高产γ-氨基丁酸的鸟肠球菌及其筛选方法与应用

高产
γ-氨基丁酸的鸟肠球菌及其筛选方法与应用
技术领域
1.本发明属于食品微生物技术领域，具体涉及高产γ-氨基丁酸的鸟肠菌株及其筛选方法与应用。


背景技术：

2.γ-氨基丁酸(gaba)是一种非蛋白原性氨基酸，白色粉末，广泛存在于自然界中，易溶于水，微溶于热乙醇，不溶于冷乙醇、乙醚和苯。gaba可降低血氨，促进大脑新陈代谢，调节体内代谢平衡；可作为神经递质信号的抑制剂，可调节睡眠，治疗人体头痛、肝昏迷、高血压等生理疾病，同时还能合成2-吡咯烷酮和4-聚酰胺尼龙，应用在食品和工业生产。
3.由于γ-氨基丁酸的应用领域广泛，大大增加了市场需求量。目前，由乳酸菌发酵生产合成的γ-氨基丁酸，可添加至饮料、巧克力和巧克力制品、糖果、烘焙食品、膨化食品等中。随着人们对食品安全的重视，越来越多的研究者聚焦在利用乳酸菌生产γ-氨基丁酸，因此，获得安全、有工业价值的γ-氨基丁酸产生菌是非常重要的。
4.生物法制备gaba主要包括生物发酵法和生物转化法，均是菌株利用谷氨酸钠为底物合成gaba，主要是依靠谷氨酸脱羧酶系统(gad系统)实现的。gad系统包括谷氨酸脱羧酶（gad）与谷氨酸-gaba反向转运蛋白。当微生物受到酸胁迫时，h+会渗漏至胞内，微生物利用glu-gaba反向转运蛋白，将胞外的谷氨酸转运至胞内，由胞内的谷氨酸脱羧酶(gad)催化脱去α-羧基，产生gaba，同时产生的gaba进一步被glu-gaba反向转运蛋白运输至胞外。整个系统产生1分子gaba，同时消耗1分子胞内h+，进而稳定胞内的ph，同时缓解胞外酸胁迫。
5.虽然通过培养基、发酵工艺优化能显著提高gaba的产量，但在实际生产过程中，实验室规模的高效生产过程并不能满足工业生产低成本高利润的需求，相比而言，本身具有高产率的生产菌株才更有实际的生产意义。因此，筛选高效产生gaba的菌株，仍然是推进gaba工业化应用的基础。
6.目前gaba产生菌的筛选方法多基于纸层析法、薄层层析法、高效液相色谱法进行初筛或复筛。其中，纸层析法虽然操作简单、成本低，但耗时长；薄层色谱法检测方便灵敏度高，但耗时长；高效液相色谱法灵敏度高，但操作繁琐成本高，不宜作为初筛方法。
7.鸟肠球菌可以产生gaba，但是其产量低，如何获得具有高产gaba的鸟肠球菌是解决菌株工业化应用必须的过程。


技术实现要素：

8.针对现有技术的不足，本发明提供了一种高产γ-氨基丁酸的鸟肠菌株及其筛选方法与应用，本发明筛选方法简单，高效，筛选得到的鸟肠菌株可高产γ-氨基丁酸，具有良好的市场应用前景。
9.为解决现有技术问题，本发明采取的技术方案为：高产γ-氨基丁酸的鸟肠球菌g5，于2022年10月28日保藏在中国普通微生物保藏管理中心，保藏编号为cgmcc no.25992，分类学命名为鸟肠球菌enterococcus avium。
10.作为改进的是，所述高产γ-氨基丁酸的鸟肠球菌为乳白色菌落，菌落直径为0.1
ꢀ±
0.05 mm，边缘整齐，革兰氏阳性，无芽孢，不运动。
11.上述高产γ-氨基丁酸的鸟肠球菌的筛选方法，包括以下步骤：步骤1，富集培养基配制mrs培养基、gyp培养基、添加不同浓度谷氨酸钠的mrs培养基、gyp培养基；步骤2，富集方法称取粉碎后的白酒酒曲于锥形瓶中，加入无菌的mrs培养基或gyp液体培养基，摇匀，于37℃静置培养48 h，取发酵液接种于含有谷氨酸钠的mrs或gyp液体培养基中37℃，200 rpm培养48 h；步骤3，挑取单菌落接种于含有谷氨酸钠的gyp液体发酵培养基中，以产生ph》5的发酵液作为初筛标准，进一步分离、纯化后移入装有mrs培养基的试管中，4℃保存，利用分光光度法与hplc法对菌株进行复筛，检测γ-氨基丁酸的合成，并通过平板纯化获得高产γ-氨基丁酸的菌株。
12.作为改进的是，步骤2中所述白酒酒曲为清香型白酒大曲、浓香型白酒大曲、酱香型白酒大曲、芝麻香型白酒大曲或兼香型白酒大曲。
13.一种含γ-氨基丁酸的冻干菌粉，利用上述鸟肠球菌cz1发酵液进行制备，且所得冻干菌粉的出料水分含量≤10%，冷却后密封；具体步骤为：取鸟肠球菌g5进行发酵，当发酵液中γ-氨基丁酸的含量不低于20-25 g/l时，采用60-65℃浓缩1-3 h，总固形物含量达到30-40%后，经喷雾干燥，即得所述含有gaba的冻干菌粉。
14.作为改进的是，所述喷雾干燥条件为：进料温度40-50℃，进口温度100-120℃，出口温度60-70℃，进口气压0.4-0.5 mpa，离心转盘转速18500-19000 rpm，干燥时间为10-15s。
15.一种微生物菌剂，含有上述的高产γ-氨基丁酸的鸟肠球菌g5或含有上述的冻干菌粉。
16.上述高产γ-氨基丁酸的鸟肠球菌g5、冻干菌粉，或微生物菌剂在制备食品、药物或者畜禽养殖上的应用。
17.有益效果：与现有技术相比，本发明将酿造白酒的发酵剂大曲作为筛选资源，通过微生物富集、gaba产生菌双重富集的方式，使gaba产生菌得到高度富集；结合快速检测ph的方式，初筛gaba产生菌，同时结合比色法复筛及平板纯化，可高效快速筛选gaba产生菌，本发明筛选方法低毒、高效、无污染，同时可进一步检测其生产性能。
18.另外，通过本方法筛选的高产γ-氨基丁酸的乳酸菌，具有高产gaba的能力，制备的高活力菌剂可应用于食品、医药、禽畜养殖等行业，为推进鸟肠球菌工业化应用提供技术支持。可以为gaba生产菌的来源提供新思路，同时制备出含高γ-氨基丁酸产物的果汁及酸牛奶。
附图说明
19.图1为白酒大曲的gaba产生菌筛选平板图2为白酒大曲中初筛gaba产生菌；
图3为高效液相色谱法检测gaba产生菌的合成能力。
20.图4为菌株g5的菌落形态特征图；图5为菌株g5的革兰氏染色及细胞形态图；图6为鸟肠球菌g5的16s rrna扩增电泳图。
具体实施方式
21.实施例1γ-氨基丁酸产生乳酸菌的筛选1.培养基mrs培养基：葡萄糖2%，酵母浸粉 0.5%，蛋白胨1%，牛肉膏1%，磷酸氢二钾 0.2%，柠檬酸三铵 0.2%，乙酸钠0.5%，硫酸镁0.058%，硫酸锰0.025%，吐温80 1 ml，ph 6.2，均为质量-体积分数。
22.gyp培养基：葡萄糖1%，酵母膏1%，蛋白胨0.5%，乙酸钠0.2%，硫酸镁0.02%，硫酸锰0.01%，硫酸亚铁0.01%，氯化钠0.01%，均为质量-体积分数。固体培养基中添加2%浓度的琼脂。
23.2.方法将白酒大曲粉碎，过100目筛子后制成白酒大曲曲粉。
24.采用梯度稀释分离法，称取白酒(汾酒)大曲曲粉0.5 g，加入至5 ml mrs或gyp的液体培养基中，37℃静置培养48 h，制成一级富集种子液。
25.吸取一级富集种子液，按10%接种量接种于5 ml 含有10-50 g/l mrs或gyp的液体培养基中，37℃，200 rpm 培养48 h，制成二级富集种子液。
26.吸取0.1 ml二级富集种子液，进行梯度稀释（10-1-10-5
），取0.1 ml 浓度为10-4
，10-5
的菌悬液，分别涂布于含有50 g/l 谷氨酸钠及溴甲酚绿的gyp和mrs培养基平板上，37℃，厌氧培养48 h。
27.分别挑取平板上菌落周围颜色变黄的单一菌落（图1），进行富集纯化，将mrs上富集产生的菌落接种于gyp液体种子培养基中，37℃，厌氧培养48 h。
28.按10%的接种量，将种子液接种于添加1%的谷氨酸钠gyp液体培养基中，37℃，厌氧培养60 h，采用ph检测，初步筛选ph高于5的菌株（图2）。
29.将经复筛获得的gaba高产菌株的菌液，稀释为10-5
后涂于mrs平板上，37℃静置培养48 h后，挑取3-5个单一菌落，接种于含有50 g/l谷氨酸钠的mrs液体培养基中，37℃，200 rpm培养48 h，检测ph，选择ph与初筛时结果相似的菌，该菌即为纯化后的单一菌株并通过hplc检测发酵上清的γ-氨基丁酸的含量。
30.结果表明，经筛选获得15株gaba产量大于1 g/l的菌株，其中gaba产量最高的g5（图3），产量为27.7 g/l。
31.实施例2γ-氨基丁酸高产菌株g5的鉴定将筛选获得的高产γ-氨基丁酸菌株进行16s rdna鉴定。以gyp液体培养基，37℃培养24 h得到的菌液，用常规细菌基因组提取方法提取基因组dna。
32.以此基因组为模版，27f/1492r为扩增引物，其中扩增引物的序列为：27f：agagtttgatcmtggctcag；1492r：ggttaccttgttacgactt，takara的primerstar mix dna聚合酶进行pcr。加样比例为：模版1 μl，引物各0.5 μl，dna聚合酶25 μl，灭菌超纯水23 μl。pcr
条件为98℃，40 s预变性，98℃ 10 s变性，55℃ 15 s退火，72℃延伸90 s，30个循环，72℃后延伸10 min。扩增后的电泳图如图6所示。
33.将pcr产物经纯化后，送于生工测序，测序结果表明，其长度为1452 bp，经blast比较分析，该菌株的16s rdna与鸟肠球菌的同源性为99%，因此，鉴定为鸟肠球菌 （enterococcus avium），记为鸟肠球菌g5，分类学命名为鸟肠球菌enterococcus avium，于2022年10月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为cgmcc no. 25992。
34.实施例3利用鸟肠球菌g5制备含gaba的干菌粉以50 g/l谷氨酸钠为底物，将鸟肠球菌g5接种于mrs液体培养基中，37℃，200 rpm培养48 h。将发酵结束后的发酵液整体进行浓缩，浓缩条件为65℃，0.5 h。将浓缩液经喷雾干燥制成含有gaba的干菌粉。
35.喷雾干燥条件为：进料浓度为50%，进料温度40℃，进口温度120℃，出口温度60℃，进口气压0.4 mpa，离心转盘转速保藏19000 r/min；干燥后含gaba的干菌粉收率为20 %，水分含量7%，活菌数达4.0
×
109cfu/g，gaba含量≥20%。
36.实施例4鸟肠球菌g5发酵制备含γ-氨基丁酸的乳制品、果汁饮品从活化的gyp固体斜面培养基上挑取适量的鸟肠球菌g5，接于液体gyp种子液中，37℃静置培养48 h；取48 h的种子培养液，按10%的接种量接种于含有10 g/l谷氨酸钠的mrs培养基中，37℃静置培养48 h做发酵种子；采用10 ml试管中装入5 ml纯牛奶或桑葚汁（加入纯水50%），同时加入10 g/l 谷氨酸钠，取培养48 h的发酵种子，去除培养基后用生理盐水重悬，按10%的接种量分别接种于纯牛奶与桑葚汁中，37℃，培养48 h，发酵液经高效液相色谱检测，γ-氨基丁酸的含量分别为169 mg/l与376 mg/l，活菌数分别为2.5
×
109cfu/ml 与1.66
×
108cfu/ml。
37.综上所述，本发明将酿造白酒的发酵剂大曲作为筛选资源，通过微生物富集、gaba产生菌双重富集的方式，使gaba产生菌得到高度富集；结合快速检测ph的方式，初筛gaba产生菌，同时结合比色法复筛及平板纯化，可高效快速筛选gaba产生菌，本发明筛选方法低毒、高效、无污染，同时可进一步检测其生产性能。通过本方法筛选的高产γ-氨基丁酸的乳酸菌，具有高产gaba的能力，制备的高活力菌剂可应用于食品、医药、禽畜养殖等行业，为推进鸟肠球菌工业化应用提供技术支持。制备出含高γ-氨基丁酸产物的果汁及酸牛奶，为gaba生产菌的来源提供新思路。

技术特征：
1. 高产γ-氨基丁酸的鸟肠球菌g5，于2022年10月28日保藏在中国普通微生物保藏管理中心，保藏编号为cgmcc no.25992，分类学命名为鸟肠球菌enterococcus avium。2.根据权利要求1所述的高产γ-氨基丁酸的鸟肠球菌g5，其特征在于，所述高产γ-氨基丁酸的鸟肠球菌为乳白色菌落，菌落直径为0.1
ꢀ±
0.05 mm，边缘整齐，革兰氏阳性，无芽孢，不运动。3.基于权利要求1所述的高产γ-氨基丁酸的鸟肠球菌g5的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1，富集培养基配制mrs培养基、gyp培养基、添加不同浓度谷氨酸钠的mrs培养基、gyp培养基；步骤2，富集方法称取粉碎后的白酒酒曲于锥形瓶中，加入无菌的mrs培养基或gyp液体培养基，摇匀，于37℃静置培养48 h，取发酵液接种于含有谷氨酸钠的mrs或gyp液体培养基中37℃，200 rpm培养48 h；步骤3，挑取单菌落接种于含有谷氨酸钠的gyp液体发酵培养基中，以产生ph>5的发酵液作为初筛标准，进一步分离、纯化后移入装有含有谷氨酸钠的mrs培养基中，利用分光光度法与hplc法对菌株进行复筛，检测γ-氨基丁酸的合成，并通过平板纯化获得高产γ-氨基丁酸的菌株。4.根据权利要求3所述的高产γ-氨基丁酸的鸟肠球菌g5的筛选方法，其特征在于，步骤2中所述白酒酒曲为清香型白酒大曲、浓香型白酒大曲、酱香型白酒大曲、芝麻香型白酒大曲、或兼香型白酒大曲。5.一种含γ-氨基丁酸的冻干菌粉，其特征在于，利用权利要求1所述的鸟肠球菌g5发酵液进行制备，且所得冻干菌粉的出料水分含量≤10%，冷却后密封；具体步骤为：取鸟肠球菌g5进行发酵，当发酵液中γ-氨基丁酸的含量不低于20-25 g/l时，采用60-65℃浓缩1-3 h，总固形物含量达到30-40%后，经喷雾干燥，即得所述含有gaba的冻干菌粉。6.根据权利要求5所述的一种含γ-氨基丁酸的冻干菌粉，其特征在于，所述喷雾干燥条件为：进料温度40-50℃，进口温度100-120℃，出口温度60-70℃，进口气压0.4-0.5 mpa，离心转盘转速18500-19000rpm，干燥时间为10-15s。7.一种微生物菌剂，其特征在于，含有权利要求1所述的高产γ-氨基丁酸的鸟肠球菌g5或含有权利要求5的冻干菌粉。8.基于权利要求1所述的高产γ-氨基丁酸的鸟肠球菌g5、权利要求5所述的冻干菌粉，或权利要求7所述的微生物菌剂在制备食品、药物或者畜禽养殖上的应用。

技术总结
本发明属于食品微生物技术领域，公开了一株高产γ-氨基丁酸的鸟肠球菌及其筛选方法与应用。本发明鸟肠球菌G5筛选自白酒大曲曲粉中，于2022年10月28日保藏在中国普通微生物保藏管理中心，保藏编号为CGMCC NO.25992。本发明筛选方法高效安全，且所得鸟肠球菌G5菌株具有高产γ-氨基丁酸的能力，以50 g/L谷氨酸钠为底物，GABA产量可达27.7 g/L，是目前的肠球菌GABA产生的最高产量。同时将鸟肠球菌G5菌株应用于乳酸菌制品，均为国际上公认的安全健康食品，具有良好的市场前景。具有良好的市场前景。具有良好的市场前景。


技术研发人员：宫璐婵 李婷婷 邹晓洲 吕舒怡 王俊
受保护的技术使用者：江苏科技大学
技术研发日：2023.01.09
技术公布日：2023/9/25