甘草查尔酮A在制备治疗代谢紊乱药物中的应用

甘草查尔酮a在制备治疗代谢紊乱药物中的应用
技术领域：
1.本发明属于医学治疗领域，本发明具体提供了甘草查尔酮a在制备治疗代谢紊乱药物中的应用。


背景技术：

2.糖尿病已经成为威胁人类生命健康的第三大疾病，其中2型糖尿病(type 2diabetes mellitus，t2dm)患者占总糖尿病患者90％以上。2型糖尿病是一种常见且严重的慢性代谢疾病，它的发生是由于肝脏、骨骼肌、脂肪等组织产生胰岛素抵抗和/或胰腺出现β细胞功能障碍所造成的。它的典型特征是由胰岛素抵抗引起的高血糖，表现在葡萄糖摄取紊乱、能量代谢紊乱等方面，后续其病情加剧常引发多种严重的并发症，包括大血管并发症(心血管疾病)和微血管并发症(肾脏、视网膜和神经系统疾病等)，是生命安全的巨大威胁。此外，2020年我国糖尿病相关医疗支出高达1653亿美元，全球排名第二，糖尿病人均治疗费用2188.73元，在家庭卫生支出中占比约为34％，给社会、家庭带来了沉重的经济负担。
3.中药甘草，又名国老、甜草根等，是我国最常用的大宗药材之一，其最早记载于《神农本草经》，具有补中益气、清热解毒、化痰止咳、调和诸药的功效，适用于脾胃虚弱、身体倦怠乏力、咳嗽痰多等临床症状，还可以缓解药物的毒性和烈性。黄酮类化合物是甘草的主要活性成分，其结构多样，是甘草发挥多种药理功效的基础。甘草查尔酮a(licochalcone a，lca)是甘草中分离得到的黄酮类化合物，前期研究显示其具有抗炎、抗氧化、抗癌等多种药理活性。


技术实现要素：

4.本发明旨在提供甘草查尔酮a在制备治疗代谢紊乱药物中的应用。
5.本发明旨在提供甘草查尔酮a在制备治疗糖代谢紊乱药物中的应用。
6.上述应用，其所述糖代谢紊乱为肝脏糖原合成途径紊乱。
7.上述应用，其所述糖代谢紊乱为肝脏糖异生途径紊乱。
8.本发明旨在提供甘草查尔酮a在制备调控能量代谢紊乱药物中的应用。
9.综上，本发明人拟通过提供上述应用来探究甘草查尔酮a改善2型糖尿病代谢紊乱的潜力及可行性，系统解析其分子作用机制，从而为开发新型临床抗2型糖尿病药物奠定基础。
具体实施方式
10.下面通过一些具体的实验例来对本发明做进一步的阐述。
11.实验例1-甘草查尔酮a可有效改善异常糖代谢
12.实验方法：
13.体内实验：选取spf级8周龄雄性c57bl/6j小鼠为实验动物。小鼠适应性喂养1周后随机分为高糖高脂饲料喂养组和普通维持饲料喂养组。3周后，将小鼠禁食12h，高糖高脂饲
料喂养组腹腔注射低剂量链脲佐菌素溶液(注射剂量为30mg/kg)，普通维持饲料喂养组小鼠则注射等量柠檬酸盐缓冲液，持续5天。待小鼠血糖水平稳定后，检测其7h空腹血糖水平，连续3次≥11.1mm即视为2型糖尿病模型构建成功。对造模成功的小鼠进行分组，每组6只，分组情况如下：
14.(1)空白组：普通维持饲料喂养组小鼠腹腔注射柠檬酸盐缓冲液；
15.(2)空白给药组：普通维持饲料喂养组小鼠腹腔注射甘草查尔酮a(5mg/kg)；
16.(3)模型组：2型糖尿病小鼠腹腔注射柠檬酸盐缓冲液；
17.(4)低剂量给药组：2型糖尿病小鼠腹腔注射甘草查尔酮a(5mg/kg)；
18.(5)高剂量给药组：2型糖尿病小鼠腹腔注射甘草查尔酮a(10mg/kg)；
19.(6)阳性药组：2型糖尿病小鼠腹腔注射二甲双胍(metformin，met)(200mg/kg)。
20.3天给药1次，给药21天。完成后，取小鼠肝脏，部分肝脏样品用于制备石蜡切片并pas染色，以观察肝糖原分布及积累情况；其余肝脏样品用于后续检测。采用糖原测定试剂盒检测肝糖原含量；采用elisa法检测糖原合成激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β，gsk-3β)、葡萄糖激酶(glucokinase，gck)、6-磷酸果糖激酶-2/果糖-2，6-二磷酸酶3(phosphofructokinase-2/fructose-2，6-bisphosphatase，pfkfb3)及肝细胞核因子4α(hepatocyte nuclear factor 4α，hnf4α)的蛋白水平；采用酶活检测试剂盒检测葡萄糖-6-磷酸酶(glucose-6-phosphatase，g6p)、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(phosphoenolpyruvate carboxykinase，pepck)、丙酮酸羧化酶(pyruvate carboxylase，pc)的蛋白活性。
21.体外实验：选取人肝癌hepg2细胞为实验细胞系，设置空白组、给药组(甘草查尔酮a终浓度为5、10、20、50μm)、阳性药组(二甲双胍终浓度为1mm)，每组3个重复，孵育24h后采用同样方法检测以上关键酶。
22.实验结果：
23.图1肝脏pas染色结果显示，经甘草查尔酮a治疗后，紫色加深，表明甘草查尔酮a可增加2型糖尿病小鼠肝糖原积累。图2显示甘草查尔酮a治疗可显著提高2型糖尿病小鼠肝糖原的含量，与上述pas染色结果相吻合。图3-图4显示，甘草查尔酮a可显著降低2型糖尿病小鼠肝脏及hepg2细胞中糖原合成激酶-3β(gsk-3β)的蛋白水平，同时提高葡萄糖激酶(gck)的蛋白水平，提示甘草查尔酮a可有效促进糖原合成。图5-图8显示，甘草查尔酮a可显著抑制2型糖尿病小鼠肝脏中葡萄糖-6-磷酸酶(g6p)、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(pepck)、丙酮酸羧化酶(pc)的蛋白活性，提高6-磷酸果糖激酶-2/果糖-2，6-二磷酸酶3(pfkfb3)的蛋白水平，在hepg2细胞中也观察到了同样的现象；图9显示，甘草查尔酮a可显著降低2型糖尿病小鼠肝脏肝细胞核因子-4α(hnf4α)的水平，以上结果说明甘草查尔酮a可显著抑制肝脏糖异生。以上各指标体内检测数据列于表1中，体外检测数据列于表2中。
24.表1实验例1体内实验数据(n＝6，mean
±
sd)
[0025][0026]
表2实验例1体外实验数据(n＝3，mean
±
sd)
[0027][0028]
综上，可以确认甘草查尔酮a可以用于制备改善2型糖尿病导致的糖代谢紊乱的药物中的应用：尤其可通过以下7个途径中的1个或多个：
[0029]
(1)抑制糖原合成激酶-3β(gsk-3β)的蛋白水平；
[0030]
(2)和/或提高葡萄糖激酶(gck)的蛋白水平；
[0031]
(3)和/或抑制葡萄糖-6-磷酸酶(g6p)的蛋白活性；
[0032]
(4)和/或抑制磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(pepck)的蛋白活性；
[0033]
(5)和/或抑制丙酮酸羧化酶(pc)的蛋白活性；
[0034]
(6)和/或促进6-磷酸果糖激酶-2/果糖-2，6-二磷酸酶3(pfkfb3)的蛋白水平；
[0035]
(7)和/或抑制肝细胞核因子4α(hnf4α)的水平。
[0036]
以上结果表明甘草查尔酮a可通过促进肝糖原合成，抑制肝脏糖异生，从而改善2
型糖尿病导致的糖代谢紊乱。
[0037]
实验例2-甘草查尔酮a可有效改善异常能量代谢
[0038]
实验方法：
[0039]
体内实验：小鼠造模、分组和给药方法同实验例1。取小鼠肝脏，采用检测系统生物发光试剂盒检测atp含量、采用jc10线粒体膜电位试剂盒检测线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential，mmp)水平、采用活性氧检测试剂盒检测线粒体活性氧(reactive oxygen species，ros)含量以及采用线粒体呼吸链复合物v elisa试剂盒检测线粒体呼吸链复合物v(mitochondrial respiratory chain complexes v)活性。
[0040]
体外实验：hepg2细胞处理及给药方法同实验例1，同样采用以上试剂盒检测甘草查尔酮a处理对hepg2细胞中线粒体膜电位水平、活性氧含量、呼吸链复合物v活性，并采用实时荧光定量rt-qpcr法检测线粒体生物发生、动态及自噬相关基因mrna水平的影响。
[0041]
实验结果：
[0042]
图10显示，甘草查尔酮a可显著降低2型糖尿病小鼠肝脏atp水平。图11显示，甘草查尔酮a可显著提高2型糖尿病小鼠肝脏线粒体膜电位水平。图12显示，甘草查尔酮a可显著降低2型糖尿病小鼠肝脏线粒体活性氧水平。图13显示，甘草查尔酮a可显著抑制2型糖尿病小鼠肝脏及hepg2细胞中线粒体呼吸链复合物v活性。图14显示，甘草查尔酮a可提高线粒体总dna量。由图15-图18可知，甘草查尔酮a可上调去乙酰化酶1(sirtuin 1，sirt1)、pparγ共激活因子1α(pparγ co-activator 1α，pgc-1α)和线粒体转录因子a(mitochondrial transcription factor a，tfam)的mrna水平，下调叉头盒蛋白1(forkhead box o1，foxo1)的mrna水平，从而在转录水平上促进线粒体生物发生。由图19-图20可知，甘草查尔酮a可上调线粒体融合蛋白(mitofusin，mfn)1和2的mrna水平，从而在转录水平上促进线粒体融合。由图21-图23可知，甘草查尔酮a可下调线粒体动力相关蛋白1(dynamin-related protein 1，drp1)、线粒体分裂因子(mitochondrial fission factor，mff)和线粒体分裂蛋白1(mitochondrial fission protein 1，fis1)的mrna水平，从而在转录水平上抑制线粒体分裂。由图24-图25可知，甘草查尔酮a可上调pten诱导激酶1(pten-induced putative kinase 1，pink1)、rbre3泛素蛋白连接酶(rbre3 ubiquitin protein ligase，parkin)的mrna水平，从而在转录水平上促进线粒体自噬。以上各指标体内检测数据列于表3中，体外检测数据列于表4中。
[0043]
表3实验例2体内实验数据(n＝6，mean
±
sd)
[0044]
[0045]
表4实验例2体外实验数据(n＝3，mean
±
sd)
[0046][0047][0048]
综上，可以确认甘草查尔酮a可以用于制备改善2型糖尿病导致的能量代谢紊乱的药物中的应用：尤其可通过以下16个途径中的1个或多个：
[0049]
(1)可降低2型糖尿病小鼠肝脏atp水平；
[0050]
(2)和/或提高2型糖尿病小鼠肝脏线粒体膜电位水平；
[0051]
(3)和/或降低2型糖尿病小鼠肝脏线粒体活性氧水平；
[0052]
(4)和/或抑制2型糖尿病小鼠肝脏及hepg2细胞中线粒体呼吸链复合物v活性；
[0053]
(5)和/或提高线粒体总dna量；
[0054]
(6)和/或上调去乙酰化酶1(sirt1)的mrna水平；
[0055]
(7)和/或上调pparγ共激活因子1α(pgc-1α)的mrna水平；
[0056]
(8)和/或上调线粒体转录因子a(tfam)的mrna水平；
[0057]
(9)和/或下调叉头盒蛋白1(foxo1)的mrna水平；
[0058]
(10)和/或上调线粒体融合蛋白1(mfn1)的mrna水平；
[0059]
(11)和/或上调线粒体融合蛋白2(mfn2)的mrna水平；
[0060]
(12)和/或下调线粒体动力相关蛋白1(drp1)的mrna水平；
[0061]
(13)和/或下调线粒体分裂因子(mff)的mrna水平；
[0062]
(14)和/或下调线粒体分裂蛋白1(fis1)的mrna水平；
[0063]
(15)和/或上调pten诱导激酶1(pink1)的mrna水平；
[0064]
(16)和/或上调rbre3泛素蛋白连接酶(parkin)的mrna水平。
[0065]
以上结果表明甘草查尔酮a可通过抑制线粒体呼吸链复合物v的活性而抑制atp的合成，同时表现出一定的线粒体保护和抗氧化效果，从而改善2型糖尿病引起的能量代谢紊乱。在转录水平上，甘草查尔酮a可促进线粒体生物发生和自噬，促进线粒体融合，抑制线粒体分裂，从而调控线粒体动态，并维持细胞线粒体稳态。
[0066]
在本发明所涉及的所有附图中，体内实验中
#
与
##
表示与模型组相比p＜0.05及p＜0.01；
＊
与
＊＊
表示与空白组相比p＜0.05及p＜0.01；体外实验中与表示与空白组相比p＜0.05及p＜0.01。
附图说明
[0067]
图1小鼠肝脏pas染色结果
[0068]
图2小鼠肝脏糖原含量测定结果
[0069]
图3糖原合成激酶-3β水平检测结果
[0070]
图4葡萄糖激酶水平检测结果
[0071]
图5葡萄糖-6-磷酸酶活性检测结果
[0072]
图6磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶活性检测结果
[0073]
图7丙酮酸羧化酶活性检测结果
[0074]
图8 6-磷酸果糖激酶-2/果糖-2，6-二磷酸酶3水平检测结果
[0075]
图9小鼠肝脏肝细胞核因子4α水平检测结果
[0076]
图10小鼠肝脏atp相对含量检测结果
[0077]
图11线粒体膜电位相对水平检测结果
[0078]
图12线粒体活性氧相对含量检测结果
[0079]
图13线粒体呼吸链复合物v相对活性检测结果
[0080]
图14线粒体总dna量的检测结果
[0081]
图15去乙酰化酶1相对mrna水平的检测结果
[0082]
图16 pparγ共激活因子1α相对mrna水平的检测结果
[0083]
图17线粒体转录因子a相对mrna水平的检测结果
[0084]
图18叉头盒蛋白1相对mrna水平的检测结果
[0085]
图19线粒体融合蛋白1相对mrna水平的检测结果
[0086]
图20线粒体融合蛋白2相对mrna水平的检测结果
[0087]
图21线粒体动力相关蛋白1相对mrna水平的检测结果
[0088]
图22线粒体分裂因子相对mrna水平的检测结果
[0089]
图23线粒体分裂蛋白1相对mrna水平的检测结果
[0090]
图24 pten诱导激酶1相对mrna水平的检测结果
[0091]
图25 rbre3泛素蛋白连接酶相对mrna水平的检测结果
[0092]
以上所述实验方案仅是本次发明的优选方案，应当指出，在本发明上述实施例中，对各个实施例的描述各有侧重，某个实施例中没有洋述的部分，可参见其他实施例的相关描述。此外，对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，可以做出若干润饰和改进，这些润饰和改进也应视为本发明的保护范围。
[0093]
缩略语
[0094]
[0095]

技术特征：
1.甘草查尔酮a在制备治疗代谢紊乱药物中的应用。2.根据权利要求1所述应用，其特征在于所述代谢紊乱为肝脏糖代谢紊乱。3.根据权利要求2所述应用，其特征在于所述肝脏糖代谢紊乱为肝脏糖原合成紊乱。4.根据权利要求2所述应用，其特征在于所述肝脏糖代谢紊乱为肝脏糖异生途径紊乱。5.根据权利要求1所述应用，其特征在于所述代谢紊乱为肝脏能量代谢紊乱。

技术总结
本发明提供了一种甘草查尔酮类化合物甘草查尔酮A(Licochalcone A，LCA)在制备治疗代谢紊乱药物中的应用：本发明利用2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus，T2DM)模型小鼠，腹腔注射甘草查尔酮A后发现其能稳定降低2型糖尿病小鼠血糖及糖化血清蛋白(Glycosylated serum protein，GSP)水平，提高胰岛素敏感性，且无明显副作用。本发明还提供了甘草查尔酮A在糖代谢和能量代谢方面的相关研究和应用。在糖代谢和能量代谢方面的相关研究和应用。在糖代谢和能量代谢方面的相关研究和应用。


技术研发人员：刘颖 汪逗逗 杨林 丁文文 陈姿伊 杨晓雪 程宇镳
受保护的技术使用者：北京中医药大学
技术研发日：2023.06.28
技术公布日：2023/9/25