一种抑制H1N1流感病毒的多肽及其制备方法和用途与流程

一种抑制h1n1流感病毒的多肽及其制备方法和用途
技术领域
1.本发明涉及生物技术抗流感病毒技术领域，具体涉及一种多肽在制备预防和治疗流感病毒感染的药物中的应用。


背景技术：

2.流感病毒每年导致一种传染病，全世界有29万至65万人死亡，300万至500万人患有严重疾病。此外，由新出现的重组病毒引起的流行病可能对全球产生毁灭性的影响。因此，有必要继续努力改进疫苗和抗病毒药物作为对策。目前有两类抗病毒药物可供临床使用：神经氨酸酶抑制剂(nais：奥司他韦、扎那米韦、帕拉米韦)和m2离子通道抑制剂(金刚烷胺、金刚乙胺)。然而，目前流行的流感病毒在很大程度上对m2抑制剂s3具有耐药性。此外，nais的抗病毒能力相对较弱，这类药物的另一个担忧是耐药性的出现，就像2008年至2009年耐奥司他韦的h1n1流感流行季节一样。因此，流感病毒感染的治疗和预防需要更有效的抗病毒药物，具有新的作用机制。
3.流感病毒的异三聚体rna依赖性rna聚合酶(rdrp)由pa、pb1和pb2亚基组成。它负责在被感染细胞的细胞核中复制和转录分段的单链病毒rna基因组(vrna)。病毒mrna的转录是通过一种独特的“抢帽”机制进行的。这涉及到通过将初生的封顶转录本与pb2子单元结合，然后在核苷酸处被pa子单元中的依赖于cap的内切酶(cen)切割，从而实现对宿主rna聚合酶的高劫持。由pb1 subunit1的rdrp功能产生的短的、带cap酶的寡聚物作为病毒mrna转录的引物。病毒转录本在模板vrna保守的富集区域被一种机制聚腺苷酸化，以在核输出后转化为功能蛋白。由于“抢帽”是病毒复制的必要条件，因此cap-binding、endonuclease和rdrp活性都是小分子抑制物的有吸引力的靶点，实际上有几种针对聚合酶的新化合物正在积极的临床开发中。2014年，一种rna合成抑制剂favipiravir(avigan)在日本获得批准，尽管该适应症仅限于治疗对其他药物没有反应的新型流感病毒。pimodivir(jnj-63623872,vx-787)是一种pb2 cap-binding inhibitor，它单独与奥司他韦联合用于简单流感的病毒学疗效，但仅对a型流感病毒有效。因此，仍然需要继续努力发现和开发性能更好的流感药物。
4.相比于现有技术，本发明的有益效果为：
5.(1)申请人在研究中发现本发明所述多肽在抗流感病毒方面具有较好的效果，其可用于制备预防和治疗流感病毒疾病的制剂，具有极大的应用和研究前景。此前未公开报道该多肽可用于预防和治疗流感病毒疾病。
6.(2)本发明与现有文献报道的抗流感病毒肽类相比较，本发明合成的多肽由天然氨基酸组成，易于合成、分子量小，且具有抑制流感病毒活性，是一种高效、理想的抗病毒药物。


技术实现要素：

7.针对现有技术的不足，本发明提供了一种多肽在制备预防和治疗流感病毒感染的
药物中的应用，同时，本发明还提供一种预防和治疗流感病毒疾病的药物。
8.本发明的一个方面涉及一种多肽，结构式为：
9.ala-glu-arg-x-ala-tyr-glu-glu-lys-cys-leu-ile-y-arg-cys-ala-val，其中x、y均为疏水性氨基酸。在一些实施方案中，x、y分别选自ala、leu、ile、pro、thr、val、met中的一种。
10.在一些具体的实施方案中，该多肽序列分别为：
11.多肽1：ala-glu-arg-ala-ala-tyr-glu-glu-lys-cys-leu-ile-ala-arg-cys-ala-val；
12.多肽2：ala-glu-arg-ala-ala-tyr-glu-glu-lys-cys-leu-ile-leu-arg-cys-ala-val；
13.多肽3：ala-glu-arg-leu-ala-tyr-glu-glu-lys-cys-leu-ile-ala-arg-cys-ala-val；
14.多肽4：ala-glu-arg-leu-ala-tyr-glu-glu-lys-cys-leu-ile-leu-arg-cys-ala-val；
15.多肽5：ala-glu-arg-ile-ala-tyr-glu-glu-lys-cys-leu-ile-pro-arg-cys-ala-val；
16.多肽6：ala-glu-arg-pro-ala-tyr-glu-glu-lys-cys-leu-ile-pro-arg-cys-ala-val；
17.多肽7：ala-glu-arg-thr-ala-tyr-glu-glu-lys-cys-leu-ile-thr-arg-cys-ala-val；
18.多肽8：ala-glu-arg-met-ala-tyr-glu-glu-lys-cys-leu-ile-met-arg-cys-ala-val；
19.多肽9：ala-glu-arg-thr-ala-tyr-glu-glu-lys-cys-leu-ile-thr-arg-cys-ala-val；
20.多肽10：ala-glu-arg-pro-ala-tyr-glu-glu-lys-cys-leu-ile-ile-arg-cys-ala-val；
21.多肽11：ala-glu-arg-val-ala-tyr-glu-glu-lys-cys-leu-ile-ile-arg-cys-ala-val；
22.多肽12：ala-glu-arg-met-ala-tyr-glu-glu-lys-cys-leu-ile-ala-arg-cys-ala-val；
23.多肽13：ala-glu-arg-val-ala-tyr-glu-glu-lys-cys-leu-ile-leu-arg-cys-ala-val；
24.本发明的另一个方面，本发明所述多肽可以用于制备预防或治疗流感疾病的药物。
25.在一些实施方案中，所述与流感病毒感染相关的疾病选自甲型h1n1流感。
26.本发明再一个方面提供了所述药物在预防和治疗h1n1流感病毒疾病中的应用，本发明所述药物包括添加了其他药学上可接受的辅料、载体或辅助性成分制成以本发明所述多肽为主要活性成分的药物，可用于预防和治疗流感病毒疾病。
27.所述药学上可接受的辅料、载体或辅助性成分，包括药学领域常规的稀释剂、赋形
剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等，必要时，还可加入香味剂、甜味剂等。
28.具体如药学上常用的稀释剂和吸收剂，例如淀粉、糊精、硫酸钙、乳糖、甘露醇、蔗糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、碳酸钙、白陶土、微晶纤维素、硅酸铝等；药学上常用的湿润剂与粘合剂，如水、甘油、聚乙二醇、乙醇、丙醇、淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、紫胶、甲基纤维素、磷酸钾、聚乙烯吡咯烷酮等。
29.药学上常用的崩解剂，例如干燥淀粉、海藻酸盐、琼脂粉、褐藻淀粉、碳酸氢钠与枸橼酸、碳酸钙、聚氧乙烯、山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等；崩解抑制剂，如蔗糖、三硬脂酸甘油酯、可可脂、氢化油等。
30.药学上常用的润滑剂，例如滑石粉、二氧化硅、玉米淀粉、硬脂酸盐、硼酸、液体石蜡、聚乙二醇等。
31.药学常用的盐(水溶性或油溶性或可分散性产物形式)包括如从无机或有机酸或碱形成的常规无毒盐或季铵盐，包括酸加成盐，例如乙酸盐、已二酸盐、藻酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、亚硫酸盐、丁酸盐、柠檬酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡糖酸盐、乙磺酸盐、葡糖庚酸盐、甘油磷酸盐、半硫酸盐、乳酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、果胶酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐等。
32.本发明所述药物可以是注射剂、(注射用)冻干粉、固体制剂、喷雾剂、溶液、混悬液、乳液、半固体制剂、液体制剂、片剂、胶囊、肠溶片、丸剂、粉剂、颗粒剂、持续释放或延迟释释放等任一一种或几种的组合形式制剂。
33.本发明提供的药物进一步包含一种或多种治疗剂。所涉及的治疗剂是金刚胺(amantadine)、金刚乙胺(rimantadine)、奥司他韦(oseltamivir)、扎那米韦(zanamivir)、帕拉米韦(peramivir)、拉尼米韦(laninamivir)、拉尼米韦辛酸酯水合物(laninamivir octanoate hyd rate)、法匹拉韦(favipiravir)、阿比多尔(arbidol)、利巴韦林(ribavirin)、司他弗林、英加韦林(ingavirin)、流感酶(fludase)、流感疫苗或它们的组合。
具体实施方式
34.下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。
35.在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。
36.在本发明中使用的缩写具有下面的含义：
37.ala(alanine,a)：丙氨酸
38.glu(glutamic acid,e)：谷氨酸
39.his(histidine,h)：组氨酸
40.ile(isoleucine,i)：异亮氨酸
41.leu(leucine,l)：亮氨酸
pbs中(含2％bsa)。0.45um滤膜过滤除菌，取少量测定滴度，取2ml进行下一轮筛选，剩余-20℃保存备用。
66.g)噬菌体滴度测定。取5ul待测噬菌体上清，稀释到500ul lb培养基中，混匀后取5ul依次稀释，共4次，取50ul稀释到450ul lb中，混匀备用。取400ul稀释的phagemid-噬菌体上清，与400ul的对数生长期的大肠杆菌混合，室温静置感染30min，37℃，180rpm培养1h，取200ul铺atg平板，37℃培养过夜，计数菌落数并估算滴度。共进行4轮筛选，筛选产物与靶蛋白帽依赖性核酸内切酶结合活性的elisa鉴定将第4轮筛选得到的多肽库10倍系列稀释，感染大肠杆菌后铺于双层琼脂板中间。从少于100个蓝色噬菌斑的平板上随机挑取30个，分别进行扩增纯化。纯化后的噬菌体一部分提取核酸用于测序，另一部分滴度测定后用于elisa检测。将帽依赖性核酸内切酶蛋白以1μg/ml包被elisa板，对3轮筛选的洗脱产物和挑出的30个噬菌体克隆取2
×
1011pfu进行elisa检测，噬菌体克隆进行10-1、10-2和10-3共3个稀释度稀释，同时以野生型m13噬菌体为阴性对照.以bsa为空白对照。
67.2.噬菌体阳性克隆的序列测定
68.以病毒dna核酸提取试剂盒提取纯化后噬菌体的单链dna，并以此为模板，pcr扩增噬菌体展示多肽的dna片段送交测序，测序引物序列：5
′‑
caacgtgaaaaaattattcgc-3
′
。
69.实施例2多肽衍生物的合成
70.多肽合成采用标准的fmoc固相方法。选用rinkamide树脂，肽链由c端向n端延长。缩合剂为hbtu/hobt/diea。脱保护剂为哌啶/dmf溶液。裂解液为三氟乙酸(tfa)，粗肽水溶解后冻干保存。用中压液相色谱法或高压液相色谱法(hplc)分离纯化，纯肽含量大于90％。基质辅助激光解析飞行时间质谱(maldi tof ms)确定肽序列分子量。
71.实施例3体外细胞病变效应(cpe)试验评估化合物对h1n1流感病毒的活性实验
72.通过以下细胞病变效应(cpe)的实验，检测化合物对流感病毒a/wsn/33(h1n1)的抗病毒活性和对mdck细胞的毒性。
73.1.试验材料
74.(1)病毒株：流感病毒a/wsn/33(h1n1)株，由药明康德提供。
75.(2)细胞株：犬肾细胞(mdck)，由药明康德提供。
76.细胞培养：犬肾细胞(mdck)为贴壁生长细胞，将mdck犬肾细胞胞悬液加入含适量培养基的培养瓶中培养过夜；第二天换液并检查mdck细胞密度。如果mdck细胞密度达80％-90％，即可进行传代培养。加1ml消化液(0.25％trypsin-0.02％edta)于培养瓶中，使消化液浸润所有mdck细胞，将培养瓶置于37℃培养箱中消化1-3min(视细胞情况而定)，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加2-3ml完全培养基终止消化。轻轻打匀后装入无菌离心管中，1000rpm离心5min，弃去上清液，补加1-2ml培养液后吹匀。将mdck细胞悬液按1:2比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中，置于培养箱中培养，备用。
77.(3)细胞活力检测试剂盒cck8，购于上海李记生物。
78.(4)酶标仪：spectramax340pc384(molecular device)。
79.2.试验方法
80.cpe指病毒在宿主细胞内大量增殖，导致细胞病变甚至死亡的现象。通过检测细胞活力，cpe实验被广泛用于化合物对可引起细胞病变的病毒的抑制活性测定。本研究应用
cpe实验检测化合物对流感病毒ifva/wsn/33(h1n1)的体外抑制活性。
81.如下进行cpe抑制试验以评估测试抗体的效力。将96孔组织培养板中的mdck细胞与测试抗体和甲型流感(ifva/wsn/33(h1n1))在低感染率下于37℃培养72小时，通过添加0.5％甲醛来固定培养板，然后用0.5％结晶紫染色，随后，用微盘分析仪(multiskan ascent,thermo)测波长570nm的吸光值。使用细胞活力检测试剂cck8检测细胞活力。化合物的抗病毒活性和细胞毒性分别由化合物对病毒引起的细胞病变效应的抑制率(％)和细胞活率(％)表示。计算公式如下：
82.％抑制率＝(样品值-病毒对照平均值)
÷
(细胞对照平均值-病毒对照平均值)*100
83.％细胞活率＝(样品值-培养基对照平均值)
÷
(细胞对照平均值-培养基对照平均值)*100注：样品孔：化合物处理孔；
84.病毒对照孔：细胞感染病毒，无化合物处理；
85.细胞对照孔：细胞，无化合物处理或病毒感染；
86.培养液对照孔：只有培养液，不含细胞、病毒或化合物。
87.使用graphpadprism(version 5)软件对化合物的抑制率和细胞活率进行非线性拟合分析，得到化合物的ec
50
和cc
50
值。
88.3.测试结果
89.化合物抗流感病毒a/wsn/33(h1n1)活性和对mdck细胞毒性总结于表1。实验结果显示实施例化合物对流感病毒a/wsn/33(h1n1)具有较好的抑制活性和较低的细胞毒性。其中，对ifva/wsn/33流感病毒，多肽3、4和13的ec
50
值小于10nm。
90.表1各候选多肽衍生物对a/wsn/33(h1n1)的抑制活性
91.92.
技术特征：
1.一种治疗流感病毒感染的多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列为ala-glu-arg-x-ala-tyr-glu-glu-lys-cys-leu-ile-y-arg-cys-ala-val，其中x、y均为疏水性氨基酸。2.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于：所述的x、y分别为ala、leu、ile、pro、thr、val、met中的一种。3.根据权利要求1或2所述的多肽，其特征在于：所述的多肽序列分别为：多肽1：ala-glu-arg-ala-ala-tyr-glu-glu-lys-cys-leu-ile-ala-arg-cys-ala-val；多肽2：ala-glu-arg-ala-ala-tyr-glu-glu-lys-cys-leu-ile-leu-arg-cys-ala-val；多肽3：ala-glu-arg-leu-ala-tyr-glu-glu-lys-cys-leu-ile-ala-arg-cys-ala-val；多肽4：ala-glu-arg-leu-ala-tyr-glu-glu-lys-cys-leu-ile-leu-arg-cys-ala-val；多肽5：ala-glu-arg-ile-ala-tyr-glu-glu-lys-cys-leu-ile-pro-arg-cys-ala-val；多肽6：ala-glu-arg-pro-ala-tyr-glu-glu-lys-cys-leu-ile-pro-arg-cys-ala-val；多肽7：ala-glu-arg-thr-ala-tyr-glu-glu-lys-cys-leu-ile-thr-arg-cys-ala-val；多肽8：ala-glu-arg-met-ala-tyr-glu-glu-lys-cys-leu-ile-met-arg-cys-ala-val；多肽9：ala-glu-arg-thr-ala-tyr-glu-glu-lys-cys-leu-ile-thr-arg-cys-ala-val；多肽10：ala-glu-arg-pro-ala-tyr-glu-glu-lys-cys-leu-ile-ile-arg-cys-ala-val；多肽11：ala-glu-arg-val-ala-tyr-glu-glu-lys-cys-leu-ile-ile-arg-cys-ala-val；多肽12：ala-glu-arg-met-ala-tyr-glu-glu-lys-cys-leu-ile-ala-arg-cys-ala-val；多肽13：ala-glu-arg-val-ala-tyr-glu-glu-lys-cys-leu-ile-leu-arg-cys-ala-val。4.如权利要求1 3任一项所述的多肽的制备方法，其特征在于，所述多肽采用fmoc多肽合成法制备。5.如权利要求1 3任一项所述的多肽在制备预防和治疗甲型h1n1流感病毒感染药物中的应用。6.一种预防和治疗甲型h1n1流感病毒感染药物，其特征在于，所述药物的药效成分包括权利要求1 3任一项所述的抑制流感病毒的多肽，以及药学上可接受的辅料、载体或辅助性成分。
7.根据权利要求6中所述的用于预防或治疗甲型h1n1流感疾病的药物，其特征在于：药物的剂型包括注射剂、冻干粉针、微球、粉末、粉雾剂、胶囊、片剂、药丸、鼻喷剂、气雾剂、肠溶衣、毫微球、微乳或复乳。8.根据权利要求6中所述的药物，其特征在于，所述药物还包括一种或多种治疗剂。9.根据权利要求8中所述的药物，其特征在于，所述治疗剂包括抗流感病毒剂或疫苗。

技术总结
本发明提供了一种抑制H1N1流感病毒的多肽，属于生物医药领域，具有Ala-Glu-Arg-X-Ala-Tyr-Glu-Glu-Lys-Cys-Leu-Ile-Y-Arg-Cys-Ala-Val(其中X、Y均为疏水性氨基酸)所示的氨基酸序列。同时，本发明还公开了一种药物组合物，所述药物组合物包含有效量的本发明所述多肽，也可添加其他药学上可接受的辅料、载体或辅助性成分，还可添加其他一种或多种治疗剂。实验结果显示，该类多肽能显著抑制H1N1流感病毒的增殖，提示其在抗流感病毒治疗中具有重要的开发和应用价值，可用于制备抗流感药物。物。


技术研发人员：葛瑞
受保护的技术使用者：北京凯因格领生物技术有限公司
技术研发日：2023.06.26
技术公布日：2023/9/25