一种金耳多糖降解产物及其在保护皮肤细胞热损伤中的应用

1.本发明涉及一种多糖降解产物及其应用，具体涉及一种金耳多糖降解产物及其在保护皮肤细胞热损伤中的应用。


背景技术：

2.随着技术的进步，人们对有效安全的面部年轻化的需求越来越大，多种多样的医学美容方式逐渐被大众接受和使用。光热治疗法是医美护肤中使用较为广泛的方法，如光子嫩肤、强脉冲光、射频、激光、热玛吉等，其主要通过产生一定的光热作用促使我们皮肤的表皮层、真皮层发生一定的改变，促进胶原蛋白的增殖，提高肌肤的弹性，改善肌肤的状态，减少毛孔，消除皱纹，消除斑点。但是光热效应会极易造成皮肤屏障受损，不仅使得角质形成细胞受损，容易造成皮肤红肿、干燥、敏感等不良反应；还容易破坏真皮成纤维细胞，使得合成胶原蛋白能力降低，皮肤变得松垮，严重的会造成皮肤凹陷。我们要以正确的方式进行医学美容的同时，也要及时关注医美后护理，能大大降低其对我们皮肤可能造成的损害。
3.目前，还缺少光热效应对皮肤损伤的研究和开发术后舒缓相关产品。
4.天然来源护肤成分一直备受护肤品市场的关注，天然、绿色的护肤成分更受消费者的青睐。近年来，食用菌的皮肤护理功效越来越受到人们的关注，如菌菇来源的β-葡聚糖、裂褶菌多糖、香菇嘌呤、灵芝酸和麦角硫因等在抗炎症、防紫外线和抗氧化等方面具有重要的作用。食用菌还具有很好的美容和抗衰等保健作用，在亚洲，食用菌之一的灵芝作为美容、抗衰的保健品来使用已有上千年的历史。食用真菌，尤其是蘑菇及蘑菇提取物具有较强的皮肤护理功效，正越来越多地被应用到化妆品领域。
5.金耳(tremella aurantialba)是一种稀有珍贵食用菌，《中国药用真菌》记载金耳药性温中带寒，味甘，能化痰、止咳，主治肺热、痰多、气喘等疾病，同时因金耳胶质细腻、洁白润滑、气味清香，具有润滑皮肤等功效。金耳多糖是金耳的主要成分，金耳多糖是金耳的主要成分，具有一定的抗炎、皮肤免疫调节、抗氧化和保湿功效。


技术实现要素：

6.发明目的：本发明的目的在于提供一种金耳多糖降解产物，通过h2o2联合维生素c的方法降解，并通过超滤分级的方法进行制备得到两种不同分子量的金耳多糖降解产物i(e-tap i)和金耳多糖降解产物ii(e-tap ii)。本发明的另一个目的是提供金耳多糖降解产物在保护或修复热损伤皮肤细胞中的应用。
7.技术方案：本发明所述的金耳多糖降解产物，其是金耳多糖通过h2o2联合维生素c的方法降解，并选取分子量＞100k da与1k da＜分子量＜100k da的降解产物制得。
8.所述的金耳多糖降解产物在制备保护或修复皮肤热损伤的药物中的应用。
9.所述的应用，所述金耳多糖降解产物包括金耳多糖降解产物i和金耳多糖降解产物ii。
10.所述的应用，所述金耳多糖降解后的分级是通过超滤分级的方法进行。
11.所述的应用，所述金耳多糖降解产物i分子量＞100k da。
12.所述的应用，所述金耳多糖降解产物ii分子量大于1k da并且小于100k da。
13.所述的金耳多糖降解产物在制备保护或修复皮肤热损伤的护肤品或化妆品中的应用。
14.金耳多糖降解产物i在制备修护热造成的角质形成细胞损伤的产品中的应用，所述金耳多糖降解产物i是金耳多糖通过h2o2联合维生素c的方法降解，并选取分子量＞100k da的降解产物。
15.金耳多糖降解产物ii在制备修护热造成的成纤维细胞损伤的产品中的应用，所述金耳多糖降解产物ii是金耳多糖通过h2o2联合维生素c的方法降解，并选取1k da＜分子量＜100k da的降解产物。
16.金耳多糖降解产物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
17.(1)取粗金耳多糖溶于水中，充分溶胀，加入过氧化氢和抗坏血酸；
18.(2)用截留分子量为1000da的透析膜进行透析，截留部分用100kda的超滤管进行超滤分级，得到分子量大于100k da的金耳多糖降解产物i和小于100k da的金耳多糖降解产物ii。
19.在热损伤皮肤细胞模型中，以金耳多糖降解产物为活性成分，将降解得到的不同分子量的金耳多糖应用于保护皮肤角质层、真皮层细胞、组织的热损伤。其中，不同分子量的金耳多糖是通过h2o2联合维生素c的方法降解，并通过超滤分级的方法进行制备得到两种不同分子量的金耳多糖降解产物i(e-tap i)和金耳多糖降解产物ii(e-tap ii)。
20.将得到的两种降解金耳多糖与未降解的金耳多糖进行体外抗氧化活性分析，发现降解得到的不同分子量的金耳多糖都具有优异的还原力、dpph自由基清除能力、abts自由基清除能力，当多糖浓度为2.0mg/ml时，e-tap i还原力、dpph自由基清除能力、abts自由基清除能力较未降解的多糖上升30-35％、45-50％、35-40％；e-tap ii还原力、dpph自由基清除能力、abts自由基清除能力较未降解的多糖上升65-70％、60-65％、45-50％。总抗氧化能力降解得到的e-tap ii＞e-tap i＞未降解的金耳多糖，且抗氧化能力远大于市面上销售的银耳多糖，说明降解得到的两种分子量的金耳多糖都具有一定的抗氧化能力，能降低热给皮肤造成的氧化应激程度。e-tap i能显著性增强人角质形成细胞的增殖、迁移能力，且于未给药组相比，能大大增加角质形成细胞热休克后的存活率，本实验结果提示，降解得到的e-tap i能舒缓热造成的人角质形成细胞损伤。e-tap ii能显著增强成纤维细胞的增加成纤维细胞热休克后的存活率，本实验结果提示，降解得到的e-tap ii能舒缓热造成的成纤维细胞损伤。
21.现有对金耳多糖的研究一般聚集于对金耳子实体中多糖的提取和研究，但子实体中提取的金耳多糖分子量大，难以通过皮肤角质层进入真皮层发挥舒缓功效，对金耳多糖进行有效的降解可以大大的提升金耳多糖的生物利用率，同时得到的不同分子量的金耳多糖降解产物能针对不同的皮肤层面发挥不同的功效。
22.本发明的关键点：
23.1、过氧化氢降解金耳多糖得到的不同分子量多糖e-tap i、e-tap ii具有抗氧化活性；
24.2、e-tap i能修护热造成的角质形成细胞损伤；
25.3、e-tap ii能修护热造成的成纤维细胞损伤。
26.有益效果：与现有技术相比，本发明具有以下技术优势：本发明所述的不同分子量金耳多糖可用作活性成分，应用于光热医美后修复产品中，开拓了金耳多糖的新用途，为医美后修复产品提供了新选择。具体的说，不同分子量的金耳多糖在医美护肤中的应用；不同分子量金耳多糖在修复舒缓类产品中的应用；不同分子量的金耳多糖在化妆品中的应用。
附图说明
27.图1为不同种类多糖的还原力测量；
28.图2为不同种类多糖的dpph自由基清除能力测量；
29.图3为不同种类多糖的abts自由基清除能力测量；
30.图4为e-tap i对角质形成细胞增殖活性的影响(12h)；
31.图5为e-tap i对角质形成细胞增殖活性的影响(24h)；
32.图6为e-tap i对角质形成细胞增殖活性的影响(48h)；
33.图7为e-tap i对hacat的热损伤逆转作用；
34.图8为e-tap i对hacat的迁移能力影响；
35.图9为e-tap ii对成纤维细胞增殖活性的影响(12h)；
36.图10为e-tap ii对成纤维细胞增殖活性的影响(24h)；
37.图11为e-tap ii对成纤维细胞增殖活性的影响(48h)；
38.图12为e-tap ii对nih-3t3的热损伤逆转作用。
具体实施方式
39.发明人在前期研究中，从金耳中制备得到了金耳多糖。实验所用的金耳粗多糖是从金耳中提取得到的，总糖含量达到93.66％，下面实施例部分也称金耳多糖。将金耳子实体烘干后粉碎，按照料液比1∶10～1：20g：ml或kg：l加入75～95％乙醇常温搅拌20～30h，抽滤，滤饼烘干，得到脱脂干粉；将脱脂干粉加入水，搅拌至脱脂干粉溶胀，调节ph＝5.5～6.5，在温度45～55℃下，加入纤维素酶和果胶酶，45～55℃保温酶解30～45min；再于75～80℃水提0.5～1.5h，冷却，离心，取上清液，蒸发浓缩，加无水乙醇浓度至75～80％，4～8℃醇沉20～30h，离心，取沉淀，干燥，即得金耳粗多糖。具体的提取方法参见cn202111271004.x。
40.银耳多糖由上海辉文生物技术股份有限公司提供。
41.实施例1不同分子量金耳多糖的制备方法
42.金耳多糖降解的方法：取金耳粗多糖1 g溶于100ml水中，充分溶胀，加入适量过氧化氢和等比例的抗坏血酸(7.5mm)，50℃水浴加热4小时，冷却后调节ph至7.0，用截留分子量为1000的透析膜进行透析48h，用100kda的超滤管进行超滤分级，得到大于100k da的金耳多糖降解产物i(e-tap i)和小于100k da的金耳多糖降解产物ii(e-tapii)。
43.实施例2不同分子量金耳多糖的还原力测量
44.称取7.2g磷酸氢二钾十二水合物和3.1g磷酸二氢钾二水合物，分别溶于100ml蒸馏水中，以2：3的比例混合，制成0.2mm的pbs溶液，将浓度为0.25、0.5、1.0、1.5、2.0的e-tap i样品、e-tapii样品、金耳多糖(tap)样品和银耳多糖(wsk)样品各1ml，与2.5ml 0.2mm pbs
溶液和2.5ml 1％铁氰化钾溶液混合，避光，50℃水浴20分钟。再加入5ml 10％三氯乙酸溶液，离心10分钟后，取上清2.5ml，加入2.5ml蒸馏水和0.5ml 0.1％三氯化铁溶液，避光静置10分钟，于700nm波长处测定其吸光度。
45.实验结果如图1所示。
46.由图可知，四种多糖的还原力为：e-tap ii＞e-tap i＞tap＞wsk。与tap相比，e-tap i、e-tap ii还原力显著性提高(**p＜0.01，***p＜0.001)，当多糖浓度为2mg/ml时，e-tap ii的还原力(平均值)为e-tap i的2.1倍，为tap的3.1倍，为银耳多糖的4.3倍。结果表明，e-tapii具有优异的还原力。
47.实施例3不同分子量金耳多糖的dpph自由基清除能力测量
48.称取一定量的dpph，将其溶于无水乙醇，制得0.2mm的dpph溶液。配制浓度分别为0.25、0.5、1.0、1.5、2.0mm的e-tap i样品、e-tapii样品、金耳多糖样品和银耳多糖样品各1ml，分别加入1ml的dpph溶液和1ml无水乙醇，空白对照组用溶剂无水乙醇代替样品即1ml无水乙醇和1mldpph溶液，将其震荡混匀，并在37℃水浴中避光反应30分钟，于517nm波长处测定其吸光度。金耳多糖及其降解物对dpph的清除能力按以下公式计算：
[0049][0050]
式中ai——实验组吸光度
[0051]ai0
——对照组吸光度
[0052]
a0——空白对照组吸光度
[0053]
实验结果如图2所示。
[0054]
由图可知，四种样品的dpph自由基清除能力为：e-tap ii＞e-tap i＞tap＞wsk，与tap相比，e-tap i、e-tapiidpph自由基清除能力显著增加(***p＜0.001)。当多糖浓度为2mg/ml时，e-tap ii的清除率(平均值)为e-tap i的1.5倍，为tap的2.8倍，为银耳多糖的5.6倍。结果表明，e-tap ii具有优异的dpph自由基清除能力。
[0055]
实施例4不同分子量金耳多糖的abts自由基清除能力测量
[0056]
精准配制浓度为7mmol/l的abts溶液和140mmol/l的过硫酸钾溶液。将二者按照一定比例混合，暗处放置12小时后，用无水乙醇调节abts吸光度至0.7(734nm)。取1 ml浓度分别0.25、0.5、1.0、1.5、2.0mm的e-tap i样品、e-tapii样品、金耳多糖样品和银耳多糖样品各1 ml，分别与1 mlabts和1 ml蒸馏水混合，空白对照组用蒸馏水代替样品，震荡摇匀后，于黑暗环境中静置1小时，于734nm波长处测定其吸光度。金耳多糖及其降解物对abts的清除能力按以下公式计算：
[0057][0058]
式中ai——实验组吸光度
[0059]ai0
——对照组吸光度
[0060]
a0——空白对照组吸光度
[0061]
实验结果如图3所示。
[0062]
由图可知，四种多糖的abts自由基清除能力为：e-tap ii＞e-tap i＞tap＞wsk，与tap相比，e-tap i、e-tap ii abts自由基清除能力显著增加(*p＜0.05，***p＜0.001)。
当多糖浓度为2mg/ml时，e-tap ii的清除率(平均值)为e-tap i的1.2倍，为tap的1.9倍，为银耳多糖的3.1倍。结果表明，e-tapii具有优异的abts自由基清除能力。
[0063]
实施例5金耳降解产物i(e-tap i)对角质形成(hacat)的细胞增殖实验
[0064]
将hacat细胞接种至96孔板，在37℃5％co2恒温培养箱中培养24小时后，在显微镜下观察细胞密度和形态，吸出旧培养基，分别加入25、50、100、150、200μg/ml的e-tap i进行处理，37℃5％co2培养箱中培养12小时，用cck-8进行孵育，同时设置空白对照组以调零，并使用酶标仪在450nm处测定吸光度。并按相同的方法培养24、48小时进行测定。
[0065][0066]
实验结果12h、24h、48h细胞存活率如图4、5、6所示。
[0067]
由图可知，培养12h，etap-i浓度为50μg/ml时对细胞增殖影响极其显著(***p＜0.001)，浓度为100μg/rnl和150μg/ml时，对细胞增殖活性影响也非常显著(**p＜0.01)。在培养24h时，200μg/ml的浓度对细胞增殖影响显著(*p＜0.05)，其他浓度均不显著。在培养48h时，金耳降解产物i浓度为50μg/ml时对细胞增殖影响非常显著(***p＜0.01)，浓度为25μg/ml时显著(*p＜0.05)。总体来说，e-tap i在25-200μg/ml范围内对角质形成细胞不具备毒性且具有一定的促增殖功效。
[0068]
实施例6金耳降解产物i(e-tap i)对hacat的热损伤逆转作用
[0069]
首先，将接种至96孔板的细胞分组，分别为对照组(37℃培养组)、给药组(e-tapi)、造模组(48℃造模组)、造模加给药组(48℃+e-tap i)，37℃5％co2恒温培养箱培养24小时后，加入无血清mem培养基进行饥饿24h后，用封口膜将培养皿进行封口，把对应组别的培养皿加入到37℃、48℃的水浴锅中孵育30min，培养皿的底部应完全接触到水面。将相应浓度的含有e-tap i的无血清mem培养基加入到造模后的培养皿中，在培养箱中孵育24小时，用cck-8进行孵育，同时设置空白对照组以调零，并使用酶标仪在450nm处测定吸光度。
[0070]
实验结果如图7所示。
[0071]
由图可知，48℃能显著降低hacat细胞的存活率(***p＜0.001)，与造模组相比，加入25、50μg/ml的e-tap i能显著提高hacat的存活率(#p＜0.05)，实验结果表明，e-tap i能逆转热带来的角质形成细胞损伤。
[0072]
实施例7金耳降解产物i(e-tap i)对角质形成(hacat)的细胞迁移实验
[0073]
将hacat细胞以1.0
×
105个/ml的浓度接种于6孔细胞培养板，培养基为完全的mem培养基，每孔2ml，在5％co2、37℃恒温培养箱中培养至细胞融合率为100％，之后用10μl枪头进行细胞划痕。将e-tap i加入无牛血清的mem基础培养基配制25、50、100μg/ml浓度的样品溶液(以无血清的mem基础培养基为空白对照)分别与细胞共同孵育24h，在0h和24h于显微镜下观察并拍照(0h对应原面积，24对应划痕后面积)，根据以下公式计算迁移率(％)：
[0074][0075]
实验结果如图8所示。
[0076]
根据图可知，与control组相比，12.5、25、50、100μg/ml的浓度的e-tap i对角质形成细胞迁移都具有显著的促进影响(***p＜0.001)且促迁移能力浓度呈依赖性增长，这表明金耳降解产物对角质形成细胞损伤具有促进修护的功效。
[0077]
实施例8金耳降解产物ii(e-tapii)对成纤维细胞(nih-3t3)的细胞增殖实验
[0078]
将nih-3t3细胞接种至96孔板，在37℃5％co2恒温培养箱中培养24小时后，在显微镜下观察细胞密度和形态，吸出旧培养基，分别加入25、50、100、150、200μg/ml的e-tap ii进行处理，37℃5％co2培养箱中培养12小时，用cck-8进行孵育，同时设置空白对照组以调零，并使用酶标仪在450nm处测定吸光度。并按相同的方法培养24、48小时进行测定。
[0079][0080]
实验结果12h、24h、48h细胞存活率如图9、10、11所示。
[0081]
给药12、48小时后，200μg/ml的e-tap ii对nih-3t3细胞具有促增殖功效，存在显著性差异(*p＜0.05)；给药24小时后，50、100、150μg/ml的e-tap ii对nih-3t3细胞具有促增殖功效，存在显著性差异(*p＜0.05，***p＜0.001)。总体来说，e-tap ii在25-200μg/ml范围内对角质形成细胞不具备毒性且具有一定的促增殖功效。
[0082]
实施例9金耳降解产物ii(e-tapii)对成纤维细胞(nih-3t3)的热损伤逆转作用
[0083]
首先，将接种至96孔板的细胞分组，分别为对照组(37℃)、给药组(e-tap ii)、造模组(48℃)、造模加给药组(48℃+e-tap ii)，37℃5％co2恒温培养箱培养24小时后，加入无血清dmem培养基进行饥饿24h后，用封口膜将培养皿进行封口，把对应组别的培养皿加入到37℃、48℃的水浴锅中孵育10min，培养皿的底部应完全接触到水面。将相应浓度的含有e-tap ii的无血清dmem培养基加入到造模后的培养皿中，在培养箱中孵育24小时，用cck-8进行孵育，同时设置空白对照组以调零，并使用酶标仪在450nm处测定吸光度。
[0084]
实验结果如图12所示。
[0085]
由图可知，48℃能显著降低nih-3t3细胞的存活率(***p＜0.001)，与未加e-tap ii的48℃组相比，加入50、100μg/ml的e-tap i能显著提高nih-3t3的存活率(***p＜0.001)，实验结果表明，e-tap ii能逆转热带来的成纤维细胞损伤。

技术特征：
1.一种金耳多糖降解产物，其特征在于，其是金耳多糖通过h2o2联合维生素c的方法降解，并选取分子量＞100k da与1k da＜分子量＜100k da的降解产物制得。2.权利要求1所述的金耳多糖降解产物在制备保护或修复皮肤热损伤的药物中的应用。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述金耳多糖降解产物包括金耳多糖降解产物i和金耳多糖降解产物ii。4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述金耳多糖降解后的分级是通过超滤分级的方法进行。5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述金耳多糖降解产物i分子量＞100k da。6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述金耳多糖降解产物ii分子量大于1k da并且小于100k da。7.权利要求1所述的金耳多糖降解产物在制备保护或修复皮肤热损伤的护肤品或化妆品中的应用。8.金耳多糖降解产物i在制备修护热造成的角质形成细胞损伤的产品中的应用，所述金耳多糖降解产物i是金耳多糖通过h2o2联合维生素c的方法降解，并选取分子量＞100k da的降解产物。9.金耳多糖降解产物ii在制备修护热造成的成纤维细胞损伤的产品中的应用，所述金耳多糖降解产物ii是金耳多糖通过h2o2联合维生素c的方法降解，并选取1k da＜分子量＜100k da的降解产物。10.一种金耳多糖降解产物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)取粗金耳多糖溶于水中，充分溶胀，加入过氧化氢和抗坏血酸；(2)用截留分子量为1000da的透析膜进行透析，截留部分用100kda的超滤管进行超滤分级，得到分子量大于100k da的金耳多糖降解产物i和小于100k da的金耳多糖降解产物ii。

技术总结
本发明公开了一种金耳多糖降解产物，其是金耳多糖通过H2O2联合维生素C的方法降解，并选取分子量＞100k Da与1k Da<分子量<100k Da的降解产物制得。对金耳多糖进行有效的降解可以大大的提升金耳多糖的生物利用率，金耳多糖降解产物I(E-TAP I)和金耳多糖降解产物II(E-TAP II)在皮肤热损伤修护方面具有良好的应用前景。前景。前景。


技术研发人员：曹崇江 刘诗琪 程抒劼 丁静怡
受保护的技术使用者：中国药科大学
技术研发日：2023.06.27
技术公布日：2023/9/25