化、甲基化、氨基化、巯基化或同位素化修饰中的任一种修饰。5.一种用于检测hcmv病毒的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中包含有权利要求1-4任一项所述的核酸适配体。6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：所述核酸适配体的工作浓度为200nm，核酸适配体的溶解液为te缓冲液。7.根据权利要求5或6所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括以下组分：（a）固定样本溶液的蛋白包被板；（b）蛋白包被液；（c）封闭液；（d）漂洗液；（e）样本前处理液。8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于：所述蛋白包被液的配方为30mm nahco3，15mm na2co3，ph 9.3-9.9；所述封闭液的配方为136mm nacl，2.6mm kcl，2mm kh2po4，8mm na2hpo4，0.05% tween-20，1% bsa，ph 7.1-7.7；所述漂洗液的配方为136mm nacl，2.6mm kcl，2mm kh2po4，8mm na2hpo4，0.05% tween-20，ph 7.1-7.7；所述样本前处理液的配方为：150mm nacl，1% triton x-100，50mm tris，ph7.8-8.2。9.一种如权利要求1-4任一项所述的核酸适配体或权利要求5-8任一项所述的试剂盒在检测hcmv病毒中的应用。

技术总结
本发明公开了一种用于检测HCMV病毒的核酸适配体、试剂盒及应用，通过SELEX技术多次筛选得到了核苷酸序列为SEQ ID NO:1的核酸适配体，命名为HCMV病毒-aptamer。本申请筛选得到的核酸适配体可以用于检测HCMV病毒，并且具有较高的特异性和亲和力，具有分子小、可进行修饰、合成容易、稳定性高不易降解等优点；利用该核酸适配体构建检测试剂盒，可以简单快速的对HCMV病毒进行精确检测，对阳性样本的检测灵敏度高达94%。度高达94%。度高达94%。


技术研发人员：石康 邓坤 邹鑫 秦雪 牛俊涛 杨涛 林宇鑫 吴长玲
受保护的技术使用者：湖北朗德医疗科技有限公司
技术研发日：2023.06.26
技术公布日：2023/9/25