一种植物乳杆菌发酵豆浆及其制备方法和应用

1.本发明涉及微生物技术领域，特别涉及一种植物乳杆菌发酵豆浆及其制备方法和应用。


背景技术：

2.在生命延续过程中，人体内会持续生成自由基等，而当自由基数量累积到超出人体正常范围时，机体内的dna、蛋白质和脂质会受到自由基干扰而发生氧化损伤，从而导致机体发生各种不良反应，还会导致各种疾病的发生，危害人体健康。因此随着社会的发展，人们健康意识的提高，抗氧化食品也越来越受到大众的青睐。
3.发酵性豆制品是通过一系列微生物对大豆内所含物质进行分解，然后通过发酵作用而制得的豆制类成品。微生物可以将大豆中的不溶性大分子物质转变为可溶性小分子物质，促进肠道对豆制品的消化吸收；同时，转变过程中伴随产生的抗营养因子能消除大豆天然固有且令多数人难以接受的豆腥味，改善豆制品的风味，得到更多消费者的认可和喜爱。此外，微生物还能发生自溶，与大豆中原有的一些物质发生反应，转化成新的营养成分，提高豆制品的营养价值。有研究发现，发酵豆制品的抗氧化活性显著高于非发酵豆制品的抗氧化活性；虽然乳酸菌和霉菌发酵都能够明显提高豆浆的抗氧化活性，但提高的程度存在较大差异。因此，亟需寻找可以有效提高发酵豆制品抗氧化活性的微生物及制备方法。


技术实现要素：

4.有鉴于此，本发明目的在于提供一种植物乳杆菌发酵豆浆及其制备方法和应用，本发明提供的植物乳杆菌发酵豆浆的制备方法制备所得的发酵豆浆含有丰富的大豆苷元和染料木素，具有良好的抗氧化效果。
5.为了实现上述目的，本发明提供以下技术方案：
6.一种植物乳杆菌发酵豆浆的制备方法，包括以下步骤：将植物乳杆菌kfy02作为发酵菌剂接种于豆浆中进行发酵，得到发酵豆浆。
7.优选地，所述植物乳杆菌kfy02的命名为：lactobacillus plantarum kfy02，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.15638，保存日期为：2018年4月23日。
8.优选地，所述植物乳杆菌kfy02的接种量为1.8
×
109cfu/ml～2.3
×
109cfu/ml。
9.优选地，所述发酵为30℃～40℃发酵9h～12h。
10.优选地，所述豆浆为先以(0.8～1.2)：(1.8～2.3)的比例将大豆浸泡10h～15h，然后按照(0.8～1.2)：(7.8～8.3)的豆水比放入豆浆机打磨，过滤、灭菌、冷却后即得豆浆。
11.本发明还提供一种上述技术方案中所述的植物乳杆菌发酵豆浆的制备方法制备所得的植物乳杆菌发酵豆浆。
12.优选地，所述植物乳杆菌发酵豆浆中大豆苷元的含量≥0.012μg/μl，染料木素的含量≥0.014μg/μl。
13.优选地，所述植物乳杆菌发酵豆浆的dpph自由基清除率≥31％，abts
+
自由基清除率≥42％。
14.本发明还提供一种上述技术方案所述植物乳杆菌发酵豆浆在制备抗氧化食品中的应用。
15.本发明还提供一种上述技术方案所述植物乳杆菌发酵豆浆在制备大豆异黄酮类食品中的应用。
16.有益技术效果：本发明提供了植物乳杆菌发酵豆浆的制备方法，包括以下步骤：将植物乳杆菌kfy02作为发酵菌剂接种于豆浆中进行发酵，得到发酵豆浆。本发明通过植物乳杆菌kfy02发酵豆浆，可将豆浆中原有的大豆苷和染料木苷转换为大豆苷元和染料木素，有效提高了发酵豆浆的抗氧化效果。最终所得的发酵豆浆中大豆苷元的含量最高可达0.212μg/μl，染料木素的含量≥0.251μg/μl，dpph自由基清除率最高可达82.43％，abts
+
自由基清除率最高可达61.77％。
附图说明
17.图1为相同发酵温度、不同发酵时间所得发酵豆浆的dpph自由基清除率；
18.图2为相同发酵时间、不同发酵温度所得发酵豆浆的dpph自由基清除率；
19.图3为相同发酵温度、不同发酵时间所得发酵豆浆的abst
+
自由基清除率；
20.图4为相同发酵时间、不同发酵温度所得发酵豆浆的abst
+
自由基清除率；
21.图5为大豆异黄酮标准品的出峰图；
22.图6为相同发酵时间、不同发酵温度所得发酵豆浆中大豆苷的含量；
23.图7为相同发酵温度、不同发酵时间所得发酵豆浆中大豆苷的含量；
24.图8为相同发酵时间、不同发酵温度所得发酵豆浆中染料木苷的含量；
25.图9为相同发酵温度、不同发酵时间所得发酵豆浆中染料木苷的含量；
26.图10为相同发酵时间、不同发酵温度所得发酵豆浆中大豆苷元的含量；
27.图11为相同发酵温度、不同发酵时间所得发酵豆浆中大豆苷元的含量；
28.图12为相同发酵时间、不同发酵温度所得发酵豆浆中染料木素的含量；
29.图13为相同发酵温度、不同发酵时间所得发酵豆浆中染料木素的含量。
具体实施方式
30.本发明提供了一种植物乳杆菌发酵豆浆的制备方法，包括以下步骤：将植物乳杆菌kfy02作为发酵菌剂接种于豆浆中进行发酵，得到发酵豆浆。
31.在本发明中，所述植物乳杆菌kfy02的命名为：lactobacillus plantarum kfy02，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.15638，保存日期为：2018年4月23日；分类命名：植物乳杆菌lactobacillus plantarum；保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。本发明所述植物乳杆菌kfy02分离自新疆自然发酵酸乳中。
32.在本发明中，所述植物乳杆菌kfy02的接种量优选为1.8
×
109cfu/ml～2.3
×
109cfu/ml，更优选为2.0
×
109cfu/ml。。
33.在本发明中，所述发酵优选为30℃～40℃发酵9h～12h，更优选为30℃发酵9h、30
℃发酵12h、40℃发酵12h。其中，40℃发酵12h所得的发酵豆浆中大豆苷元和染料木素的含量最多；30℃发酵9h所得的发酵豆浆的dpph自由基清除率最高；30℃发酵12h所得的发酵豆浆的abts
+
自由基清除率最高。
34.在本发明中，所述豆浆优选为先以(0.8～1.2)：(1.8～2.3)的比例将大豆浸泡10h～15h，然后按照(0.8～1.2)：(7.8～8.3)的豆水比放入豆浆机打磨，过滤、灭菌、冷却后即得豆浆；所述豆浆更优选为先以1：2的比例将大豆浸泡12h，然后按照1：8的豆水比放入豆浆机打磨，过滤、灭菌、冷却后即得豆浆。所述灭菌优选为121℃下灭菌15min。
35.本发明还提供一种上述技术方案中所述的植物乳杆菌发酵豆浆的制备方法制备所得的植物乳杆菌发酵豆浆。
36.在本发明中，所述植物乳杆菌发酵豆浆中大豆苷元的含量≥0.012μg/μl，染料木素的含量≥0.014μg/μl；所述植物乳杆菌发酵豆浆中大豆苷元的含量最高可达0.212μg/μl，染料木素的含量≥0.251μg/μl。本发明通过植物乳杆菌kfy02可以将豆浆中的大豆苷及染料木苷分别转换为大豆苷元及染料木素，提高大豆苷元及染料木素的含量，进而提高豆浆抗氧化活性。
37.在本发明中，所述植物乳杆菌发酵豆浆的dpph自由基清除率≥31％，abts
+
自由基清除率≥42％；所述植物乳杆菌发酵豆浆的dpph自由基清除率可达82.43％，abts
+
自由基清除率可达61.77％。本发明通过植物乳杆菌kfy02发酵豆浆，可以显著提高豆浆对的dpph自由基和abts
+
自由基的清除率。
38.本发明还提供一种上述技术方案所述植物乳杆菌发酵豆浆在制备抗氧化食品中的应用。
39.在本发明中，对所述食品的类型没有特殊限定，采用植物乳杆菌发酵豆浆在食品中可接受的类型即可。本发明对所述食品的制备方法没有特殊限定，采用相应类型的制备方法即可。本发明对所述食品中植物乳杆菌发酵豆浆的含量没有特殊限定，采用食品中常规的成分含量即可。
40.本发明还提供一种上述技术方案所述植物乳杆菌发酵豆浆在制备大豆异黄酮类食品中的应用。
41.在本发明中，所述食品的类型、制备方法和成分含量与上述相同，在此不再赘述。
42.为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。本发明实施例及试验例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得；本发明实施例及试验例中所用的方法，如无特殊说明，均为常规方法。
43.实施例1
44.1.材料与方法
45.1.1材料与试剂
46.本实施例所用大豆为重庆市市售大豆，植物乳杆菌kfy02、大豆异黄酮标品(大豆苷、黄豆黄苷、染料木苷、大豆苷元、黄豆黄素、染料木素)及各种试剂均由重庆第二师范学院协同创新中心益生菌功能研究实验室提供。各试剂信息如表1所示。
47.表1试剂信息表
[0048][0049]
试验中所用水全部为超纯水，盐酸、乙醇、氢氧化钠、冰醋酸、三氯化铝均为分析纯。
[0050]
1.2主要仪器与设备
[0051]
本实施例所用主要仪器与设备如表2所示。
[0052]
表2主要仪器与设备
[0053][0054][0055]
1.3方法
[0056]
大豆异黄酮在常温下性质稳定，一般易溶于醇、酯、酮等极性溶剂中，难溶于非极性有机溶剂。所以本实施例在发酵豆浆有效成分的提取和样品配制时均采用乙醇及甲醇等极性有机溶剂。
[0057]
1.3.1菌种制备
[0058]
按2％的接种量将kfy02菌种接入mrs液体培养基中，37℃培养12h，进行菌种活化，共活化两代，然后取活化两代的含菌培养基，4000r/min离心10min，弃去上层培养基，加入同体积0.9％生理盐水重新制成菌悬液备用。
[0059]
1.3.2豆浆发酵
[0060]
以1：2的比例将大豆浸泡12h，然后按照1：8的豆水比放入豆浆机打磨后用纱布过滤，将过滤好的豆浆分装好后放在121℃下灭菌15min，最后待豆浆冷却后取5ml豆浆于离心管中按2％的接种量接入kfy02菌种(菌悬液)，分别于25℃、30℃、35℃、40℃下发酵0h、3h、6h、9h、12h，得到待测样品。
[0061]
1.3.3发酵豆浆有效成分的提取
[0062]
将上述不同温度、不同发酵时间的发酵豆浆分别放置在-80℃温度下预冻，预冻结束后，用冻干机进行冻干处理，向各个发酵豆浆冻干物中分别加入5ml 80％(v/v)乙醇提取有效成分，室温、超声功率为100w下超声萃取6h，获得超声萃取的提取液，在4℃、10000rpm离心min后取上清液。将上清液于冻干机中二次冻干，-80℃冰箱保存。
[0063]
1.3.4发酵豆浆溶液配制
[0064]
分别称取0.0100g左右上述不同温度、不同发酵时间的发酵豆浆提取物，加入5ml 70％(v/v)甲醇溶液，溶解，配制为2mg/ml的发酵豆浆溶液，低温保存待用。
[0065]
1.3.5dpph自由基清除实验
[0066]
以无水乙醇为溶剂，配制浓度为0.2mmol/l的dpph自由基乙醇溶液；配制0.5mg/ml的vc溶液(作为对照样品)。
[0067]
待测样品：分别取1ml配制好的2mg/ml的上述发酵豆浆溶液及vc溶液，分别加入1ml 0.2mmol/l的dpph自由基乙醇溶液，混合均匀；空白校正：分别1ml配制好的2mg/ml各样品溶液及vc溶液，加入1ml无水乙醇，混合均匀；空白对照：取1ml dpph工作液与1ml无水乙醇混合。室温下将其置于避光处，静待30min。在517nm处测定溶液的吸光度。每组两个平行，计算平均值。
[0068]
清除率计算公式：
[0069]
dpph自由基清除率％＝[1-(a
2-a1)/a0]
×
100％
[0070]
式中：
[0071]
a2：待测样品：dpph工作液+发酵豆浆样液od值；
[0072]
a1：空白校正：发酵豆浆+无水乙醇乙醇od值；
[0073]
a0：空白对照：dpph工作液+乙醇od值。
[0074]
1.3.6abts
+
自由基清除实验
[0075]
abts
+
自由基工作液配制：a液：在2.4ml蒸馏水中加入9mg abts，混合、溶解；b液：称取5mg的过硫酸钾加入7.5ml蒸馏水中，混合、溶解；将a、b两液按1:1混合后，黑暗放置氧化12h，使其形成稳定的自由基离子。取4ml稀释30倍，得到abts
+
自由基工作液，待用。
[0076]
取5ml离心管，在离心管中加入4ml工作液，再加入0.2ml配制好的0.2mg/ml发酵豆浆提取液，充分混合后，避光反应30min，每个样品取2ml于96孔板中，置于734nm处测定od值。每个样品三个平行，取平均值。
[0077]
清除率计算公式：
[0078]
abts
+
自由基清除率％＝[1-(a
2-a1)/a0]
×
100％
[0079]
式中：
[0080]
a2：abts
+
工作液+发酵豆浆样液od值；
[0081]
a1：空白校正：发酵豆浆样液+无水乙醇od值；
[0082]
a0：空白对照：abts
+
工作液+无水乙醇od值。
[0083]
1.3.7大豆异黄酮的测定
[0084]
大豆异黄酮中主要起抗氧化作用的是大豆苷元和染料木素，它们对应的糖苷配体分别是大豆苷和染料木苷，通过测定发酵过程中，这4种大豆异黄酮含量的变化来分析发酵豆浆抗氧化能力的变化。
[0085]
将6种大豆异黄酮(大豆苷、黄豆黄苷、染料木苷、大豆苷元、黄豆黄素、染料木素)标准品用色谱级甲醇配制成浓度为10μg/ml、20μg/ml、50μg/ml、80μg/ml、100μg/ml的标准液，用高效液相色谱仪分别测出这6种大豆异黄酮的色谱图。配制40μg/ml的6种标准品混合溶液，以1μg/ml、3μg/ml、18μg/ml、36μg/ml、40μg/ml的浓度梯度进样量测定色谱图。以峰面积为横坐标、样品含量为纵坐标，绘制标准曲线并计算得到回归方程。
[0086]
将1.3.4中配置的发酵豆浆提取物溶液作为试验品，分析样品中大豆异黄酮含量的变化；将6种标准品(大豆苷、染料木苷、大豆苷元、染料木素)配置成浓度为20μg/ml的混合液与浓度为20μg/ml的各样品以1：7的比例进行混合，测出加标样品谱图，计算加标回收率。
[0087]
试验采用赛默飞u3000高效液相色谱仪，搭配2998pda检测器，色谱柱：thermo scientific accucore c
18
(4.6mm*150mm，2.6μm)；流动相：a为0.5％冰醋酸水溶液，b为乙腈；流速为0.5ml/min；柱温为30℃；进样量为10μl；检测波长为260nm。
[0088]
液相中所有试剂均需用0.22μm滤膜过滤，以避免对仪器造成损伤。
[0089]
梯度洗脱条件如表3所示。
[0090]
表3梯度洗脱条件
[0091][0092][0093]
1.4统计分析
[0094]
本发明中所有试验至少重复3次，方差分析及差异显著性分析(p《0.05)釆用spss20.0统计分析软件进行分析，图表采用excel进行绘制。
[0095]
2结果
[0096]
2.1dpph自由基清除试验
[0097]
由于样品浓度不一，为便于比较，在计算清除率后以清除率除以样品浓度获得单位清除率。
[0098]
相同发酵温度、不同发酵时间所得发酵豆浆的dpph自由基清除率如图1所示。相同发酵时间、不同发酵温度所得发酵豆浆的dpph自由基清除率如图2所示。由图1和图2可以看出，在发酵温度为25℃、30℃、40℃时，均以发酵时间为9h时dpph自由基清除率最高；在35℃时，以发酵时间为6h时的dpph自由基清除率最高。同时，发酵豆浆在30℃下发酵9h时，dpph自由基清除率最高，可达82.43％，高于vc的清除率，清除效果最好。
[0099]
2.2abst
+
自由基清除试验
[0100]
相同发酵温度、不同发酵时间所得发酵豆浆的abst
+
自由基清除率如图3所示，相同发酵时间、不同发酵温度所得发酵豆浆的abst
+
自由基清除率如图4所示。由图3～图4可以看出，在30℃发酵12h时得到的发酵豆浆对abts
+
自由基的清除率最高，可达61.77％。
[0101]
2.3大豆异黄酮含量分析
[0102]
2.3.1大豆异黄酮各标准品标准曲线
[0103]
采用高效液相色谱法测定了6种大豆异黄酮标准品，标准品的出峰图如图5所示。
[0104]
以峰面积为横坐标、样品含量为纵坐标，得到6种标准品的标准曲线方程，如表4所示。
[0105]
表4 6种标准品标准曲线方程
[0106][0107][0108]
2.3.2发酵豆浆中大豆异黄酮含量
[0109]
将发酵豆浆提取物进行高效液相色谱分析，得到各样品色谱图，将各样品测得的峰值代入表4中所示方程，计算得到样品中6种大豆异黄酮含量，由于样品配制浓度不一，用所得大豆异黄酮含量除以各发酵豆浆样品浓度得到单位样品含量μg/μl，如表5所示。
[0110]
表5发酵豆浆中大豆异黄酮含量
[0111][0112][0113]
由表5可以看出，各样品中黄豆黄素与黄豆黄苷的含量很少，主要存在的大豆苷、染料木苷、大豆苷元、染料木素四种大豆异黄酮。
[0114]
相同发酵时间、不同发酵温度所得发酵豆浆中大豆苷的含量如图6所示。由图6可以看出，在相同发酵时间下，发酵温度越高所得发酵豆浆中大豆苷的含量越低；相同发酵温
度、不同发酵时间所得发酵豆浆中大豆苷的含量如图7所示。由图7可以看出，在相同发酵温度下，发酵时间越长所得发酵豆浆中大豆苷含量越低，整体呈下降趋势。
[0115]
相同发酵时间、不同发酵温度所得发酵豆浆中染料木苷的含量如图8所示。由图8可以看出，在相同发酵时间下，发酵温度越高所得发酵豆浆中染料木苷的含量越低；相同发酵温度、不同发酵时间所得发酵豆浆中染料木苷的含量如图9所示。由图9可以看出，在相同发酵温度下，发酵时间越长所得发酵豆浆中染料木苷含量越低，整体呈下降趋势。
[0116]
相同发酵时间、不同发酵温度所得发酵豆浆中大豆苷元的含量如图10所示。由图10可以看出，在相同发酵时间下，发酵温度越高所得发酵豆浆中大豆苷元的含量越高；相同发酵温度、不同发酵时间所得发酵豆浆中大豆苷元的含量如图11所示。由图11可以看出，在相同发酵温度下，发酵时间越长所得发酵豆浆中大豆苷元含量越高，整体呈上升趋势。
[0117]
相同发酵时间、不同发酵温度所得发酵豆浆中染料木素的含量如图12所示。由图12可以看出，在相同发酵时间下，发酵温度越高所得发酵豆浆中染料木素的含量越高；相同发酵温度、不同发酵时间所得发酵豆浆中染料木素的含量如图13所示。由图13可以看出，在相同发酵温度下，发酵时间越长所得发酵豆浆中染料木素含量越高，整体呈上升趋势。
[0118]
综上，植物乳杆菌kfy02能将豆浆中的大豆苷及染料木苷转换为对应的大豆苷元及染料木素，使大豆苷元及染料木素的含量提高，以提高豆浆抗氧化活性。在不同条件下发酵效果也有所不同，其中，40℃下发酵12h的样品大豆苷元及染料木素含量最高，效果最好；未经发酵的豆浆样品大豆苷元及染料木素含量较低。
[0119]
2.3.3样品加标回收率
[0120]
以7：1的比例向发酵豆浆样品中加入20μg/ml的4种主要大豆异黄酮(大豆苷、染料木苷、大豆苷元、染料木素)标准品混合液，通过液相分析得到加标样品峰面积，计算得出各样品加标回收率，如表6所示。
[0121]
表6各样品加标回收率
[0122][0123][0124]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

技术特征：
1.一种植物乳杆菌发酵豆浆的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将植物乳杆菌kfy02作为发酵菌剂接种于豆浆中进行发酵，得到发酵豆浆。2.根据权利要求1所述的植物乳杆菌发酵豆浆的制备方法，其特征在于，所述植物乳杆菌kfy02的命名为：lactobacillus plantarum kfy02，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.15638，保存日期为：2018年4月23日。3.根据权利要求1所述的植物乳杆菌发酵豆浆的制备方法，其特征在于，所述植物乳杆菌kfy02的接种量为1.8
×
109cfu/ml～2.3
×
109cfu/ml。4.根据权利要求1所述的植物乳杆菌发酵豆浆的制备方法，其特征在于，所述发酵为30℃～40℃发酵9h～12h。5.根据权利要求1所述的植物乳杆菌发酵豆浆的制备方法，其特征在于，所述豆浆为先以(0.8～1.2)：(1.8～2.3)的比例将大豆浸泡10h～15h，然后按照(0.8～1.2)：(7.8～8.3)的豆水比放入豆浆机打磨，过滤、灭菌、冷却后即得豆浆。6.一种权利要求1～5任一所述的植物乳杆菌发酵豆浆的制备方法制备所得的植物乳杆菌发酵豆浆。7.根据权利要求6所述的植物乳杆菌发酵豆浆，其特征在于，所述植物乳杆菌发酵豆浆中大豆苷元的含量≥0.012μg/μl，染料木素的含量≥0.014μg/μl。8.根据权利要求6所述的植物乳杆菌发酵豆浆，其特征在于，所述植物乳杆菌发酵豆浆的dpph自由基清除率≥31％，abts
+
自由基清除率≥42％。9.一种权利要求6～8任一所述植物乳杆菌发酵豆浆在制备抗氧化食品中的应用。10.一种权利要求6～8任一所述植物乳杆菌发酵豆浆在制备大豆异黄酮类食品中的应用。

技术总结
本发明提供了一种植物乳杆菌发酵豆浆及其制备方法和应用，属于微生物技术领域。本发明提供的植物乳杆菌发酵豆浆的制备方法，包括以下步骤：将植物乳杆菌KFY02作为发酵菌剂接种于豆浆中进行发酵，得到发酵豆浆。本发明通过植物乳杆菌KFY02发酵豆浆，可将豆浆中原有的大豆苷和染料木苷转换为大豆苷元和染料木素，有效提高了发酵豆浆的抗氧化效果。最终所得的发酵豆浆中大豆苷元的含量最高可达0.212μg/μL，染料木素的含量≥0.251μg/μL，DPPH自由基清除率最高可达82.43％，ABTS


技术研发人员：张妤涵 王梦薇 赵欣
受保护的技术使用者：重庆第二师范学院
技术研发日：2023.07.04
技术公布日：2023/9/25