血管生成素样蛋白3在制备治疗施万细胞过度生长疾病药物中的应用

1.本发明涉及生物医药领域，特别涉及血管生成素样蛋白3(angptl3)在制备治疗施万细胞过度生长疾病药物中的应用。


背景技术：

2.神经鞘瘤(schwannoma)是常见的周围神经源性肿瘤，因起源于神经髓鞘的施万细胞(schwann cell)而得名，又称为神经鞘膜瘤、施万细胞瘤。神经鞘瘤可发生于头颈、椎管内、四肢、胃肠道、肾上腺等几乎全身各个部位，大小通常为2至3cm，且以每年2.5至3mm的速度增大。增大的神经鞘瘤卡压神经，常影响神经支配的感觉功能并引起神经疼痛。临床上常规采用手术切除的方法进行神经鞘瘤切除，但手术容易导致神经纤维束的损伤，而神经损伤则容易诱发神经鞘瘤的生成，再次提高了神经鞘瘤的复发率。
3.施万细胞作为神经鞘瘤的来源细胞，是周围神经系统中特有的胶质细胞，分布于周围神经根、神经干和神经末梢。在正常生理情况下，施万细胞可以包绕神经元轴突，为轴突提供物理支撑和机械支持以保证其完整性。在有髓神经纤维中，施万细胞形成由髓磷脂所构成的髓鞘以包裹轴突，起到保护、绝缘和促进神经动作电位快速传导的作用。在成年动物体内，周围神经处于相对静止状态，施万细胞更新速度较慢。但施万细胞具有较强的可塑性，在发育和损伤修复等过程中，施万细胞增殖和迁移，包绕神经轴突。但在神经损伤或其他病理条件下，施万细胞可能过度生长，导致神经鞘瘤的发生。因此，探寻合适靶点调控施万细胞的增殖和迁移，抑制施万细胞的过度生长可以治疗神经鞘瘤，并可以治疗由于施万细胞过度生长导致的细胞难以分化和髓鞘难以形成等问题，具有重要的科学意义和临床价值。
4.angptl3隶属于血管紧张素蛋白家族，是主要在肝脏表达的一种分泌蛋白，具有调节血脂水平的作用，与糖脂代谢直接相关。近年来对神经系统胶质细胞的研究表明，施万细胞内糖脂代谢水平的改变密切影响施万细胞的活性和表型。测序结果检测到编码angptl3这一代谢相关分子的基因在大鼠坐骨神经组织有较高表达，且神经损伤后，angptl3基因在坐骨神经组织中的表达升高。


技术实现要素：

5.本发明使用高通量测序数据筛选大鼠坐骨神经损伤后差异表达的代谢相关基因angptl3，首次揭示了angptl3与施万细胞的增殖和迁移之间的关系，研究结果表明angptl3具有抑制施万细胞的增殖和迁移能力。
6.本发明具体技术方案如下：angptl3蛋白或其表达载体在制备治疗施万细胞过度生长相关疾病药物中的应用。
7.本发明所述angptl3(人源)氨基酸序列如seq id no:1所示。
8.本发明所述的应用，以angptl3蛋白)或其表达载体作为外源活性物质的药物，或者angptl3蛋白或基因作为药物设计靶点设计提高angptl3蛋白或基因表达的促进剂，用于降低机体施万细胞的增殖速度和迁移能力。
9.重组蛋白是模拟生物体内源蛋白，运用生物基因工程方法获取的蛋白质药物，能增强内源性蛋白的功能。本发明一个示例，利用angptl3(人源)重组蛋白抑制施万细胞的增殖和迁移。angptl3(人源)重组蛋白氨基酸序列如seq id no:2所示。
10.本发明所述施万细胞过度生长相关疾病包括神经鞘瘤、施万细胞过度活化引发施万细胞的分化障碍或成髓鞘障碍。
11.施万细胞是具有高度可塑性的周围神经胶质细胞。施万细胞增殖和迁移以包绕神经轴突，构建有髓神经的髓鞘结构，为神经的发育和损伤修复提供了必要的细胞基础。但施万细胞的过度生长则可能导致神经鞘瘤的发生。施万细胞的过度生长也可能导致细胞难以分化成髓鞘，造成神经冲动传导障碍。抑制施万细胞的过度生长是治疗此类疾病的关键。
12.为了评价angptl3在施万细胞中的生物学功能，本发明检测了大鼠周围神经损伤1、4、7和14天后，测序结果中，编码angptl3的基因在未损伤和损伤坐骨神经处的表达变化情况，发现angptl3基因在神经损伤后表达上调，表明其可能参与调控施万细胞的生长过程(图1)。培养原代大鼠施万细胞，加入angptl3重组蛋白，并加入edu共同孵育，发现angptl3阻碍了施万细胞的增殖(图2)。通过划痕实验检测施万细胞迁移至空白划痕面积的情况，发现在经angptl3重组蛋白处理的施万细胞组，空白面积更大，表明angptl3阻碍了施万细胞向划痕处空白面积的运动迁移(图3)。通过transwell实验检测施万细胞迁移至transwell下表面的情况，发现在经angptl3重组蛋白处理的施万细胞组，施万细胞迁移数目更少，表明angptl3阻碍了施万细胞向transwell下表面的运动迁移(图4)。这些结果说明angptl3抑制施万细胞的增殖和迁移，表明angptl3是抑制施万细胞过度生长的重要靶点。
13.本发明所述angptl3可以直接作为药物或者药物的靶点设计促进其表达的药物(增效剂)，通过与药物的相互作用，提高angptl3的表达，进而发挥调节施万细胞生长的作用。
14.本发明的优点：本发明研究结果表明，可通过提高angptl3的表达抑制施万细胞的增殖和迁移，进而用于治疗神经鞘瘤和施万细胞分化成髓鞘困难等由于施万细胞过度生长导致统相关疾病的治疗。
附图说明
15.图1为大鼠坐骨神经损伤后损伤处angptl3基因的表达。(图1为大鼠坐骨神经损伤后1、4、7和14天，与未损伤0天对照组相比，测序结果中angptl3基因表达倍数变化情况。)
16.图2为angptl3对施万细胞增殖的影响。(图2a为加入angptl3重组蛋白处理的施万细胞和对照组施万细胞代表性edu增殖图像，红色表示edu染色的增殖细胞，蓝色表示细胞核，比例尺为50μm；图2b为施万细胞edu增殖速率归一化统计。)
17.图3为angptl3对施万细胞在划痕空白面积内迁移的影响。(图3a为加入angptl3重组蛋白处理的施万细胞和对照组施万细胞在insert模具去除后0小时和9小时后的代表性划痕愈合图像，比例尺为100μm；图3b为相对空白面积归一化统计。)
18.图4为angptl3对施万细胞transwell迁移的影响。(图4a为加入angptl3重组蛋白
处理的施万细胞和对照组施万细胞在transwell中迁移情况代表图像，比例尺为50μm；图4b为细胞通过transwell表面的迁移能力归一化统计。)
具体实施方式
以下通过实施例说明本发明的具体步骤，但不受实施例限制。
20.在本发明中所使用的术语，除非另有说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
21.下面结合具体实施例并参照数据进一步详细描述本发明。应理解，该实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
22.在以下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。
23.下面结合具体实施例对本发明进一步说明。
24.实施例1原代大鼠施万细胞的取材和培养对新生红皮sprague dawley(sd)大鼠进行断头处死后，分离取材大鼠坐骨神经，剪成碎片后，使用胶原酶和胰酶消化，过滤离心后弃去上清，重悬沉淀，并种于预先用pll包被好的培养皿中。使用含有10％ fbs的dmem培养基进行培养，加入anti-thy1.1和兔补体蛋白以去除混杂的成纤维细胞，得到纯化的施万细胞。在培养基中继续加入forskolin和hrg进行细胞培养，所培养的原代大鼠施万细胞用于后续功能实验。
25.实施例2施万细胞edu增殖试验取实施例1获得的原代大鼠施万细胞，将细胞接种于pll包被的96孔板，在angptl3处理组加入溶于0.1％ bsa的angptl3重组蛋白至浓度为0.5μg/ml，在对照组加入0.1％ bsa。angptl3处理12小时后，加入100μm edu，根据cell-light edu dna cell proliferation kit(广州市锐博生物科技有限公司)说明书进行edu实验检测。edu共同孵育12小时后，使用4％多聚甲醛固定，通过观察edu标记的阳性细胞数目检测增殖细胞数目，通过观察hoechst标记的细胞核数目检测总细胞数目。通过计算edu阳性细胞数与总细胞数的比值，检测施万细胞的增殖速率。
26.图2a为高倍显微镜下加入angptl3重组蛋白处理的施万细胞和对照组施万细胞代表性edu增殖图像(比例尺为50μm)，图2b为施万细胞的增殖速率，结果显示，加入angptl3重组蛋白后，施万细胞的增殖速率低于对照组，表明angptl3可以抑制施万细胞的增殖。
27.实施例3施万细胞划痕愈合实验取实施例1获得的原代大鼠施万细胞，将细胞接种于pll包被的且内置insert模具的6孔板，在angptl3处理组加入溶于0.1％ bsa的angptl3重组蛋白至浓度为0.5μg/ml，在对照组加入0.1％ bsa。angptl3处理15小时后，移除insert模具以制造划痕，继续培养9小时，观察记录空白面积的大小和划痕的愈合情况，使用image pro plus(media cybernetics,rockville,md,usa)计算相对空白区域，检测施万细胞的迁移能力。
28.图3a为高倍显微镜下加入angptl3重组蛋白处理的施万细胞和对照组施万细胞代表性划痕愈合实验图(比例尺为100μm)。图3b为划痕实验中移除insert模具，将施万细胞继续培养9小时后存留的空白面积，结果显示，加入angptl3重组蛋白后，残留空白面积更大，说明施万细胞运动迁移能力更低，表明angptl3可以抑制施万细胞的迁移。
29.实施例4施万细胞transwell实验
取实施例1获得的原代大鼠施万细胞，用dmem培养基制备成细胞悬液，接种于fibronectin包被的8μm孔径的transwell小室上室，将含有10％ fbs的dmem培养基加入transwell下室。在transwell小室上室和下室中均加入溶于0.1％ bsa的angptl3重组蛋白至浓度为0.5μg/ml或对照0.1％ bsa，细胞培养24小时后，擦除transwell上表面残留细胞，通过结晶紫染色观察迁移至下表面的施万细胞。冰醋酸洗脱结晶紫后，使用酶标仪测定570nm处的od值，检测施万细胞的迁移能力。
30.图4a为高倍显微镜下加入angptl3重组蛋白处理的施万细胞和对照组施万细胞代表性transwell迁移实验图(比例尺为50μm)。图4b为transwell实验中培养24小时后，transwell下表面迁移的施万细胞，结果显示，加入angptl3重组蛋白后，transwell下表面迁移的施万细胞更少，表明angptl3可以抑制施万细胞的迁移。

技术特征：
1.angptl3蛋白或其表达载体在制备治疗施万细胞过度生长相关疾病药物中的应用。2.如权利要求1所述的应用，其特征在于angptl3蛋白或其表达载体作为外源性活性物质，或者angptl3蛋白或基因作为药物设计靶点设计提高angptl3蛋白或基因表达的促进剂，用于降低机体施万细胞的增殖速度和迁移能力。3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述angptl3蛋白为人angptl3重组蛋白，氨基酸序列如seq id no：2所示。4.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述施万细胞过度生长相关疾病为神经鞘瘤、施万细胞过度活化引发施万细胞的分化障碍或成髓鞘障碍。

技术总结
本发明提供了血管生成素样蛋白3(Angiopoietin Like 3，Angptl3)在制备治疗施万细胞过度生长相关疾病药物中的应用。本发明首次揭示Angptl3重组蛋白能够降低施万细胞的增殖速度和迁移能力，表明Angptl3具备调节施万细胞增殖迁移的作用。Angptl3可以作为药物，用于治疗神经鞘瘤等施万细胞过度生长相关疾病。病。


技术研发人员：易晟 王星辉 赵莉莉 张云松
受保护的技术使用者：南通大学
技术研发日：2023.02.20
技术公布日：2023/9/25