一种多肽及其组合物与应用的制作方法

1.本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种多肽及其组合物与应用。


背景技术：

2.随着世界人口逐渐进入老龄化阶段，骨质疏松症的发病率逐年上升，其特点是骨矿物质密度低和骨组织微结构退化。据报道，全球约有2亿名骨质疏松症患者正在接受治疗。目前，成骨细胞和骨基质再生药物(例如双磷酸盐、雌激素受体调节剂、钙剂和他汀类等)是治疗骨质疏松症的主要药物，但是长期服用此类药物会存在一些副作用，如眼部炎症、肾脏损伤和心脏病发作等。因此，开发具有较小副作用的新型治疗剂逐渐成为研究热点。
3.脱脂蛋黄粉是工业生产蛋黄卵磷脂的副产物。近年来，随着卵磷脂生产量的不断扩大，脱脂蛋黄粉在工业生产中不断累积，并作为废弃物被大量丢弃，造成资源浪费和环境污染。诸多研究报道蛋黄蛋白质是一类优质蛋白质，氨基酸配比均衡，营养价值高。已有多项研究表明，将蛋黄蛋白质酶解得到的蛋黄多肽具有多种生理活性，如抑制脂质过氧化损伤、促进骨骼矿化、抗菌、增强免疫力和抗衰老等。因此蛋黄多肽可以用作功能性食品的成分，以及在医疗保健方面可用于缓解部分生理疾病。
4.专利cn101188949a公开了一种来自蛋黄蛋白的骨强化组合物，该组合物是蛋黄蛋白水解物，这项研究首次发现蛋黄蛋白水解物有促进成骨细胞增殖及钙化的作用，同时也发现此产物可促进骨生长和骨代谢，但是此发明采用的原料是价格较为昂贵的新鲜蛋黄液或蛋黄粉，且并未将促骨骼生长的有效成分进行富集和鉴定。专利cn109207543a公开了一种牛骨胶原蛋白多肽的制备方法，此发明用胰蛋白酶和复配蛋白酶酶解牛骨粉得到牛骨肽，此牛骨胶原肽既可以提高骨密度，又可以增加骨骼韧性和弹性，是一种骨骼保护营养剂。专利cn110693035a公开了一种供骨质疏松人群食用的含肽组合物，该组合物是以牛骨低聚粉、葛根粉和酪蛋白磷酸肽等制备而成，所述组合物具有强筋健骨、促成骨细胞增殖和改善骨质疏松的效果。专利cn106755247a公开了鳄鱼肽的提取方法，该方法从鳄鱼骨肉中运用生物酶解技术进行小分子活性肽的提取方法，此肽中含有大量活性钙和磷等，可用于治疗老年骨质疏松和促进儿童生长发育等。上述活性肽均为天然活性物质，可促进成骨细胞生长，缓解骨质疏松和儿童发育不良等问题，同时可避免传统促骨生长药物对人体造成的副作用。然而，关于多肽中发挥促骨骼生长活性的具体有效成分及其含量鲜有报道。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种多肽及其组合物与应用.
6.为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种多肽，所述多肽的氨基酸序列如seq id no.1或seq id no.2所示。本技术发明人通过大量的实验筛选得到所述多肽，并发现所述多肽具有促进成骨细胞增殖的效果，且天然、安全、无毒副作用。
7.本发明还提供一种促进骨骼生长的的组合物，包括所述的多肽。
8.作为本发明所述组合物的优选实施方式，按组合物的质量百分数计，seq id no.1所示的多肽的质量百分数为0.39-2.01％；seq id no.2所示的多肽的质量百分数为0.51-2.39％。
9.本发明还提供所述组合物的制备方法，包括以下步骤：
10.(1)将脱脂蛋黄粉粉碎并与水混合，得到混合液；
11.(2)将步骤(1)的混合液的ph调节为7-12，再加入酶进行酶解，得酶解液；
12.(3)将步骤(2)的酶解液升温灭酶，离心去除沉淀，得到上清液，即为所述促进骨骼生长的的组合物。
13.作为本发明所述制备方法的优选实施方式，所述步骤(2)中酶解采用胰酶或碱性蛋白酶。更优选地，所述胰酶为中国南宁东恒华道的胰酶；所述碱性蛋白酶为日本天野ay50c碱性蛋白酶。
14.作为本发明所述制备方法的优选实施方式，所述步骤(2)中酶的添加量为脱脂蛋黄粉的0.1-2％。
15.作为本发明所述制备方法的优选实施方式，所述步骤(1)中脱脂蛋黄粉与水的质量比为脱脂蛋黄粉：水＝1：9-15。
16.作为本发明所述制备方法的优选实施方式，所述步骤(1)的脂蛋黄粉来源于鸡蛋、鸭蛋中任意一种。
17.作为本发明所述制备方法的优选实施方式，所述酶解温度为37-75℃，时间为1-24h；所述灭酶的条件为：75-100℃加热5-30min；所述离心的条件为：1000-10000g离心5-30min。
18.本发明还提供所述多肽的制备方法，将所述的促进骨骼生长的的组合物依次通过10000da和3000da的超滤膜，收集滤液，得所述多肽。更优选地，还包括将滤液浓缩、喷雾干燥；更优选地，所述浓缩为浓缩至固形物的质量百分含量为5％-45％。
19.作为本发明所述多肽的制备方法的优选实施方式，超滤时收集分子量小于3000da的滤液。
20.作为本发明所述多肽的制备方法的优选实施方式，还包括提纯步骤；所述提纯步骤具体为：在滤液中添加乙醇使其浓度达到60％(v/v)，取上清液。
21.本发明还提供所述多肽或所述的促进骨骼生长的的组合物在制备用于促进骨骼生长、增加骨骼密度或增加骨骼强度的产品中的应用。
22.本发明的有益效果：本发明提供一种多肽及其组合物，所述多肽及及其组合物通过上调成骨细胞分化过程中标志性蛋白col1、ocn和rankl的表达来调控成骨细胞的增殖和分化，具有促进成骨细胞增殖的效果，且天然、安全、无毒副作用、可长期服用。
附图说明
23.图1为经超滤纯化后，各蛋黄多肽粉末ay1、ay2、ay3和ay4的促成骨细胞增殖活性。
24.图2为经乙醇分级纯化后，各蛋黄多肽粉末ay4、e1、e2、e3和e4的促成骨细胞增殖和分化活性。
25.图3为实施例1制得的促骨骼生长组合物中mgwvr、wtqpvwmr多肽的二级质谱图。
26.图4为体外合成九条已知序列肽段的促成骨细胞增殖和分化活性。
27.图5：a为肽段mgwvr对mc3t3-e1成骨细胞分化过程中alp活性的影响；b为wtqpvwmr对mc3t3-e1成骨细胞分化过程中alp活性的影响。
28.图6：a为mgwvr对mc3t3-e1成骨细胞分化过程中标志性蛋白col i、ocn和rankl水平的影响；b为wtqpvwmr对mc3t3-e1成骨细胞分化过程中标志性蛋白col i、ocn和rankl水平的影响。
具体实施方式
29.以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
30.实验方法：
31.1、蛋黄多肽促成骨细胞增殖活性的测定采用mtt试剂盒法，具体实验方法如下：取处在对数生长期的mc3t3-e1细胞，血球计数板进行计数后，将细胞悬液稀释至1.5
×
105cells/ml，接种于96孔板内，每孔100μl。在37℃、5％(v/v)co2培养箱培养，细胞紧贴瓶壁时，弃去培养基。实验分为空白调零组，对照组和实验组：空白调零组为添加不含细胞的培养液，对照组为添加含细胞的培养液，实验组为添加含细胞的培养液及不同浓度的蛋黄肽，各组别加入培养液的体积均为100μl。培养板于培养箱中培养24h后，弃去旧培养基，每孔加入200μl mtt(0.5mg/ml)，继续培养4h后，弃去mtt溶液，加入150μl dmso。室温下在摇床上避光震荡5min，充分混匀后，在全波长酶标仪上选择570nm波长，测定各孔吸光度值a570。实验重复6次，取平均值。按以下公式计算：
[0032][0033]
2、多肽的结构鉴定均采用nano-hplc-ms/ms分析，具体分析方法为：整套系统为串联easy-nanolc 1200的q-exactive质谱仪(thermo fisher scientific,ma,usa)。共上样3μl(5mg/ml)样品(分析柱：acclaim pepmap c18,75μm x 25cm)，以60min的梯度分离样品，柱流量控制在300nl/min，柱温为40℃，电喷雾电压2kv，梯度从2％的b相起始，在47分钟以非线性梯度升高到35％，1分钟内升高到100％，维持12分钟。质谱仪在数据依赖采集模式下运行，自动在ms和ms/ms采集间切换。质谱参数设置如下：(1)ms:扫描范围(m/z):200-1500；分辨率:70,000；agc target：3e6；最大注入时间:60ms；(2)hcd-ms/ms:分辨率:17,500；agc target：5e4；最大注入时间:50ms；碰撞能量:27；动态排除时间:20s。串联质谱图经过peaks studio version 10.6(bioinformatics solutions inc.,waterloo,canada)分析。peaks db对uniprot-gallus_gallus(version202206,18112entries)数据库搜库，设置none酶解。搜库参数碎片离子质量容许误差：0.02da，母离子质量容许误差：7ppm蛋白卡值为：-10lgp≥0，至少含1unique peptide；肽段卡值为：-10lgp≥20。
[0034]
3、蛋黄多肽采用计算机虚拟筛选来筛选出可能具有促骨骼生长活性的肽段，具体流程如下：对质谱鉴定得到的所有肽段进行peptideranker评分和cpp评分，选出peptideranker评分和cpp评分均≥0.5的肽段；进一步使用allergenfpv.1.0对目标肽序列进行生物致敏性分析和毒性分析，最终得到无致敏性和无毒性的肽段；进一步将上述得到的肽段进行分子对接：选择人表皮生长因子受体(egfr)作为受体蛋白，人体表皮生长因子
(egf)作为原始配体，同源建模寻找egfr的活性中心，采用autodock vina和discovery studio对egfr及蛋黄蛋白肽进行分子对接。
[0035]
4、促骨骼生长组合物中多肽含量的测定均采用高效液相色谱法(hplc)，具体方法为：高效液相色谱的具体检测条件为：流速：0.5ml/min；紫外检测波长：220nm；正离子模式，分子量选择50-3000；c18色谱柱；流动相：a相为水相，b相为含0.1％甲酸的乙腈；洗脱梯度：0-8min，88％ a相和12％ b相，8-20min，88％-65％a相和12％-35％b相，20-24min，65％-88％ a相和35％-12％b相，24-30min，88％a相和12％ b相。
[0036]
5、mc3t3-e1成骨细胞分化相关蛋白表达的测定采用elisa和western blotting，具体方法为：将成骨细胞以5
×
104/ml的密度种于6孔板中(每孔2ml)，在生长培养基中长至汇合度90％时，换成含肽段mgwvr或wtqpvwmr(100μg/ml)的分化培养基，对照组为不含样品的分化培养基，模型组为含地塞米松(50μg/ml)的分化培养基。细胞培养72h后，收集各组培养基用酶联免疫吸附(enzyme linked immunosorbent assay，elisa)试剂盒测定相关因子(alp、col i和ocn)的分泌水平。
[0037]
实施例1
[0038]
本实施例提供一种促进骨骼生长的组合物，其制备方法包括以下步骤：(1)
[0039]
将100g脱脂蛋黄粉粉碎过60目筛与900g饮用水混合，得混合液；
[0040]
(2)采用1m naoh水溶液调节ph为9，加入1g ay50c碱性蛋白酶(购自日本天野amano酶制剂公司)，在60℃水浴摇床中震荡酶解6h，得酶解液；
[0041]
(3)将步骤(2)的酶解液升温至80℃灭酶处理10min，8000g离心12min，取上清液，即为促进骨骼生长的的组合物。
[0042]
本实施例还提供一种多肽，其制备方法包括以下步骤：将促进骨骼生长的的组合物分别过截留分子量10000da和3000da的超滤膜，将得到的酶解产物、10000da截留组分、3000da-10000 da截留组分以及过3000da膜滤液分别命名为ay1、ay2、ay3和ay4。将上述4个组分浓缩至固形物质量百分含量为25％，喷雾干燥，即得到四种不同的蛋黄多肽粉末；
[0043]
将蛋黄多肽粉末ay4配制成底物浓度为25％的样品溶液，向其中加入适量的无水乙醇使其体积分数为20％，待混合均匀后，静置1h，离心，得到沉淀组分记为e1，得到的上清液组分则继续加入无水乙醇，使其体积分数达到40％，混匀后继续静置1h，离心，得到的沉淀组分级记为e2，得到的上清液中再一次加入无水乙醇，使其体积分数为60％，静置离心后的沉淀组分记为e3，上清液组分则记为e4。将上述4个组分浓缩至固形物质量百分含量为25％，喷雾干燥，即得到四种不同的蛋黄多肽组分。
[0044]
采用mtt试剂盒法测试四种不同的蛋黄多肽粉末、四种不同的蛋黄多肽促成骨细胞增殖活性，结果如图1、2所示。
[0045]
由图1可知，在蛋白质浓度为0.3-2.5mg/ml条件下，四种多肽粉末均具有促进成骨细胞增殖的活性，其中在整体上，ay4表现出最高的促成骨细胞增殖活性。即分子量《3000da的蛋黄多肽粉末具有最高的促成骨细胞增殖活性(152％)。
[0046]
由图2可知，在蛋白质浓度为1mg/ml条件下，ay4、e2、e3和e4多肽组分均具有促进成骨细胞增殖的活性，其中e4组分表现出最高的促成骨细胞增殖活性(160％)。
[0047]
采用质谱分析对步骤3所得蛋黄多肽粉末e4组分进行多肽鉴定，共得到6584条肽段。并采用计算机虚拟筛选及分子对接技术对上述6584条肽段的促骨骼生长活性进行预
测，共得到15条可能存在较高成骨活性的非磷酸化肽段和26条磷酸化肽段。
[0048]
图3为wtqpvwmr、mgwvr的二级质谱图。由图4可知，wtqpvwmr、mgwvr在50μm、100μm和200μm的条件下均能显著促进成骨细胞的增殖。
[0049]
采用高效液相色谱检测蛋黄多肽组分e4，所述促骨骼生长组合物中mgwvr多肽的含量为2.01g/100g；所述促骨骼生长组合物中wtqpvwmr多肽的含量为2.39g/100g。
[0050]
分别检测wtqpvwmr、mgwvr对mc3t3-e1成骨细胞分化过程中alp活性的影响，结果如图5所示。由图5a可知，相比于模型组，成骨细胞经过肽段mgwvr处理后其alp活性显著上升；由图5b可知，相比于模型组，成骨细胞经过肽段wtqpvwmr处理后其alp活性显著上升。
[0051]
分别检测wtqpvwmr、mgwvr对mc3t3-e1成骨细胞分化过程中标志性分泌蛋白col i、ocn和rankl表达的影响，结果如图6所示。由图6可知，相比于模型组，wtqpvwmr、mgwvr处理mc3t3-e1成骨细胞后，col i、ocn和rankl蛋白表达量均上调。
[0052]
实施例2
[0053]
本实施例提供一种促进骨骼生长的的组合物，其制备方法包括以下步骤：(1)
[0054]
将100g脱脂蛋黄粉粉碎过60目筛与900g饮用水混合，得混合液；
[0055]
(2)采用1m naoh水溶液调节ph为7，加入0.1g ay50c碱性蛋白酶(购自日本天野amano酶制剂公司)，在37℃水浴摇床中震荡酶解1h，得酶解液；
[0056]
(3)将步骤(2)的酶解液升温至75℃灭酶处理5min，1000g离心5min，取上清液，即为促进骨骼生长的的组合物。
[0057]
将促进骨骼生长的的组合物分别过截留分子量10000da和3000da的超滤膜，将得到的酶解产物、10000da截留组分、3000da-10000 da截留组分以及过3000da膜滤液分别命名为ay1、ay2、ay3和ay4。将上述4个组分浓缩至固形物质量百分含量为5％，喷雾干燥，即得到四种不同的蛋黄多肽粉末；
[0058]
将蛋黄多肽粉末ay4配制成底物浓度为25％的样品溶液，向其中加入适量的无水乙醇使其体积分数为20％，待混合均匀后，静置1h，离心，得到沉淀组分记为e1，得到的上清液组分则继续加入无水乙醇，使其体积分数达到40％，混匀后继续静置1h，离心，得到的沉淀组分级记为e2，得到的上清液中再一次加入无水乙醇，使其体积分数为60％，静置离心后的沉淀组分记为e3，上清液组分则记为e4。将上述4个组分浓缩至固形物质量百分含量为5％，喷雾干燥，即得到四种不同的蛋黄多肽组分。
[0059]
经测定，蛋黄多肽粉末e4在蛋白浓度为1mg/ml条件下具有显著促成骨细胞增殖活性，为149％。将e4组分经高效液相色谱检测，所述促骨骼生长组合物中mgwvr多肽的含量为0.39g/100g；所述促骨骼生长组合物中wtqpvwmr多肽的含量为0.51g/100g。
[0060]
实施例3
[0061]
本实施例提供一种促进骨骼生长的的组合物，其制备方法包括以下步骤：(1)
[0062]
将100g脱脂蛋黄粉粉碎过60目筛与1500g饮用水混合，得混合液；
[0063]
(2)采用1m naoh水溶液调节ph为12，加入0.1g ay50c碱性蛋白酶(购自日本天野amano酶制剂公司)，在65℃水浴摇床中震荡酶解24h，得酶解液；
[0064]
(3)将步骤(2)的酶解液升温至100℃灭酶处理30min，1000g离心30min，取上清液，即为促进骨骼生长的的组合物。
[0065]
将促进骨骼生长的的组合物分别过截留分子量10000da和3000da的超滤膜，将得
到的酶解产物、10000da截留组分、3000da-10000 da截留组分以及过3000da膜滤液分别命名为ay1、ay2、ay3和ay4。将上述4个组分浓缩至固形物质量百分含量为45％，喷雾干燥，即得到四种不同的蛋黄多肽粉末；
[0066]
将蛋黄多肽粉末ay4配制成底物浓度为25％的样品溶液，向其中加入适量的无水乙醇使其体积分数为20％，待混合均匀后，静置1h，离心，得到沉淀组分记为e1，得到的上清液组分则继续加入无水乙醇，使其体积分数达到40％，混匀后继续静置1h，离心，得到的沉淀组分级记为e2，得到的上清液中再一次加入无水乙醇，使其体积分数为60％，静置离心后的沉淀组分记为e3，上清液组分则记为e4。将上述4个组分浓缩至固形物质量百分含量为45％，喷雾干燥，即得到四种不同的蛋黄多肽组分。
[0067]
经测定，蛋黄多肽粉末e4在蛋白浓度为1mg/ml条件下具有显著促成骨细胞增殖活性，为159％。将e4组分经高效液相色谱检测，所述促骨骼生长组合物中mgwvr多肽的含量为1.66g/100g；所述促骨骼生长组合物中wtqpvwmr多肽的含量为1.92g/100g。
[0068]
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

技术特征：
1.一种多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列如seq id no.1或seq id no.2所示。2.一种促进骨骼生长的的组合物，其特征在于，包括权利要求1所述的多肽。3.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于，按组合物的质量百分数计，seq id no.1所示的多肽的质量百分数为0.39-2.01％；seq id no.2所示的多肽的质量百分数为0.51-2.39％。4.根据权利要求2～3所述的组合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将脱脂蛋黄粉粉碎并与水混合，得到混合液；(2)将步骤(1)的混合液的ph调节为7-12，再加入酶进行酶解，得酶解液；(3)将步骤(2)的酶解液升温灭酶，去除沉淀，得到上清液，即为所述促进骨骼生长的的组合物。5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中酶解采用胰酶或碱性蛋白酶。6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中酶的添加量为脱脂蛋黄粉的0.1-2％。7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中酶解温度为37-75℃，时间为1-24h。8.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中脱脂蛋黄粉与水的质量比为脱脂蛋黄粉：水＝1：9-15。9.根据权利要求1所述多肽的制备方法，其特征在于，将权利要求4所述的促进骨骼生长的的组合物依次通过10000da和3000da的超滤膜，收集滤液，得所述多肽。10.根据权利要求9所述多肽的制备方法，其特征在于，超滤时收集分子量小于3000da的滤液。11.根据权利要求9所述多肽的制备方法，其特征在于，还包括提纯步骤；所述提纯步骤具体为：在滤液中添加乙醇使其浓度达到60％(v/v)，取上清液。12.权利要求1所述多肽或权利要求2～3任一项所述的促进骨骼生长的的组合物在制备用于促进骨骼生长、增加骨骼密度或增加骨骼强度的产品中的应用。

技术总结
本发明公开了一种多肽及其组合物与应用，涉及生物医药技术领域。本发明提供一种多肽，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示。本发明的多肽及其组合物通过上调成骨细胞分化过程中标志性蛋白COL1、OCN和RANKL的表达来调控成骨细胞的增殖和分化，具有促进成骨细胞增殖的效果，且天然、安全、无毒副作用。用。用。


技术研发人员：毛新亮 喻勤 杜玉兰 李腾基 谢岚 崔春 刘颖
受保护的技术使用者：完美（中国）有限公司
技术研发日：2023.06.27
技术公布日：2023/9/25