转录因子THRβ在介导禽类生殖轴启动中的应用

转录因子thr
β
在介导禽类生殖轴启动中的应用
技术领域
1.本发明属于分子生物学领域，具体涉及转录因子thrβ在介导禽类生殖轴启动中的应用。


背景技术：

2.我国鹅种资源丰富，养鹅生产已经成为农村经济发展和农民增收的重要途径，对于促进农业发展、乡村振兴具有重要的经济和社会意义。但由于南北方鹅种均具有顽固的季节性繁殖特性，南方鹅种是短日照繁殖型，北方鹅种是长日照繁殖型，繁殖季节不同步，难以实现良种培育。
3.季节性繁殖是鸟类在长期演化过程中适应自然环境，为实现后代生存最大化而采取的一种进化策略。生殖轴的季节性启动机制是季节性繁殖研究中最具挑战性的科学问题，一直是国内外研究者力图解决的热点。而在生产中，反季节生产是提高季节性繁殖动物繁殖性能的主要方法之一，因此，为从根本上提高动物品种的繁殖性能，从基因组选育技术的角度研发属于鹅业特有的精准育种技术，也是种业振业的发展方向之一。
4.目前，与季节性繁殖性状相关的遗传标记，如aflp、rapd、ssr、snp等标记报导尚不多见，转录因子thrβ的结合位点是遗传育种研究中表观遗传调控性状首选的遗传标记。若这些遗传标记能与生产性状相关联在一起，即可实现从dna水平上进行选择育种，提高了选择的准确性，为研发提高鹅繁殖产蛋性能，培育良种水禽提供新的路径。


技术实现要素：

5.本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种转录因子thrβ在介导禽类生殖轴启动中的应用。
6.本发明还提出了一种含有上述转录因子thrβ的基因的载体。
7.本发明还提出了一种含有上述载体的基因工程菌。
8.本发明还提出了一种含有上述载体的重组细胞。
9.本发明还提出了一种禽类生殖轴启动的标志物。
10.本发明还提出了一种检测禽类生殖轴启动的试剂盒。
11.本发明还提出了上述转录因子、载体、基因工程菌、重组细胞或试剂盒在禽类育种中的应用。
12.本发明还提出了一种调控禽类生殖轴启动的方法。
13.根据本发明的一个方面，提出了一种转录因子thrβ在介导禽类生殖轴启动中的应用，所述转录因子的氨基酸序列如seq id no:2所示。
14.在本发明的一些实施方式中，所述转录因子thrβ在调控gnrh基因表达中的应用。所述转录因子thrβ通过调控gnrh基因表达可以影响禽类生殖轴启动。
15.在本发明的一些实施方式中，所述转录因子的基因的核苷酸序列如seq id no:1所示。
16.在本发明的一些实施方式中，所述禽类为鹌鹑、鹅、鸡或鸭。
17.在本发明的第二方面，提出了一种载体，含有上述转录因子thrβ的基因。
18.在本发明的第三方面，提出了一种基因工程菌，含有上述载体。
19.在本发明的第四方面，提出了一种重组细胞，含有上述重组载体。
20.在本发明的第五方面，提出了一种禽类生殖轴启动的标志物，所述标志物选自以下(1)～(3)中的一种：
21.(1)：上述转录因子thrβ；
22.(2)：所述转录因子thrβ的基因；
23.(3)：(2)转录的rna。
24.在本发明的一些实施方式中，所述禽类为鹌鹑或鹅。
25.在本发明的第六方面，提出了一种检测禽类生殖轴启动的试剂盒，所述试剂盒包括用于检测上述标志物的试剂。
26.在本发明的一些实施方式中，所述试剂盒还包括用于检测t3含量的试剂。
27.在本发明的一些实施方式中，所述试剂盒还包括用于检测睾酮含量的试剂。
28.在本发明的一些实施方式中，所述试剂盒还包括用于检测睾丸雄烯二酮含量的试剂。
29.在本发明的第七方面，提出了上述转录因子、载体、基因工程菌、重组细胞或试剂盒在制备用于禽类育种的产品中的应用。
30.在本发明的一些实施方式中，所述禽类育种为调控禽类生殖轴启动。
31.在本发明的第八方面，提出了一种调控禽类生殖轴启动的方法，所述方法包括以下步骤：过表达或抑制表达上述的转录因子thrβ的基因。
32.在本发明的第九方面，提出了一种筛选介导禽类生殖轴启动的转录因子的方法，所述方法包括以下步骤：将不同生殖轴启动点的禽类下丘脑结节部组织样本，进行测序分析得到。
33.在本发明的一些实施方式中，所述不同生殖轴启动点为禽类在不同日照条件下，生殖轴启动激素变化明显的时间点。
34.在本发明的一些实施方式中，所述测序分析包括将测序得到的数据进行质控、比对后得到开放染色质区域；分别统计不同生殖轴启动点的基因上游、tss(转录起始点)、外显子、内含子、基因下游以及基因间区中开放区的分布比例，比较不同日照条件下，不同生殖轴启动点的禽类种间染色质开放区分布的异同；根据染色质开放状态在生殖轴启动过程中的动态变化，绘制生殖轴启动过程中染色质开放状态的动态图谱；采用motif分析染色质开放状态的动态图谱，比较不同日照条件下，禽类种间染色质开放区富集转录因子的异同，筛选得到介导禽类生殖轴启动的转录因子。
35.在本发明的一些实施方式中，所述基因上游为tss上游0～2kb的序列。
36.在本发明的一些实施方式中，所述基因下游为tss下游0～2kb的序列。
37.在本发明的一些实施方式中，还包括采用footprint足迹分析验证转录因子的结合的步骤。
38.在本发明的一些实施方式中，染色质开放状态在生殖轴启动过程中的动态变化使用htseq2软件统计种内各生殖轴启过程中各个阶段开放区测序项目reads的数目，使用
deseq2结合benjamini-hochberg检验(fdr《0.05，fold change≥2)。
39.在本发明的一些实施方式中，所述测序方法为染色质可及性测序。
40.根据本发明的一些实施方式，至少具有以下有益效果：本发明提供了转录因子thrβ在介导禽类生殖轴启动中的应用。经发明人研究发现，转录因子thrβ能够通过介导禽类生殖轴启动提高禽类繁殖产蛋性能，实现了从dna水平上进行禽类的选择育种，为培育良种水禽提供新的路径。
附图说明
41.下面结合附图和实施例对本发明做进一步的说明，其中：
42.图1为本发明实施例1中的thrβ结合的motif序列；
43.图2为本发明实施例2中的不同生殖轴启动时间点的公鹌鹑的睾丸重量检测结果图；
44.图3为本发明实施例2中的不同生殖轴启动时间点的公鹌鹑的曲细精管横截面积检测结果图；
45.图4为本发明实施例2中的不同生殖轴启动时间点的公鹌鹑的曲细精管的管壁厚度检测结果图；
46.图5为本发明实施例2中的不同生殖轴启动时间点的公鹌鹑的精子生成的变化的检测结果图；
47.图6为本发明实施例2中的下丘脑mbh区t3的浓度变化检测结果图，其中sd和ld分别表示实验的样品处于生殖轴失活状态和激活状态；从神经内分泌解度确认生殖轴成功启动；
48.图7为本发明实施例2中的血清中睾丸雄烯二酮的浓度变化检测结果图，其中sd和ld分别表示实验的样品处于生殖轴失活状态和激活状态；从神经内分泌解度确认生殖轴成功启动；
49.图8为本发明实施例2中的血清中睾丸的睾酮的浓度变化检测结果图，其中sd和ld分别表示实验的样品处于生殖轴失活状态和激活状态；从神经内分泌解度确认生殖轴成功启动；
50.图9为本发明实施例2中的通过aligent 2100分析文库的片段大小的分析结果图；
51.图10为本发明实施例2中的不同生殖轴启动时间点的公鹌鹑染色质开放区分布结果图；
52.图11为本发明实施例2中的在生殖轴启动过程中，不同时间点，鉴定出来差异的染色质开放区的数目结果图；
53.图12为本发明实施例2中的生殖轴启动过程中mbh区差异染色质开放区与转录组联合分析结果图；
54.图13为本发明实施例2中的生殖轴启动过程中mbh区差异染色质开放区与转录组联合分析结果图；
55.图14为本发明实施例2中的转录因子thrβ介导mbh区生殖轴的分析结果图；
56.图15为本发明实施例2中的转录因子thrβ介导mbh区生殖轴的分析结果图；
57.图16为本发明实施例2中的转录因子thrβ介导mbh区生殖轴的分析结果图；
58.图17为本发明实施例2中的thrβ在生殖轴启动过程中的特异性结合的分析结果图；
59.图18为本发明实施例2中的生殖轴激素过程的时间点sd28_ld7活跃转录因子mrna水平的变化和sd28_ld28的活跃转录因子mrna水平的变化比较结果图。
具体实施方式
60.以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。
61.实施例1一种介导生殖轴启动的转录因子
62.本实施例制备了一种介导生殖轴启动的转录因子thyroid hormone receptor beta(thrβ)，其cds序列如xm_015853981所示：
63.》:coturnix japonica thyroid hormone receptor beta(thrβ)
64.atgtcagggtatatacccagctacttagacaaggatgagctatgtgtagtatgtggggacaaagccactggatatcattatcgctgcatcacttgtgaaggttgcaagggatttttcagaagaaccattcagaaaaacctccatccaacctattcctgtaaatatgaaggaaaatgtgtgatagacaaagtaacaagaaatcagtgccaggaatgtcgcttcaaaaaatgtatctttgttggcatggcaacagatttggtgctggatgacagcaagcggctggcaaagaggaagctgatagaagaaaatcgagagaagaggcgtcgggaggagctgcagaaaacaattggtcacaagcctgaaccaacagatgaggaatgggagctgatcaaaattgtcactgaagcacatgtggccaccaatgcacaaggaagccactggaagcagaaaaggaaatttctgccagaagatattgggcaagcaccaatagtcaatgccccagaaggggggaaagtggatttagaagccttcagccagtttacaaaaattatcacaccagcgattacaagagtggtggattttgccaaaaagttgcctatgttttgtgagctgccatgtgaagaccagatcatccttctgaaaggctgctgtatggagataatgtccctccgagcagcagttcgctatgaccccgagagtgagactttaacgctaaatggggagatggccgtgacaaggggccagctgaaaaatgggggtctcggcgtagtgtctgatgccatttttgacctgggcatgtctctttcttcatttaacctggatgacaccgaggttgcccttctccaggctgttctgctcatgtcgtcagatcgcccgggccttgtttgcgtcgagaggatagaaaaatgtcaagagggtttcctcctggcatttgaacactacattaactacagaaaacaccatgttgcacatttttggccaaaactgctgatgaaagtgacagatctgcgaatgattggagcctgccatgccagccgcttcctgcacatgaaggtggagtgccccacagaactcttccctccgttgttcctggaggtgtttgaggactag(seq id no:1)。
65.蛋白质序列如下：
66.msgyipsyldkdelcvvcgdkatgyhyrcitcegckgffrrtiqknlhptysck
67.yegkcvidkvtrnqcqecrfkkcifvgmatdlvlddskrlakrklieenrekrrree
68.lqktighkpeptdeewelikivteahvatnaqgshwkqkrkflpedigqapivnapeg
69.gkvdleafsqftkiitpaitrvvdfakklpmfcelpcedqiillkgccmeimslraavry
70.dpesetltlngemavtrgqlkngglgvvsdaifdlgmslssfnlddtevallqavll
71.mssdrpglvcveriekcqegfllafehyinyrkhhvahfwpkllmkvtdlrmigach
72.asrflhmkvecptelfpplflevfed(seq id no:2)
73.thrβ结合的motif序列如图1所示。
74.实施例2一种筛选介导生殖轴启动的转录因子的方法
75.本实施例制备了一种筛选上述介导生殖轴启动的转录因子的方法，具体过程为：
76.1、以鹌鹑作为季节性繁殖型鸟类的研究模型，选取7周龄性成熟的公鹌鹑200只，预饲在短光照(6l：18d)的条件下四周，使鹌鹑性腺完全退化，随后将光照程序改成长光照(18l：6d)，诱导鹌鹑生殖轴的启动，对不同生殖轴启动时间点的公鹌鹑的睾丸重量、曲细精管横截面积以及曲细精管的管壁厚度，以及精子生成的变化进行检测。具体的检测方法如下：
77.将鹌鹑的左侧睾丸组织进行称重，收集实验的样本进行睾丸重量变化过程分析。制作组织切片并进行he染色的方法如下：
78.取材：睾丸在4％多聚甲醛固定液固定24小时后取出，用手术刀修整。把修切好的组织放进脱水盒，贴上样品标签。
79.(1)脱水浸蜡：将有样品的脱水盒依次放入脱水机内进行脱水，步骤如表1所示。
80.表1
[0081][0082]
(2)包埋：将浸蜡完成的组织放置于包埋机中进行包埋。
[0083]
(3)切片：修整好蜡块。放入冷却台进行冷却后置于石蜡切片机切片，厚度4μm，将切片放置于水中，控制温度为40℃将组织展平，用载玻片捞起，60℃烘箱烘片。烘干水分和烤化蜡后取出备用。
[0084]
(4)苏木素——伊红染色，脱水，透明，步骤如表2所示。
[0085]
表2
[0086][0087][0088]
(5)封片：使用中性树胶封片。
[0089]
(6)显微镜扫描镜检，拍摄图片通过软件进行分析。
[0090]
结果如图2-5所示，从图中可以看出，短光照(sd)的第28天，鹌鹑性腺基本退化，表现为睾丸质量极低、曲细精管横截面积变小、曲细精管的管壁厚度变小，精子基本无法正常形成，之后将光照程序改为长光照(ld)照射28天后鹌鹑性腺基本恢复正常，因此，本实施例得到生殖轴启动激素变化比较剧烈的四个时间点，短光照第28天(sd_d28)、长光照第7天(ld_d7)、长光照第14天(ld_d14)及长光照第28天(ld_d28)。
[0091]
2、生殖轴启动的验证
[0092]
通过人工光照，诱导实验动物从休产到开产(生殖轴启动)的过程，为了从神经内分泌角度更好的证明生殖轴已经成功启动，通过测定短光照状态下第28天(sd_d28)和长光照状态下(ld_d28)鹌鹑下丘脑局部的t3含量，及睾丸功能激素雄烯二酮和睾酮的浓度变化，测定生殖轴的成功启动。
[0093]
下丘脑局部的t3含量的检测结果如图6所示，从图中可以看出，与sd_d28的结果相比，鹌鹑ld_d28下丘脑局部t3的水平极显著升高(p≤0.01)，t3的生成是禽类生殖轴启动的标志性指标。
[0094]
血清中睾丸雄烯二酮的浓度变化的检测结果如图7所示，从图中可以看出，与sd_d28的结果相比，鹌鹑ld_d28循环血清中雄烯二酮的水平极显著升高(p≤0.01)，雄烯二酮的主要功能是作为睾酮合成途径的，促进睾丸的发育，表明睾丸的生理功能得到恢复，繁殖活动活跃。
[0095]
血清中睾丸睾酮的浓度变化的检测结果如图8所示，从图中可以看出，与sd_d28的结果相比，鹌鹑ld_d28循环血清中睾酮的水平极显著升高(p≤0.01)，睾酮也雄性禽类繁殖活力的重要指标，睾酮具有促进精子生成的作用，表明睾丸的内分泌功能得到恢复，繁殖活动活跃。
[0096]
综上，sd_d28鹌鹑处于生殖轴抑制状态，繁殖活动不活跃，下丘脑局部t3含量低下，睾丸内分泌功能下降，睾酮和雄烯二酮水平低下。通过长光照处理之后，生殖轴逐渐启动，ld_d28鹌鹑处于生殖轴启动状态，繁殖活动活跃，与sd_d28的数据相比，下丘脑局部t3的水平极显著升高(p≤0.01)；睾丸的功能恢复，睾酮和雄烯二酮水平极显著升高(p≤0.01)，促进公鹌鹑生精细胞的活动、精子生成活跃。
[0097]
3、将处于短光照第28天(sd_d28)、长光照第7天(ld_d7)、长光照第14天(ld_d14)及长光照第28天(ld_d28)这四个时间点的公鹌鹑进行解剖，得到下丘脑结节部组织(mbh区样品)，将其进行染色质可及性测序研究(bulk atacseq)，具体步骤如下：
[0098]
(一)下丘脑结节部组织中的细胞核的提取：
[0099]
(1)称取约30mg的冰冻组织块，置于1
×
uhb buffer中解冻5min；
[0100]
(2)用dounce匀浆器的a棒先上下匀浆10下，解离组织；将匀浆液经过70μm的细胞筛过滤后，将滤液重新吸回匀浆器，用b棒上下匀浆20下；
[0101]
(3)将匀浆液吸至2ml的圆底离心管中，500
×
g，4℃离心5min；
[0102]
(4)离心后吸掉上清，只留管壁上的小团块；
[0103]
(5)加入400μl的1
×
uhb，与提前配备好的50％的碘克沙醇混匀(浓度变成25％)；
[0104]
(6)缓慢的将30％的碘克沙醇液置于25％的碘克沙醇的下方；随后又将40％的碘克沙醇液置于30％的碘克沙醇的下方；
[0105]
(7)固定在50ml的离心管中(可自己制作，用纸巾和锡箔纸固定)，于3000
×
g，4℃离心20min；
[0106]
(8)可见核带(位于30％与40％的液面交界处)
[0107]
(9)吸取核带上方约200μl的液体(包括核带)；
[0108]
(10)计数，重悬细胞核备用。
[0109]
(二)建库实验步骤：
[0110]
(1)细胞核的收集：500
×
g，4℃离心5min收集上述重悬得到的细胞核，弃上清，pbs将细胞核再次进行重悬。
[0111]
(2)取含目标细胞核数目(3-5k细胞核)的悬液，500
×
g，4℃离心5min收集细胞核，弃上清。
[0112]
(3)弃尽上清，用50μl预冷的lysis buffer重悬细胞，冰上放置10min裂解细胞。
注：若样本体积在5μl以内，可直接加入裂解液裂解细胞。
[0113]
(4)在4℃下，500
×
g离心5min收集细胞核。注：为了防止样本丢失，可在离心时，在细胞聚集的管壁方向做好标记，吸取上清时，在沉淀对立面轻轻吸取液体。
[0114]
(5)弃上清，在下一步实验开始前置于冰上；
[0115]
(6)转座酶插入反应：根据诺唯赞td501的说明书，在pcr管中配制相应的反应体系，具体反应体系为：5
×
ttbl 10μl、tte mix v50 5μl、ddh2o补足50μl，用打断mix重悬步骤(4)收集得到的细胞核，并使用移液器轻轻吹打混匀，轻轻离心。于pcr仪中37℃反应30min。
[0116]
(三)磁珠纯化打断产物：
[0117]
(1)将vahts dna clean beads(购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司)从4℃取出，室温放置30min，使用前涡旋混匀，再用2
×
的磁珠纯化酶切产物将磁珠加入到上述反应体系中，用移液器吹打10次以上，使磁珠与体系充分混合均匀。注：磁珠比较粘稠，用移液枪确保取到足够的体积并缓慢打出。室温孵育5min。
[0118]
(2)将反应管短暂离心并置于磁力架上分离磁珠和液体。
[0119]
(3)保持pcr管在磁力架上，待溶液澄清(约5min)，小心弃去上清，注意不要扰动到磁珠。
[0120]
(4)保持pcr管在磁力架上，加入200μl新鲜配制的80％乙醇，注意加入乙醇时不要扰动磁珠，孵育30sec后小心移除上清。
[0121]
(5)重复步骤(4)，总共漂洗两次，轻轻离心，用白色小枪头吸干乙醇。
[0122]
(6)开盖干燥3-5min。注：不同地区环境干湿程度有差别，磁珠晾干时间不一，磁珠刚好晾干，表面无光泽即可。过度干燥会导致洗脱困难，未完全晾干会有酒精残留影响后续实验反应。
[0123]
(7)磁珠晾干后，将pcr管从磁力架上取出，加入26μl双蒸水到pcr管中覆盖磁珠，使用移液器吹打混匀磁珠。
[0124]
(8)室温孵育2min。如果磁珠干燥开裂，适当延长孵育时间。
[0125]
(9)将pcr管短暂离心收集置于磁力架中分离磁珠和液体，直到溶液澄清(约5min)。小心吸取24μl上清转移到新的ep管中。
[0126]
(10)pcr富集：体系如表1所示。
[0127]
体系中采用的p5序列如下：
[0128]5’
aatgatacggcgaccaccgagatctacac[tagatcgc]tcgtcggcagcgtc 3’(seq id no:3)；
[0129]
p7序列如下：
[0130]5’
caagcagaagacggcatacgagat[taaggcga]gtctcgtgggctcgg3’(seq id no:4)。
[0131]
表1pcr体系：
[0132][0133]
pcr反应条件：
[0134]
72℃3min；98℃30sec；98℃15sec，60℃30sec，72℃30sec，12-15cycles；72℃5min，4℃hold。
[0135]
(11)磁珠分选
[0136]
使用vahtstm dna clean beads对扩增产物进行长度分选，使用前请将磁珠平衡至室温并涡旋振荡充分混匀。初始pcr产物体积为50μl，因pcr过程中样品蒸发导致产物体积不足50μl。进行分选操作前必须使用灭菌蒸馏水将体积补齐至50μl，否则分选片段的长度可能与预期不一致。具体步骤如下：
[0137]
1)涡旋振荡混匀vahts dna clean beads并吸取27.5μl体积至50μl pcr产物中，涡旋振荡或使用移液器吹打10次充分混匀，室温孵育5min。
[0138]
2)将反应管短暂离心并置于磁力架上，使磁珠与液体分离，待溶液澄清后(约5min)小心转移上清至新的灭菌pcr管中，丢弃磁珠。
[0139]
3)涡旋振荡混匀vahts dna clean beads并吸取50μl体积至上清中，涡旋振荡或使用移液器吹打10次充分混匀，室温孵育5min。
[0140]
4)将反应管短暂离心并置于磁力架上，使磁珠与液体分离，待溶液澄清后(约5min)小心移除上清。
[0141]
5)保持反应管始终处于磁力架上，加入200μl新鲜配制的80％乙醇漂洗磁珠。室温孵育30sec，小心移除上清。
[0142]
6)重复步骤5)，总计漂洗两次。
[0143]
7)保持反应管始终处于磁力架上，开盖空气干燥磁珠约5min。
[0144]
8)将反应管从磁力架上取出，加入22μl灭菌超纯水洗脱。涡旋振荡或使用移液器吹打10次充分混匀，室温孵育5min。
[0145]
9)将反应管短暂离心并置于磁力架上，使磁珠与液体分离，待溶液澄清后(约5min)小心吸取20μl上清至新的灭菌pcr管中，-20℃保存。
[0146]
(四)文库质控:
[0147]
通过aligent 2100分析文库的片段大小(以其中1个文库为例)，分析结果如图9所示。
[0148]
(五)数据分析：
[0149]
将上述制备得到的4个时间点的公鹌鹑的下丘脑结节部组织(mbh区样品)测序文
库进行测序后，测序数据经trimmomatic软件质控后，使用bowtie软件分别比对到鹌鹑基因组；后续使用homer软件，以150bp为最小距离对比对到核基因组上的测序数据进行peak calling，获得开放染色质区域。分别统计生殖轴启动过程中基因上游(≤2kb from tss)、tss、外显子、内含子、基因下游(≤2kb from tts)以及基因间区中开放区的分布比例，比较生殖轴启动过程中及长、短日照繁殖型类型鹌鹑种间染色质开放区分布的异同。染色质开放状态在生殖轴启动过程中的动态变化：使用htseq2软件统计种内各生殖轴启过程中各个阶段开放区测序项目reads的数目，使用deseq2结合benjamini-hochberg检验(fdr《0.05，fold change≥2)，绘制生殖轴启动过程中染色质开放状态的动态图谱；进一步，随后进行motif分析，比较长、短日照繁殖型鹌鹑种间染色质开放区富集转录因子的的异同，footprint足迹分析验证转录因子的结合。
[0150]
检测结果如图10-16所示，从图10中可以看出，不同时间点的染色质开放区分布在启动子(3kb)与转录起始点之间的比例大约为22％～24％，随着生殖轴的启动，这些开放区峰处于启动子(3kb)与转录起始点之间的比例逐渐降低，暗示了调控情况的改变，活跃的染色质区域偏向富集在内含子和基因间区；预示着生殖启动的过程可能受到增强子的调控，从图11-13中可以看出，生殖轴启动过程中，差异染色质与开放区及转录组测序的联合分析，共有7个共同的差异基因，参与节律调控、甲状腺素代谢和转运、神经元投射等，7个基因中，dio2、slc16a2与thrβ都是甲状腺素合成通路的基因。dio2是脱碘酶2，可以把t4转化成为t3；slc16a2是t3运输的转运体，而thrβ是t3的受体；该结果说明了甲状腺素合成通路的关键基因在生殖轴启动过程中，染色质开放状态发生改变，并且基因表达水平也发生显著变化。dio2和slc16a2是位于甲状腺素合成通路的上游，而thrb是位于甲状腺素合成通路的下游，影响靶基因的表达。从图14-16中可以看出，生殖轴由关闭到启动的动态的过程中，thrβ是最显著的转录因子。
[0151]
继续对测序数据进行超级增强子分析，结果如图17和18所示，从图中可以看出，在生殖轴启动过程中，有5个区间存在差异，参与轴突向导通路的关键基因(ephrin和信号素)均受到超级增强子的驱动作用，这些基因均检测到thrβ的结合位点。通过footprint足迹分析证明了在生殖轴启动过程中，thrβ非常显著地结合在了其特异的motif序列上，从全基因组范围中生殖轴启动过程中thrβ并无时间序列上的特异性。随后，通过分析thrβ的表达量，在生殖轴启动的过程中轻微上调，表明thrβ在基因组的占位率(genomic occupancy)发生变化，在季节性启动的过程对性状的调控不是体现在表达水平的变化，而是通过影响染色质的结构，从而调控基因的表达。
[0152]
4、转录因子thrβ介导其生殖轴启动验证
[0153]
本发明还对转录因子thrβ进行了sirna干扰实验验证，实验步骤如下：
[0154]
(1)下丘脑细胞分离与培养
[0155]
取11天的鹌鹑胚，75％的酒精擦洗消毒，打破种蛋气室，夹出鹌鹑胚，颈部断头后，取出下丘脑组织，放进含1％青/链酶素双抗的pbs中；用pbs清洗3-5次，直到液体澄清无血色；将组织置于1.5ml离心管剪碎并研磨；随后加入10倍体积0.25％胰酶，37℃消化5min；按1：1加入同体积基础培养基终止消化；吹打混匀，70目细胞筛过滤，收集滤液；置于离心机中，4℃，1500rpm，离心10min；弃掉上清，加入基础培养基吹打混匀重悬细胞；用移液枪吸取10μl加入细胞计数板中计数，并将细胞悬液调至密度为4
×
105；将细胞接种到12孔板，于37
℃、5％co2浓度的培养箱中培养48h待其贴壁生长；48h后吸出培养液，用pbs缓冲液清洗每孔细胞并换液，换液后用神经基础培养基培养；待下丘脑细胞生长铺满培养孔的70％以上开始处理细胞，细胞生长一般要5-7天，期间隔天换一次液。
[0156]
(2)thrβ干扰对下丘脑细胞gnrh表达的影响
[0157]
分离鹌鹑胚下丘脑细胞进行原代培养，待细胞汇合度达70％(培养144h后)，对其进行thrβ干扰试验，设thrβ干扰组(简称si组)每孔转染100nm的thrβ-sirna，对照组(简称nc组)每孔转染100nm的nc-sirna，每组设5个重复，处理48h后，收集细胞上清和细胞，细胞上清用于促性腺激素gnrh分泌水平，细胞提取rna用于检测gnrh基因表达水平的变化(n＝5)。
[0158]
过表达实验验证的结果表明，本发明将转录因子thrβ进行sirna干扰，可以有效影响gnrh的分泌和表达，影响生殖轴的启动。
[0159]
上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

技术特征：
1.转录因子thrβ在介导禽类生殖轴启动中的应用，其特征在于，所述转录因子的氨基酸序列如seq id no:2所示。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述转录因子的基因的核苷酸序列如seq id no:1所示。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述禽类为鹌鹑、鹅、鸡或鸭。4.转录因子thrβ在调控gnrh基因表达中的应用。5.一种禽类生殖轴启动的标志物，其特征在于，所述标志物选自以下(1)～(3)中的一种：(1)：转录因子thrβ；(2)：所述转录因子thrβ的基因；(3)：(2)转录的rna。6.一种检测禽类生殖轴启动的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括用于检测权利要求5所述的标志物的试剂。7.权利要求5所述的标志物或权利要求6所述的试剂盒在制备用于禽类育种的产品中的应用。8.一种调控禽类生殖轴启动的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：过表达或抑制表达权利要求1中所述的转录因子thrβ的基因。9.一种筛选介导禽类生殖轴启动的转录因子的方法，其特征在于，将不同生殖轴启动点的禽类下丘脑结节部组织样本，进行测序分析得到。10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述测序分析包括将测序得到的数据进行质控、比对后得到开放染色质区域；分别统计不同生殖轴启动点的基因上游、tss、外显子、内含子、基因下游以及基因间区中开放区的分布比例，比较不同日照条件下，不同生殖轴启动点的禽类种间染色质开放区分布的异同；根据染色质开放状态在生殖轴启动过程中的动态变化，绘制生殖轴启动过程中染色质开放状态的动态图谱；采用motif分析染色质开放状态的动态图谱，比较不同日照条件下，禽类种间染色质开放区富集转录因子的异同，筛选得到介导禽类生殖轴启动的转录因子。

技术总结
本发明公开了转录因子THRβ在介导禽类生殖轴启动中的应用，所述转录因子的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，本发明的转录因子THRβ能够通过介导禽类生殖轴启动提高禽类繁殖产蛋性能，实现了从DNA水平上进行禽类的选择育种，为培育良种水禽提供新的路径。为培育良种水禽提供新的路径。


技术研发人员：沈栩 常建业 黄运茂 欧阳宏佳 潘建秋 江丹莉 刘文俊 徐杨龙 傅玉婷
受保护的技术使用者：仲恺农业工程学院
技术研发日：2023.06.28
技术公布日：2023/9/25