一种新7β-羟基类固醇脱氢酶及应用

一种新7
β-羟基类固醇脱氢酶及应用
技术领域
1.本发明涉及一种新7β-羟基类固醇脱氢酶及应用，属于基因工程与生物催化领域。


背景技术：

2.熊去氧胆酸(ursodesoxycholic acid，udca)，化学名称为3α，7β-二羟基-5β-胆甾烷-24-酸，是美国fda批准的唯一一种用于治疗原发性胆汁性肝硬化(pbc)的一线药物，是一种具有多种生物活性的亲水性胆汁酸，也是治疗胆汁淤积性肝病的重要药物。在近些年的研究发现，udca在治疗癌症方面有着显著的疗效，udca可特异性的调控细胞凋亡的阈值，抑制癌细胞的生长并诱导细胞自噬和凋亡。
3.7β-羟基类固醇脱氢酶(7β-hydroxysteroid dehydrogenas，7β-hsdh，ec 1.1.1.201)，是一类nadp(h)依赖性酶，属于短链脱氢酶/还原酶(sdr)超家族，反向催化类固醇、胆汁酸和其他类固醇衍生物的羟基的氧化反应，一般具有较高的立体选择性和区域选择，是制备熊去氧胆酸的关键生物催化剂，可以将c-7位上的酮羰还原成位β取向的羟基。7β-hsdh来源广泛，可以从ncbi数据库中检索出多种不同来源的7β-hsdh，目前，已报道微生物来源的有：clostridium absonum、collinsella aerofaciens、ruminococcus gnavus、ruminococcus torques、xanthomonas maltophilia和lactobacillus spicheri它们之中有由野生型微生物进行表达，也有将其基因克隆到其他宿主细胞中进行表达。
4.近年来，生物催化制备udca的技术发展迅速，相较于化学合成具有绿色高效且安全等优势。辅因子再生系统是氧化还原酶类的催化反应体系的提供氢离子的核心技术。鹅去氧胆酸(chenodeoxycholic acid，cdca)可以通过两步的转化为udca，首先，将c-7的α取向的羟基氧化为羰基生成中间产物7-酮基-石胆酸(7-ketolithocholic acid，7k-lca)这其中伴随着nad(p)
+
转化为nad(p)h，紧接着将7k-lca的c-7的羰基还原为β取向的羟基生成最我们所需的udca，同时伴随着nad(p)h转化为nad(p)
+
。通过这种转化模式，我们提出了两种制备udca的生产工艺：一锅法，即通过7β-hsdh与另一种依赖相同辅因子的7α-hsdh通过这两种酶自身氧化还原循环利用辅因子以达到制备udca的目的。两步法，即先通过7α-hsdh将cdca氧化为7k-lca，这期间通过丙酮酸脱氢酶(ldh)消耗丙酮酸来不断再生nad(p)
+
提供给7α-hsdh氧化cdca，紧接着通过简单的热灭火终止反应后，添加7β-hsdh将7k-lca还原为udca，这期间通过葡萄糖脱氢酶(gdh)消耗葡萄糖来再生nad(p)h提供给7β-hsdh还原7k-lca。
5.通过酶催化方法实现熊去氧胆酸的高效生产需要具有高催化活性和高转换率的7β-hsdh，同时需要可高效转化效率底物生成熊去氧胆酸的催化工艺。单一酶的表达后混合应用，使得整个工艺过程比较复杂，不利于熊去氧胆酸的工业化生产。高催化活性和高转换率的7β-hsdh的筛选及催化工艺的优化对于熊去氧胆酸的工业化生产具有重要意义。因此，如何得到一种能够高效生产熊去氧胆酸的方法成为研究的热点和难点。


技术实现要素：

6.为解决7β-hsdh低催化活性和低转化率及催化工艺不成熟等问题，本发明通过对ncbi数据库比对检索筛选出一种来源于olsenella sp.an188的新的7β-hsdh。在参与到熊去氧胆酸的催化生产工艺方面有着更好的催化潜力，为酶法催化生产熊去氧胆酸的工艺提供了一种新的选择方向，同时对其催化生产熊去氧胆酸的工艺进行了系统优化，显著提高了熊去氧胆酸的转化效率。
7.本发明提供了β-羟基类固醇脱氢酶在生产熊去氧胆酸中的应用，所述7β-羟基类固醇脱氢酶氨基酸序列如seq id no.1所示。
8.在一种实施方式中，所述应用是以7-酮基-石胆酸为底物，转化生产熊去氧胆酸。
9.在一种实施方式中，所述β-羟基类固醇脱氢酶由重组微生物发酵生产。
10.在一种实施方式中，所述重组微生物为重组大肠杆菌，所述重组大肠杆菌以大肠杆菌(escherichia coli)bl21(de3)为宿主，以pet22a、pet22b、pet28a、prsfduet-1或petduet-1为表达载体，表达seq id no.5所示的基因。
11.本发明还提供一种一锅法生产熊去氧胆酸的方法，以鹅去氧胆酸为底物，以7β-羟基类固醇脱氢酶和7α-羟基类固醇脱氢酶为催化剂，催化生产熊去氧胆酸。
12.在一种实施方式中，催化反应体系含有：1-50mm鹅去氧胆酸和1-20mm辅因子nadp
+
。
13.在一种实施方式中，所述7α-羟基类固醇脱氢酶的酶活为0.5-10u
·
ml-1
，所述7β-羟基类固醇脱氢酶的酶活为0.5-10u
·
ml-1
。
14.在一种实施方式中，所述7α-羟基类固醇脱氢酶具有seq id no.4所示的氨基酸序列。
15.在一种实施方式中，所述反应是在30～60℃反应。
16.在一种实施方式中，反应体系含有：1u
·
ml-1 7α-hsdh_cd和7β-hsdh_osp，10mm鹅去氧胆酸浓度为，3mm辅因子nadp
+
。
17.本发明还提供了所述酶，或所述方法在制备含有熊去氧胆酸的化学品中的应用。
18.有益效果：
19.(1)本发明提供了一种新7β-羟基类固醇脱氢酶及应用，通过对数据库进行挖掘与分析，筛选获得具有高酶活力和高转化率7β-羟基类固醇脱氢酶7β-hsdh_osp。将其应用于催化底物生产熊去氧胆酸，基于优化后的催化工艺及一锅法，可高效催化底物鹅去氧胆酸生产熊去氧胆酸。
20.(2)采用本发明获得的7β-hsdh_osp及方法在重组大肠杆菌中高效表达后可高效生产熊去氧胆酸，可促进其在医药等领域中的应用。
21.(3)本发明的7β-hsdh_osp，采用一锅法催化时，催化工艺优化前后，转化率由初始的32％提高至68％，得到了显著提高。
附图说明
22.图1为辅因子自循环一锅法催化制备udca示意图；
23.图2为7β-hsdh酶活力；
24.图3为7β-hsdh转化率；
25.图4为辅因子自循环“一锅法”催化鹅去氧胆酸生产熊去氧胆酸反应条件优化；
26.图5为7β-hsdh_osp的最适反应ph值和ph稳定性(a，最适反应ph值。低的曲线为底物1mm；高的曲线为底物10mm；b，ph稳定性)。
27.图6为7β-hsdh_osp的最适反应温度和热稳定性(a，最适反应温度；b，50℃条件下的热稳定性；c，30℃条件下的热稳定性；d，tm值)。
28.图7为实施例5反应产物的hplc检测分析结果。
具体实施方式
29.下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明能予以实施，但所举实例不作为对本发明的限定。
30.7β-hsdh酶活力测定方法：在100mm磷酸钾缓冲液(ph＝7.0)中含10mm 7k-lca、2mm nadph、30℃。7β-hsdh酶活力定义单位为：在上述反应条件下，酶催化底物7-酮石胆酸每分钟消耗1μmol nadph所需的酶量，为一个酶活力单位(u)。
31.鹅去氧胆酸的高效液相色谱检测方法：色谱柱为c18色谱柱；流动相为甲醇:水0.1％磷酸(80:20,v/v)；柱温为30℃；流速为1ml
·
min-1
；检测器为紫外光检测器(vwd)；检测波长为210nm。
32.本发明中所使用的原料，如无特殊说明，则均为常规销售产品；本发明所使用的大方法，如无特殊说明，则均为本领域常规方法。
33.实施例1 7β-hsdh酶的异源表达
34.由ncbi数据库中检索出的olsenella sp.an188、clostridium absonum、ruminococcus torques来源的7β-hsdh以及来源于clostridioides difficile的nadp
+
依赖的7α-hsdh_cd的氨基酸序列(氨基酸序列分别如seq id no.1、seq id no.2、seq id no.3、seq id no.4所示)，经密码子优化和全基因合成(分别合成核苷酸序列如seq id no.5、seq id no.6、seq id no.7、seq id no.8所示的编码基因)，将编码上述酶的基因分别合成在载体为prsfduet-1质粒上，以构建7β-hsdh和7α-hsdh_cd的表达载体。
35.将携带7β-hsdh和7α-hsdh_cd的表达载体转化进宿主细胞，验证正确的菌株分别命名为e.coli prsfduet-1-7β-hsdh_osp、e.coli prsfduet-1-7β-hsdh_cs/ca、e.coli prsfduet-1-7β-hsdh_rt、e.coli prsfduet-1-7α-hsdh_cd。
36.将表达7β-hsdh或7α-hsdh_cd的重组菌株分别接种至发酵培养基中进行发酵。发酵培养基为tb培养基，组成为1.2％(w/v)蛋白胨、2.4％(w/v)酵母粉、0.4％(v/v)甘油、磷酸盐缓冲液17mm kh2po4、72mm k2hpo4。发酵条件为：37℃培养、200rpm，当菌浓od
600
达到0.8时，添加1mm的iptg进行诱导，诱导温度为25℃，继续发酵36h。待发酵结束后，收获得发酵液，将发酵液进行离心，收集菌体，用缓冲液将菌体重悬后，进行超声破碎，破碎后，离心收集细胞破碎液上清液，对细胞破碎上清液进行镍柱蛋白纯化获得7β-hsdh。
37.实施例2 7β-hsdh_osp酶活力及转化率测定
38.将实施例1制备的7β-hsdh细胞破碎液上清液分别加入至催化反应体系中测定酶活。反应体系含有(按终浓度计)100mm磷酸钾缓冲液(ph＝7.0)，10mm 7k-lca、2mm nadph，于30℃下反应1min，活性参数由nadph的消耗量计算。结果如图2所示，取1ml发酵液(od
600
＝18)，离心后收集菌体细胞，添加1ml 100mm磷酸钾缓冲液(ph＝7.0)混匀，破壁后测定酶活
力。相比于已有报道的来源于clostridium absonum和ruminococcus torques的7β-hsdh，7β-hsdh_osp酶活力最为突出，达到了42.3u
·
ml-1
，其中clostridium absonum和ruminococcus torques的7β-hsdh酶活仅为35.5u
·
ml-1
、32.6u
·
ml-1
。
39.将实施例1制备的7β-hsdh细胞破碎液上清液用于一锅法制备熊去氧胆酸。以相同方式处理来源于clostridioides difficile的nadp
+
依赖的7α-hsdh_cd应用到一锅法制备熊去氧胆酸。反应条件为：100mm的磷酸钾缓冲液(ph＝8.0)、10mm鹅去氧胆酸、2mm nadp
+
、1u
·
ml-1 7α-hsdh、1u
·
ml-1 7β-hsdh、30℃。酶催化反应体系为5ml。反应3h后，将反应液煮沸10min终止反应。待冷却后，加入1:1乙酸乙酯萃取3次，用氮吹仪吹干乙酸乙酯，加入甲醇复溶。0.22μm滤膜过滤，用于hplc测定。7β-hsdh_osp的转化率可达58.1％，远远高于clostridium absonum和ruminococcus torques的7β-hsdh的转化率(分别为52.3％、30.7％)(图3)。
40.实施例4 7β-hsdh酶学性质测定
41.(1)7β-hsdh_osp的最适反应ph值和ph稳定性
42.在不同ph值条件下(ph＝5.0～6.0，hac-naac缓冲液；ph＝6.0-8.0，k2hpo
4-kh2po4缓冲液；ph＝8.0-9.0，tris-hcl缓冲液；ph＝9.0-10.0，甘氨酸-naoh缓冲液)，测定纯化后7β-hsdh_osp的最适反应ph值和ph稳定性。反应体系及反应条件如下：底物7-酮基石胆酸浓度分别为1mm或10mm，对应的辅因子浓度分别为0.5mm或2mm。添加的酶量按终浓度计为1u/ml。分别在不同ph(5.0-10.0)的反应缓冲液中测定纯酶液酶活力，确定酶最适反应ph值。测定酶ph稳定范围时，将酶置于不同ph值缓冲液(7.0-10.0)中，在4℃静置24h，在10mm底物浓度下测定残留酶活力。以最高酶活力为100％，计算相对酶活力。
43.如图5a所示，在底物浓度为1mm时，测得的7β-hsdh_osp的最适反应ph为6.5，当ph值过高或高低时，7β-hsdh_osp的酶活力显著降低。熊去氧胆酸工业化生产中需要较高的底物浓度，但当底物浓度提高后，其在ph 6.5条件下溶解度降低。研究中进一步测定了10mm底物浓度条件下最适ph值(图5a)。如图5b所示，在ph＝7.0～9.5时，7β-hsdh_osp稳定性较高，酶活力残留》70％。但当ph值进一步增加时(ph》9.5)，酶的稳定性显著降低，当ph＝10时，酶活力残留仅为25％。
44.(2)7β-hsdh_osp的最适反应温度和热稳定性
45.研究中测定了纯化后7β-hsdh_osp的最适反应温度和热稳定性参数(半衰温度t
50
、半衰期t
1/2
、tm值)(图6)。如图6a所示，重组7β-hsdh_osp的最适反应温度为55℃。当温度升高或者降低时，酶的催化活力均降低，特别是低于30℃或高于65℃时。如图6b、6c所示，7β-hsdh_osp在50℃和30℃条件的t
1/2
值分别为1.3h和22.6h。在20～80℃范围内，测定了7β-hsdh_osp的t
50
值，结果显示其t
50
值为45℃(图6d)。通过圆二色谱仪(cd)测定了7β-hsdh_osp的熔解温度，其tm值为59.7℃。结果表明，olsenella sp.an188来源的7β-hsdh_osp具有较好的热稳定性。
46.(3)7β-hsdh_osp的酶反应动力学参数
47.采用不同底物7-酮基石胆酸(7-oxo-lca)浓度(2、4、6、8、10mm)测定了重组7β-hsdh的酶反应动力学参数。以7-oxo-lca为底物时，7β-hsdh的米氏常数km值和最大反应速度v
max
值分别为11.22mm和1.94mm
·
min-1
。7β-hsdh的催化常数k
cat
值和表观二级速率常数k
cat
/km值分别为558.72min-1
和49.80l
·
mol-1
·
min-1
。
48.实施例5辅因子自循环一锅法催化制备udca
49.将实施例1制备的7β-hsdh细胞破碎液上清与相同方式处理的来源于clostridioides difficile的nadp
+
依赖的7α-hsdh_cd应用到一锅法制备熊去氧胆酸。具体操作如下：
50.反应体系含有(按终浓度计)：100mm的磷酸钾缓冲液(ph＝8.0)、10mm鹅去氧胆酸cdca、2mm nadp
+
、1u
·
ml-1 7α-hsdh、1u
·
ml-1 7β-hsdh、30℃。反应3h后，将反应液煮沸10min终止反应，待冷却后，加入1:1乙酸乙酯萃取三次，用氮吹仪吹干乙酸乙酯，加入甲醇复溶后用0.22μm膜过滤，用于hplc测定。
51.7β-hsdh_osp是nadp
+
依赖型，采用c.difficile来源的7α-hsdh_cd(nadp
+
依赖)，优化了“一锅法”催化生产熊去氧胆酸的反应条件，优化的条件包括反应体系中nadp
+
浓度和底物鹅去氧胆酸浓度(图4)。如图4所示，当反应体系中7α-hsdh_cd和7β-hsdh_osp的酶活力均为1u/ml时，随着鹅去氧胆酸浓度和辅因子nadp
+
浓度持续升高，“一锅法”催化鹅去氧胆酸生成熊去氧胆酸的转化率持续增加。当鹅去氧胆酸浓度为10mm且nadp
+
浓度为3mm时，“一锅法”催化鹅去氧胆酸生成熊去氧胆酸的转化率达到最大值，为68.3％。但当进一步提高鹅去氧胆酸浓度和nadp
+
浓度时，催化生成熊去氧胆酸的转化率逐渐呈下降趋。
52.对反应产物进行hplc检测分析，如图7所示，在时间6.7min可以检测到7β-hsdh的产物熊去氧胆酸udca的峰图，在时间7.5min可以检测到7β-hsdh的底物/7α-hsdh的产物7-酮基石胆酸7k-lca的峰图，在时间15.5min可以检测到7α-hsdh的底物鹅去氧胆酸cdca的峰图。
53.虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

技术特征：
1.β-羟基类固醇脱氢酶在生产熊去氧胆酸中的应用，其特征在于，所述7β-羟基类固醇脱氢酶氨基酸序列如seq id no.1所示。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，以7-酮基-石胆酸为底物，转化生产熊去氧胆酸。3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述β-羟基类固醇脱氢酶由重组微生物发酵生产。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述重组微生物为重组大肠杆菌，所述重组大肠杆菌以大肠杆菌(escherichia coli)bl21(de3)为宿主，以pet22a、pet22b、pet28a、prsfduet-1或petduet-1为表达载体，表达seq id no.5所示的基因。5.一种一锅法生产熊去氧胆酸的方法，其特征在于，以鹅去氧胆酸为底物，以7β-羟基类固醇脱氢酶和7α-羟基类固醇脱氢酶为催化剂，催化生产熊去氧胆酸。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，催化反应体系含有：1-50mm鹅去氧胆酸和1-20mm辅因子nadp
+
。7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，反应体系中，所述7α-羟基类固醇脱氢酶的酶活为0.5-10u
·
ml-1
，所述7β-羟基类固醇脱氢酶的酶活为0.5-10u
·
ml-1
。8.根据权利要求5～7任一所述的方法，其特征在于，所述反应是在30～60℃反应。9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，反应体系含有：1u
·
ml-1 7α-hsdh_cd和7β-hsdh_osp，10mm鹅去氧胆酸浓度为，3mm辅因子nadp
+
。10.氨基酸序列如seq id no.1所示的β-羟基类固醇脱氢酶或权利要求5～9任一所述方法在制备含有熊去氧胆酸的化学品中的应用。

技术总结
本发明公开了一种新7β-羟基类固醇脱氢酶及应用，属于酶工程和生物催化技术领域。本发明从数据库中挖掘出一种具有高转化率的7β-羟基类固醇脱氢酶，并在大肠杆菌中实现了酶的异源表达。通过对酶学性质等参数进行测定比较，确定该酶在熊去氧胆酸生产方面具有较高的催化潜力。本发明将该7β-羟基类固醇脱氢酶用于一锅法催化鹅去氧胆酸生产熊去氧胆酸，反应3h的转化率可达68.3％。应3h的转化率可达68.3％。应3h的转化率可达68.3％。


技术研发人员：陈献忠 杨海泉 刘万隆 沈微 夏媛媛
受保护的技术使用者：江南大学
技术研发日：2023.01.17
技术公布日：2023/9/25