一种肺损伤细胞模型的构建方法及其在MSC治疗肺损伤的体外药效分析中的应用与流程

一种肺损伤细胞模型的构建方法及其在msc治疗肺损伤的体外药效分析中的应用
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一种肺损伤细胞模型的构建方法及其在msc治疗肺损伤的体外药效分析中的应用。


背景技术：

2.间充质干细胞(mesenchymal stem cells，mscs)是一类来源于发育早期中胚层和外胚层的多功能干细胞，能够自我更新并具有多向分化的潜能，能在成体骨髓、牙髓、脂肪组织、脐带等组织中分离。脐带间充质干细胞取材简单，来源广泛，基本不受伦理学的限制，具有免疫原性低、免疫调节能力强、更易体外扩增等特点，同时还具有胚胎干细胞及成体干细胞的优点，是一种在兽医和人类医学应用中有广阔前景的间充质干细胞来源。
3.目前，mscs越来越多地被研究和应用在治疗肺部疾病方面，研究发现其主要通过以下几个方面的功能来治疗肺部疾病的：(1)归巢作用：mscs具有向炎症或损伤部位归巢的特点，且经静脉注射后首先归巢于肺中，能更好地发挥其治疗肺部疾病的作用。(2)抑制炎症反应：mscs能通过降低炎症因子和升高抗炎因子等减轻肺部炎症。(3)促组织修复与再生：mscs通过旁分泌和分化功能来促进组织修复与再生，分泌血小板生长因子(pdgf)、血管内皮生长因子(vegf)等，这些因子在调节组织损伤修复与再生的过程中发挥关键作用。分化功能主要是mscs可分化为ⅰ型、ⅱ型肺泡细胞，修复损伤的肺组织。(4)免疫调节：mscs能通过改变树突状细胞(dcs)、t细胞、自然杀伤(nk)细胞分泌的细胞因子，从而诱导产生更多的抗炎和耐受表型，对免疫排斥和炎症起着调节作用。(5)作为基因、因子传递载体：mscs能携带相应基因在相应部位高效地表达，在放大药物作用的同时减少多种毒副作用。
4.急性肺损伤(acute lung injury，ali)是肺部疾病发展的第一阶段，它是一种以破坏肺内皮细胞和上皮细胞为主的急性炎症性疾病，炎症反应和肺组织损伤是ali的发病基础。作为肺组织的主要防御者，其上皮细胞能形成强大的天然屏障对抗感染和非感染的刺激所诱导的急性肺损伤过程，所以肺泡和支气管上皮细胞在ali的发病机制和治疗上扮演着非常重要的角色。但目前关于mscs的药效学研究，主要存在于动物实验等体内药效研究，在mscs治疗肺部疾病的体外药效研究鲜有报道。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种肺损伤细胞模型的构建方法及其在msc治疗肺损伤的体外药效分析中的应用。
6.第一方面，本发明保护一种器官或组织损伤细胞模型的构建方法。
7.本发明保护的器官或组织损伤细胞模型的构建方法是在无血清条件下，以上皮细胞作为受体细胞，以脂多糖作为造模剂进行造模。
8.上述器官或组织损伤细胞模型的构建方法可包括如下步骤：将上皮细胞在无血清上皮细胞培养基中进行细胞复苏，得到上皮细胞悬液；然后将所述上皮细胞悬液过夜培养，
待细胞贴壁后将无血清上皮细胞培养基替换为含有脂多糖的无血清上皮细胞培养基进行预刺激。
9.进一步的，所述含有脂多糖的无血清上皮细胞培养基由脂多糖和无血清上皮细胞培养基组成。所述脂多糖在所述含有脂多糖的无血清上皮细胞培养基中的浓度可为1-50μg/ml或1-10μg/ml或10-50μg/ml或1μg/ml或10μg/ml或50μg/ml，优选10μg/ml。
10.所述预刺激的条件可为5％ co2，饱和湿度，37℃预刺激1-48h，优选5％ co2，饱和湿度，37℃预刺激1h。
11.所述器官或组织可为肺、支气管、呼吸道或肺泡，对应的，所述上皮细胞可为肺上皮细胞、支气管上皮细胞、呼吸道上皮细胞或肺泡上皮细胞。
12.所述细胞复苏的方法可包括如下步骤：
13.(1)取冷冻保存的上皮细胞至于37℃环境中直到冻存的细胞完全融化；
14.(2)完成步骤(1)后，将细胞悬液移至装有无血清上皮细胞培养基的离心管中，混匀，离心；
15.(3)完成步骤(2)后，吸弃上清，收集细胞沉淀，并用平衡至室温的无血清上皮细胞培养基重悬细胞，混匀后取细胞悬液用于计数；
16.(4)完成步骤(3)后，将细胞悬液接种于t175培养瓶中，补加无血清上皮细胞培养基，培养至细胞融合度为60-80％。
17.再进一步的，所述器官或组织为肺，对应的，所述上皮细胞为肺上皮细胞，所述器官或组织损伤细胞模型为肺损伤细胞模型。所述肺上皮细胞可为肺上皮细胞beas-2b、气道上皮细胞hbe或肺上皮细胞a549。
18.更进一步的，所述无血清上皮细胞培养基由上皮细胞生长基础培养基、牛垂体提取物(bpe)、氢化可的松(hydrocortisone)、人表皮细胞生长因子(hegf)、肾上腺素(epinephrine)、胰岛素(insulin)、转铁蛋白(transferrin)、三碘甲腺原氨酸(triiodothyronine)、维甲酸(retinoic acid)和赤霉素(ga)组成。其中，所述牛垂体提取物(bpe)、氢化可的松(hydrocortisone)、人表皮细胞生长因子(hegf)、肾上腺素(epinephrine)、胰岛素(insulin)、转铁蛋白(transferrin)、三碘甲腺原氨酸(triiodothyronine)、维甲酸(retinoic acid)和赤霉素(ga)的体积比可为4：1：1：1：1：1：1：1：1。
19.在本发明的一个具体实施方式中，所述肺上皮细胞为肺上皮细胞beas-2b。
20.所述上皮细胞生长基础培养基为bebm支气管上皮细胞生长基础培养基。
21.所述牛垂体提取物(bpe)在所述bebm支气管上皮细胞生长基础培养基中的体积分数为0.4％；所述氢化可的松(hydrocortisone)在所述bebm支气管上皮细胞生长基础培养基中的体积分数为0.1％；所述人表皮细胞生长因子(hegf)在所述bebm支气管上皮细胞生长基础培养基中的体积分数为0.1％；所述肾上腺素(epinephrine)在所述bebm支气管上皮细胞生长基础培养基中的体积分数为0.1％；所述胰岛素(insulin)在所述bebm支气管上皮细胞生长基础培养基中的体积分数为0.1％；所述转铁蛋白(transferrin)在所述bebm支气管上皮细胞生长基础培养基中的体积分数为0.1％；所述三碘甲腺原氨酸(triiodothyronine)在所述bebm支气管上皮细胞生长基础培养基中的体积分数为0.1％；所述维甲酸(retinoic acid)在所述bebm支气管上皮细胞生长基础培养基中的体积分数为
0.1％；所述赤霉素(ga)在所述bebm支气管上皮细胞生长基础培养基中的体积分数为0.1％。
22.第二方面，本发明保护按照上述方法构建得到的器官或组织损伤细胞模型。
23.第三方面，本发明保护上述器官或组织损伤细胞模型的新用途。
24.本发明保护上述器官或组织损伤细胞模型在如下a1)-a8)任一种中的应用。
25.a1)治疗和/或预防器官或组织损伤药物的筛选或开发；
26.a2)治疗和/或预防器官或组织损伤药物的体外药效分析；
27.a3)指示或辅助指示治疗和/或预防器官或组织损伤药物的治疗效果；
28.a4)研究器官或组织损伤的发病机制；
29.a5)制备治疗和/或预防器官或组织损伤药物的筛选或开发的产品；
30.a6)制备治疗和/或预防器官或组织损伤药物的体外药效分析的产品；
31.a7)制备指示或辅助指示治疗和/或预防器官或组织损伤药物的治疗效果的产品；
32.a8)制备研究器官或组织损伤的发病机制的产品。
33.进一步的，所述治疗和/或预防器官或组织损伤药物可为治疗和/或预防肺损伤药物。
34.所述肺损伤包括急性肺损伤、慢性肺损伤、肺纤维化、肺炎和肺上皮细胞损伤。
35.所述治疗和/或预防肺损伤药物可为间充质干细胞。所述间充质干细胞可为人源间充质干细胞。所述人源间充质干细胞可为人骨髓源间充质干细胞、人脐带源间充质干细胞、人脐带血源间充质干细胞或人脂肪源间充质干细胞。
36.更进一步的，所述肺损伤为脂多糖诱导的急性肺损伤。
37.所述间充质干细胞为人脐带源间充质干细胞。
38.第四方面，本发明保护一种间充质干细胞治疗器官或组织损伤的体外药效分析方法。
39.本发明保护的间充质干细胞治疗器官或组织损伤的体外药效分析方法包括如下步骤：
40.a1)将上皮细胞在上述无血清上皮细胞培养基中进行细胞复苏，得到上皮细胞悬液；然后将所述上皮细胞悬液接种于细胞培养板中过夜培养，待细胞完全贴壁后，将所述细胞培养板中的无血清上皮细胞培养基替换为上述含有脂多糖的无血清上皮细胞培养基进行预刺激；
41.a2)将嵌套培养小室放入细胞培养板的孔内，并将间充质干细胞悬液接种于所述嵌套培养小室中进行培养，待细胞完全贴壁后，将含有间充质干细胞的嵌套培养小室插入至步骤a1)获得的细胞培养板中进行共培养；
42.a3)检测步骤a2)获得的共培养后的上皮细胞的损伤指标。
43.进一步的，所述器官或组织可为肺、支气管、呼吸道或肺泡，对应的，所述上皮细胞可为肺上皮细胞、支气管上皮细胞、呼吸道上皮细胞或肺泡上皮细胞。
44.再进一步的，所述器官或组织为肺；所述间充质干细胞治疗器官或组织损伤为间充质干细胞治疗肺损伤；所述上皮细胞为肺上皮细胞；所述损伤指标为肺损伤指标。所述肺上皮细胞可为肺上皮细胞beas-2b、气道上皮细胞hbe或肺上皮细胞a549。
45.所述间充质干细胞可为人源间充质干细胞。所述人源间充质干细胞可为人骨髓源
间充质干细胞、人脐带源间充质干细胞、人脐带血源间充质干细胞或人脂肪源间充质干细胞。
46.所述间充质干细胞悬液为将间充质干细胞按照上述细胞复苏方法进行细胞复苏后得到的溶液。
47.更进一步的，所述肺上皮细胞和所述间充质干细胞的个数比可为1：(1-3)，优选1:1。
48.所述肺上皮细胞在细胞培养板中的密度可为(1-4)
×
104cells/cm2，优选2.5
×
104cells/cm2。
49.所述间充质干细胞在细胞培养板中的密度可为(1-12)
×
104cells/cm2，优选2.5
×
104cells/cm2。
50.所述细胞培养板可为24孔板或6孔板。
51.所述预刺激的条件可为5％ co2，饱和湿度，37℃预刺激1-48h，优选5％ co2，饱和湿度，37℃预刺激1h。
52.所述共培养的条件可为5％ co2，饱和湿度，37℃共培养12
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36h，优选5％ co2，饱和湿度，37℃共培养24h。
53.所述肺损伤为脂多糖诱导的急性肺损伤。
54.所述肺损伤指标可包括细胞形态学、细胞增殖率和/或炎性因子分泌水平。
55.当采用cck8法检测共培养后的上皮细胞的增殖率时，所述细胞培养板为24孔板，所述24孔板中的培养基体积为750μl，所述嵌套培养小室中的培养基体积为250μl。
56.当采用elisa法检测共培养后的上皮细胞的炎性因子分泌水平时，所述细胞培养板为6孔板，所述6孔板中的培养基体积为1500μl，所述嵌套培养小室中的培养基体积为1000μl。
57.所述炎性因子包括炎性因子il-6和/或炎性因子il-8。
58.本发明提供了一种脐带源间充质干细胞治疗肺损伤的体外药效分析方法，所述方法是通过脂多糖(lps)刺激肺上皮细胞beas-2b以诱导急性上皮损伤，在此基础上给予人脐带间充质干细胞进行干预，以探究msc抑制beas-2b细胞凋亡和炎症反应的情况，进而进行间充质干细胞治疗肺损伤的体外药效分析。通过实验证明：本发明通过脂多糖lps刺激肺上皮细胞beas-2b诱导急性上皮损伤后，选择人脐带间充质干细胞与肺上皮细胞进行体外共培养，均能提高上皮细胞存活率，抑制细胞凋亡和降低炎性因子il-6/il-8分泌，对肺损伤具有明显改善。本发明提供的方法可稳定指示间充质干细胞治疗肺损伤的效果。
59.本发明的优点主要在于两个方面：
60.(1)本发明建立了肺损伤体外细胞模型，该模型采用肺上皮细胞beas-2b作为受体细胞，使用lps作为造模剂，并以无血清体系进行造模。具有造模周期短，造模剂剂量低(现有技术中造模剂lps的常用剂量为100μg/ml，造模周期需要24-48h；而本发明中造模剂lps的使用剂量优选10μg/ml，为常用剂量的1/10，且造模周期仅为1h)，可重复性高，对肺部细胞损伤的模拟程度高的优势。该模型对后续治疗/预防肺损伤药物的开发具有重要意义。
61.(2)在本发明建立的模型基础上，明确了用间充质干细胞msc对肺损伤进行治疗性给药的各个参数，并从抑制细胞凋亡和降低炎性因子分泌两个方面都证明了间充质干细胞msc对肺损伤有治疗作用。
附图说明
62.图1为不同浓度造模剂刺激肺上皮细胞后的细胞增殖活力结果。
63.图2为两种体系培养细胞后的细胞增殖活力检测结果。
64.图3为非接触式间接共培养示意图。
65.图4为显微镜下的细胞形态图。
具体实施方式
66.下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
67.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
68.下述实施例中的肺上皮细胞beas-2b是icell公司的产品，货号为icell-h023。
69.下述实施例中的begm培养基是lonza公司的产品，货号为cc-3170，为在500ml的bebm支气管上皮细胞生长基础培养基(lonza，货号：cc-3171)中加入begm singlequots添加剂及生长因子(lonza，货号：cc-4175)后得到的培养基，其中，cc-4175的具体成分为bpe 2.0ml；hydrocortisone 0.5ml；hegf 0.5ml；epinephrine 0.5ml；insulin 0.5ml；transferrin 0.5ml；triiodothyronine 0.5ml；retinoic acid 0.5ml；ga 0.5ml。
70.下述实施例中的脂多糖(lps)是sigma的产品，货号为l4268-10mg。
71.下述实施例中的cck8检测液是dojindo的产品，货号为ck04。
72.下述实施例中的dmem高糖基础培养基是bi的产品，货号为06-1055-57-1acs。
73.下述实施例中的dmem/f12基础培养基是bi的产品，货号为04-172-1acs。
74.下述实施例中的胎牛血清是bi的产品，货号为04-001-1acs。
75.下述实施例中的间充质干细胞无血清完全培养基为在500ml间充质干细胞无血清基础培养基(友康生物，货号为nc0103)中加入5ml间充质干细胞无血清培养基添加剂(友康生物，货号：nc0103.s)后得到的培养基。
76.下述实施例中的嵌套培养小室是bd的产品，货号为353095。
77.下述实施例中的人白介素6的elisa试剂盒是novus的产品，货号为val102。
78.下述实施例中的人白介素8的elisa试剂盒是novus的产品，货号为val103。
79.实施例1、肺损伤体外细胞模型的构建
80.本发明在无血清体系中通过10μg/ml lps刺激肺上皮细胞beas-2b以诱导急性上皮损伤，建立肺损伤体外细胞模型。具体步骤如下：
81.1、肺上皮细胞beas-2b的细胞复苏
82.(1)取冷冻保存的肺上皮细胞beas-2b，将细胞冻存管放入37℃水浴锅中，复温晃动冻存管以提高复温速率，直到冻存的细胞完全融化。
83.(2)完成步骤(1)后，将冻存管中的细胞悬液移至装有begm培养基的离心管中，混匀，300g离心5分钟。
84.(3)完成步骤(2)后，吸弃上清，收集细胞沉淀，并用平衡至室温的begm培养基重悬
细胞，混匀后取细胞悬液用于计数。
85.(4)完成步骤(3)后，按照约2.0
×
104cells/cm2的密度接种于t175培养瓶中，补加begm培养基至35ml。
86.(5)完成步骤(4)后，将t175培养瓶置于5％ co2，饱和湿度，37℃培养箱培养，培养至细胞融合度为60-80％。
87.2、lps造模浓度的优化
88.按照约1.0
×
104cells/cm2的密度铺96孔板，将浓度为4
×
104cells/ml的beas-2b细胞悬液接种至96孔板，每孔加入100μl细胞悬液，即4
×
103cells/孔。然后在5％co2，饱和湿度，37℃培养箱中培养过夜，待细胞贴壁后给予不同剂量lps(1μg/ml、2μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、50μg/ml)刺激，同时以不给予lps刺激作为对照组(对照组细胞与实验组细胞培养相同时间)。培养完毕后，每孔加入10μl cck8检测液，继续在37℃培养箱里孵育2h，孵育2h后使用酶标仪在450nm波长下测定吸光度。
89.结果如图1所示，结果显示：lps可以呈现剂量依赖性地使beas-2b细胞活力下降，在lps浓度为10μg/ml及以上的时候，细胞活力下降至20％以下，高于通常使用的lps损伤模型水平。
90.3、lps刺激造模
91.按照约1.0
×
104cells/cm2的密度铺96孔板，将浓度为4
×
104cells/ml的beas-2b细胞悬液接种至96孔板，每孔加入100μl细胞悬液，即4
×
103cells/孔。然后在5％co2，饱和湿度，37℃培养箱中培养过夜，待细胞贴壁后，根据处理方式不同，设置如下4个处理组：
92.(1)正常对照组：细胞贴壁后，在begm培养基中继续培养。
93.(2)无血清阳性对照组：细胞贴壁后，将begm培养基换为含有10μg/ml lps的begm培养基培养1h。
94.(3)有血清阳性对照组1：细胞贴壁后，将begm培养基换为含有10μg/ml lps的dmem高糖完全培养基(dmem高糖完全培养基为dmem高糖基础培养基+10％胎牛血清fbs)培养24h。
95.(4)有血清阳性对照组2：细胞贴壁后，将begm培养基换为含有100μg/ml lps的dmem高糖完全培养基(dmem高糖完全培养基为dmem高糖基础培养基+10％胎牛血清fbs)培养24h。
96.培养条件均为在5％ co2，饱和湿度，37℃培养箱中进行培养。
97.培养完毕后，每孔加入10μl cck8检测液，继续在37℃培养箱里孵育2h，孵育2h后使用酶标仪在450nm波长下测定吸光度。
98.结果见表1和图2所示，结果显示：在无血清条件下的阳性对照组中，10μg/ml lps刺激beas-2b细胞1h后，细胞增殖活力明显下降，细胞活力仅为19％；而在有血清条件下的低剂量造模剂的血清阳性对照组中，10μg/ml lps刺激beas-2b细胞24h后，没有造成肺上皮细胞损伤；在有血清条件下的高剂量造模剂的血清阳性对照组中，100μg/ml lps刺激beas-2b细胞24h后，肺上皮细胞的增值活力仍为88％，远差于本发明的无血清造模体系。综上所述，本发明在无血清条件下建立的肺损伤体外细胞模型，造模周期短，可重复性高，对肺部细胞损伤的模拟程度高。
99.表1、cck8细胞增殖活力
100.组别od450细胞增殖活力正常对照组1.078
±
0.038100％无血清阳性对照组0.206
±
0.01919％有血清阳性对照组11.248
±
0.110116％有血清阳性对照组21.058
±
0.03588％
101.实施例2、间充质干细胞抑制肺部细胞损伤凋亡
102.一、非接触式间接共培养
103.将间充质干细胞msc和肺上皮细胞beas-2b进行非接触式间接共培养，具体培养方法如下：
104.1、细胞复苏
105.按照实施例1步骤1中的细胞复苏方法复苏间充质干细胞msc(p4代)和肺上皮细胞beas-2b。其中，msc按8,000-11,000个细胞/cm2的密度接种于t75培养瓶中，每瓶补加间充质干细胞无血清完全培养基至25ml，做好标记后置于5％ co2，饱和湿度，37℃培养箱培养至细胞融合度为60-80％。
106.间充质干细胞msc(p4代)的具体制备方法如下：取离体的脐带进行消毒，得到消毒后脐带；然后将所述消毒后脐带清洗后剪成1-2cm小段，得到脐带小段；再将脐带小段清洗后剪成1-2mm3组织块，采用胎牛血清完全培养基(90％ dmem/f12培养基+10％ fbs)，置于5％co2、饱和湿度、37℃条件下培养离体的脐带组织块；最后待间充质干细胞爬出后，传代培养至p4代冻存。
107.2、非接触式间接共培养
108.第一天(d1)：按照2.5
×
104cells/cm2的密度铺24孔板，将beas-2b细胞和msc细胞制备成浓度为1
×
105cells/ml的细胞悬液，将500μl beas-2b细胞悬液接种在24孔板中，即接种总数量为5
×
104个细胞；另取一个24孔板，在孔内放入嵌套培养小室，然后将500μl msc细胞悬液接种于嵌套培养小室中；两块孔板做好标记，放置于5％ co2，饱和湿度，37℃培养箱培养过夜。
109.第二天(d2)：待细胞完全贴壁后，根据培养方式不同，分为如下3个处理组：
110.正常对照组：beas-2b细胞常规培养不予以任何刺激；过夜贴壁后，更换新鲜begm培养基培养24h。
111.共培养模型组：将24孔板中过夜培养的beas-2b细胞培养基换为750μl含有10μg/ml lps的begm培养基，预刺激1h后插入接种msc细胞的嵌套培养小室，且将嵌套培养小室内的培养基更换为250μl新鲜begm培养基，得到共培养模型，并将其置于5％ co2，饱和湿度，37℃培养箱中共培养24h。在共培养模型中，beas-2b细胞接种在孔板下层，msc细胞接种在上层嵌套培养小室中，小室底部为孔径0.4μm的高密度膜，细胞无法通过，因此小室内细胞和孔板底部两种细胞无法接触，成功构建了两种细胞的非接触式共培养。示意图如图3所示。
112.模型对照组：将24孔板中beas-2b细胞培养基换为750μl含有10μg/ml lps的begm培养基，预刺激1h后，插入仅含有250μl begm培养基的嵌套培养小室，得到模型对照组，并将其置于5％ co2，饱和湿度，37℃培养箱中培养24h。
113.第三天(d3)：结束培养，观察细胞形态变化和测定cck8细胞增殖活率。
114.二、细胞形态观察
115.培养完成后，在光学显微镜下进行细胞学形态观察。
116.结果如图3所示，结果显示：在造模剂lps存在下，共培养模型组中的beas-2b细胞生长状态良好，无明显的死细胞漂浮，反观模型对照组中的beas-2b细胞大部分已经死亡，只剩下少量细胞存活。从细胞形态可以看出msc细胞可以抑制由lps造成的肺上皮细胞beas-2b的损伤凋亡。
117.三、细胞增殖活力检测
118.培养结束前，每孔加入75μl cck8检测液，加入cck8检测液后继续在37℃细胞培养箱里孵育2h，孵育完成后使用酶标仪在450nm波长下测定吸光度。
119.结果如表2所示，结果显示：在造模剂lps存在下，共培养模型组中的beas-2b细胞增殖活力与正常生长(不加lps刺激)的beas-2b细胞相当，模型对照组中的beas-2b细胞增殖活率仅为12％，两组比较具有极显著差异，同样证明msc可抑制由lps造成的肺上皮细胞beas-2b的损伤凋亡。
120.表2、共培养cck8细胞增殖活力
[0121][0122][0123]
注：模型组1、2、3为不同批号的msc细胞。
[0124]
实施例3、间充质干细胞抑制肺部炎性因子分泌
[0125]
一、非接触式间接共培养
[0126]
将间充质干细胞msc和人肺上皮细胞beas-2b进行非接触式间接共培养，具体培养方法如下：
[0127]
1、细胞复苏
[0128]
按照实施例1和实施例2中的细胞复苏方法复苏间充质干细胞msc(p4代)和肺上皮细胞beas-2b。
[0129]
2、非接触式间接共培养
[0130]
第一天(d1)：按照2.5
×
104cells/cm2的密度铺6孔板，将beas-2b细胞和msc细胞制备成浓度为2.5
×
105cells/ml的细胞悬液，将1ml beas-2b细胞悬液接种在6孔板中，即接种总数量为2.5
×
105个细胞；另取一个6孔板，在孔内放入嵌套培养小室，然后将1ml msc细胞悬液接种于小室中；两块孔板做好标记，放置于5％co2，饱和湿度，37℃培养箱培养过夜待其贴壁。
[0131]
第二天(d2)：待细胞完全贴壁后，根据培养方式不同，分为如下3个处理组：
[0132]
正常对照组：beas-2b细胞常规培养不予以任何刺激；过夜贴壁后，更换新鲜begm培养基培养24h。
[0133]
共培养模型组：将6孔板中过夜培养的beas-2b细胞培养基换为1.5ml含有10μg/ml lps的begm培养基，预刺激1h后插入接种msc细胞的嵌套培养小室，且将嵌套培养小室内的培养基更换为1ml新鲜begm培养基，得到共培养模型，并将其置于5％ co2，饱和湿度，37℃培养箱中共培养24h。
[0134]
模型对照组：将6孔板中过夜培养的beas-2b细胞培养基换为1.5ml含有10μg/ml lps的begm培养基，预刺激1h后，插入仅含有1ml新鲜begm培养基的嵌套培养小室，得到模型对照组，并将其置于5％ co2，饱和湿度，37℃培养箱中培养24h。
[0135]
第三天(d3)：结束培养，收集上清，检测il-6和il-8蛋白水平。
[0136]
二、il-6和il-8水平检测
[0137]
分别使用人白介素6和人白介素8的elisa试剂盒检测il-6和il-8蛋白水平。
[0138]
结果如表3所示，结果显示：msc细胞在lps存在下与beas-2b共培养后，可明显下调beas-2b细胞的炎性因子指标，其中下调il-6的指标具有极显著差异(p＜0.01)，下调il-8具有显著差异(p＜0.05)，均具有统计学意义。
[0139]
表3、炎性因子分泌情况
[0140]
组别il-6(pg/ml)il-8(pg/ml)正常对照组2063.95
±
58.012728.49
±
9.83模型组11449.16
±
65.032445.78
±
61.46模型组21439.69
±
36.912367.87
±
105.27模型组31450.10
±
16.262256.19
±
103.75模型对照组2289.10
±
79.993284.91
±
236.54
[0141]
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本技术欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本技术中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

技术特征：
1.一种器官或组织损伤细胞模型的构建方法，所述方法是在无血清条件下，以上皮细胞作为受体细胞，以脂多糖作为造模剂进行造模。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：将上皮细胞在无血清上皮细胞培养基中进行细胞复苏，得到上皮细胞悬液；然后将所述上皮细胞悬液过夜培养，待细胞贴壁后将无血清上皮细胞培养基替换为含有脂多糖的无血清上皮细胞培养基进行预刺激。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述脂多糖在所述含有脂多糖的无血清上皮细胞培养基中的浓度为1-50μg/ml；或，所述脂多糖在所述含有脂多糖的无血清上皮细胞培养基中的浓度为10μg/ml。4.根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于：所述预刺激的条件为5％co2，饱和湿度，37℃预刺激1-48h。5.根据权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于：所述上皮细胞为肺上皮细胞、支气管上皮细胞、呼吸道上皮细胞或肺泡上皮细胞；或，所述上皮细胞为肺上皮细胞，所述细胞模型为肺损伤细胞模型；或，所述肺上皮细胞为肺上皮细胞beas-2b、气道上皮细胞hbe或肺上皮细胞a549。6.按照权利要求1-5任一所述方法构建得到的器官或组织损伤细胞模型。7.权利要求6所述的器官或组织损伤细胞模型在如下a1)-a8)任一种中的应用：a1)治疗和/或预防器官或组织损伤药物的筛选或开发；a2)治疗和/或预防器官或组织损伤药物的体外药效分析；a3)指示或辅助指示治疗和/或预防器官或组织损伤药物的治疗效果；a4)研究器官或组织损伤的发病机制；a5)制备治疗和/或预防器官或组织损伤药物的筛选或开发的产品；a6)制备治疗和/或预防器官或组织损伤药物的体外药效分析的产品；a7)制备指示或辅助指示治疗和/或预防器官或组织损伤药物的治疗效果的产品；a8)制备研究器官或组织损伤的发病机制的产品。8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述治疗和/或预防器官或组织损伤药物为治疗和/或预防肺损伤药物；或，所述治疗和/或预防肺损伤药物为间充质干细胞；或，所述间充质干细胞为人脐带源间充质干细胞；或，所述肺损伤包括急性肺损伤、慢性肺损伤、肺纤维化、肺炎、肺上皮细胞损伤；或，所述肺损伤为脂多糖诱导的急性肺损伤。9.一种间充质干细胞治疗器官或组织损伤的体外药效分析方法，包括如下步骤：a1)将上皮细胞在无血清上皮细胞培养基中进行细胞复苏，得到上皮细胞悬液；然后将所述上皮细胞悬液接种于细胞培养板中过夜培养，待细胞完全贴壁后，将所述细胞培养板中的无血清上皮细胞培养基替换为含有脂多糖的无血清上皮细胞培养基进行预刺激；a2)将嵌套培养小室放入细胞培养板的孔内，并将间充质干细胞悬液接种于所述嵌套培养小室中进行培养，待细胞完全贴壁后，将含有间充质干细胞的嵌套培养小室插入至步骤a1)获得的细胞培养板中进行共培养；a3)检测步骤a2)获得的共培养后的上皮细胞的损伤指标。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述脂多糖在所述含有脂多糖的无血清上皮细胞培养基中的浓度为1-50μg/ml；或，所述脂多糖在所述含有脂多糖的无血清上皮细胞培养基中的浓度为10μg/ml；或，所述上皮细胞为肺上皮细胞、支气管上皮细胞、呼吸道上皮细胞或肺泡上皮细胞；或，所述上皮细胞为肺上皮细胞；或，所述肺上皮细胞为肺上皮细胞beas-2b、气道上皮细胞hbe或肺上皮细胞a549；或，所述肺上皮细胞和所述间充质干细胞的个数比为1：(1-3)；或，所述肺上皮细胞在细胞培养板中的密度为(1-4)
×
104cells/cm2；或，所述间充质干细胞在细胞培养板中的密度为(1-12)
×
104cells/cm2；或，所述预刺激的条件为5％co2，饱和湿度，37℃预刺激1-48h；或，所述共培养的条件为5％co2，饱和湿度，37℃共培养12-36h；或，所述损伤指标为肺损伤指标；或，所述肺损伤指标包括细胞形态学、细胞增殖率和/或炎性因子分泌水平；或，所述炎性因子包括炎性因子il-6和/或炎性因子il-8。

技术总结
本发明公开了一种肺损伤细胞模型的构建方法及其在MSC治疗肺损伤的体外药效分析中的应用。所述方法是通过脂多糖(LPS)刺激肺上皮细胞BEAS-2B以诱导急性上皮损伤，在此基础上给予人脐带间充质干细胞进行干预，以探究MSC抑制BEAS-2B细胞凋亡和炎症反应的情况，进而进行间充质干细胞治疗肺损伤的体外药效分析。通过实验证明：本发明通过LPS刺激肺上皮细胞BEAS-2B诱导急性上皮损伤后，选择人脐带间充质干细胞与肺上皮细胞进行体外共培养，均能提高上皮细胞存活率，抑制细胞凋亡和降低炎性因子IL-6/IL-8分泌，对肺损伤具有明显改善。本发明提供的方法可稳定指示间充质干细胞治疗肺损伤的效果。损伤的效果。


技术研发人员：张宇 潘锦华 齐奇 张金龙 王磊 石晓宇
受保护的技术使用者：武汉光谷中源药业有限公司
技术研发日：2023.06.28
技术公布日：2023/9/25