五种果蔬的组合物在制备改善肠道菌群失调食品或药品中的应用的制作方法

1.本发明涉及肠道菌群调节技术领域，具体涉及一种五种果蔬的组合物在制备改善肠道菌群失调食品或药品中的应用。


背景技术：

2.肠道是消化道的一部分，与人体的整体健康关系密切。肠道是食物消化器官，更是营养吸收最重要、最关键的器官，人体所需的各种营养物质中有99％是从肠道吸收进入的。同时，肠道又是人体排泄废物和毒素最重要、最关键的一个器官，人体的废物和毒素，80％是从肠道排出的。此外，肠道是抵御毒素及有害物质的第一道防线，是人体最大的免疫器官。虽然肠道健康至关重要，但是现代人的肠道健康经常出现问题，如腹泻、便秘、肠易激、炎症性肠道疾病等，且绝大部分患者会采用药物治疗。
3.治疗肠道疾病的药物有很多种。如部分人群可能由于细菌、病毒等病原菌感染，引起肠炎，同时存在腹泻症状，此时可以使用氧氟沙星、阿昔洛韦等抗生素药物进行治疗；部分人群由于肠道平滑肌痉挛引起肠易激综合征，或伴随腹泻症状，通常可以补充部分益生菌如双歧杆菌乳杆菌三联活菌片，或使用颠茄等解痉药物，以缓解症状；腹泻则是非常常见的一种肠道疾病，可以选择碱式碳酸铋、黄连素、补充胰酶片等进行治疗等，以缓解腹泻症状。对于上述肠道类疾病，用药一段时间后，患者的症状大部分均能得到明显改善。
4.但是，患者症状得到明显改善并不意味着患者的肠道亦恢复健康状态。这是由于人体的肠道中存在着数目庞大的微生物菌群，这些菌群相互作用，构成了复杂而相对稳定的微生态系统，参与人体免疫调节、生物拮抗、抑制肿瘤、脂质代谢和营养吸收等众多过程，对维持胃肠道稳态至关重要。健康情况下，肠道菌群在肠胃中形成一个平衡稳定的微生态系统，维持身体健康。而一旦平衡被打破，会造成菌群失调，从而引发疾病。肠道微生态的紊乱与许多疾病相关，如内分泌代谢性疾病、肾脏疾病、神经性疾病、心血管疾病、呼吸系统疾病以及癌症的发生等。因此，患者肠道菌群也恢复至正常状态，才代表着患者的肠道恢复健康状态。
5.然而，2020年兰州大学药学院的张雅婷在《中国药理学通报》发表一篇题为“肠道菌群与药物相互作用机制的研究进展”的文章，文中提及“厄他培南治疗7d后，受试者肠道菌群在d21～35恢复正常。对健康受试者连续7d使用抗生素(包括头孢洛林，头孢吡普，特拉万星和替加环素)后，发现替加环素对人体肠道菌群数量的变化产生更广泛的影响，即肠球菌，双歧杆菌和大肠杆菌的数量减少，其他肠杆菌和酵母菌数量增加”。同年，中国人民解放军联勤保障部队第九八九医院科研部的刘欣在《结直肠肛门外科》发表一篇题为“肠道菌群的影响因素研究进展”的文章，文中提及“高脂、高糖、高蛋白、低膳食纤维的饮食习惯容易导致肠道内有益菌减少和有害菌的滋生，从而导致肠道菌群失调”、“人们往往认为只有抗生素才会对肠道菌群产生影响，而最新的研究表明非抗生素类药物对肠道菌群结构也有显著影响。le bastard等系统性评估了一些目前最常见的非抗生素类处方药物如质子泵抑制
剂(ppis)、钙通道阻滞剂、非甾体类抗炎药(nsaids)、抗组胺药、抗精神病药、二甲双胍、阿片类药物等，发现这些非抗生素类处方药物对肠道菌群的影响程度与抗生素类药物大致相同”。由此可知，不正常的饮食习惯和药物均会直接影响人体肠道菌群，且药物干预虽然能够改善肠道疾病症状，但是停药后患者的肠道菌群仍需要相当长一段时间才能恢复。
6.同样的，肠道类疾病药物也会导致人体肠道菌群的平衡被打破。2021，杭州市中医院的钱香在《浙江实用医学》发表一篇题为“喂养方式对腹泻患儿头孢克洛使用前后肠道菌群的影响”的文章，文中提及“本实验提示腹泻婴幼儿使用抗菌药物后，其肠道菌群的稳态将受到破坏且存在后续反应，恢复时间长，也有可能造成肠道菌群结构长期乃至永久改变，给其成人生活带来不利影响”。2022年，深圳市龙岗中心医院的杨伟昂在《药物与临床》发表一篇题为“两种泻药的安全性及对肠道菌群影响的对比研究”，文中提及“导泻药物会引起肠道菌群数量及构成的显著改变，导致迟发性不良反应的发生”。由此可知，肠道类疾病药物也会造成人体肠道菌群的显著改变，并且恢复时间较长。
7.目前，大部分的研究均致力于恢复抗生素药物引发的肠道菌群失调，如cn106604736a，其采用副干酪乳杆菌来恢复由抗生素治疗或抗生素治疗后引起的肠道菌群失调，而对于非抗生素类药物引发的肠道菌群失调，或前述提及的不正常的饮食习惯引发的肠道菌群失调，则鲜有研究。此外，许多方法都致力于肠道菌群在门水平和属水平的丰度发生变化。肠道菌群在门水平和属水平的丰度固然非常重要，但是，肠道菌群的多样性亦非常重要，它代表着人体菌群微生态的稳定性和面对外界致病菌等入侵的抵御能力。肠道菌群的种类数量越多，多样性越高。其中，alpha多样性(α-多样性)指的是菌群的“丰度”，菌种菌株的数目越多，α-多样性就越多，身体抵御外界致病菌的能力也越强，这往往代表着更健康的身体状况。
8.鉴于此，如何改善由肠道疾病治疗药物或饮食引起的肠道菌群失调，成为本领域技术人员亟待解决的技术问题。


技术实现要素：

9.本发明的目的在于将五种果蔬的组合物应用于制备改善肠道菌群失调的食品或药品中，以解决现有技术中由肠道疾病治疗药物或饮食引起的肠道菌群失调。
10.为了实现上述发明目的，本发明的技术方案如下：
11.一种五种果蔬的组合物在制备改善肠道菌群失调食品或药品中的应用，所述组合物为各原料重量配比为：南瓜衣30％、南瓜蒂18.5％、南瓜络11.5％、茯苓7％、银耳8％、芦荟11％和低聚木糖14％；所述肠道菌群失调由肠道疾病治疗药物或饮食引起。
12.进一步的，所述改善肠道菌群失调包括增加肠道菌群的α-多样性。
13.进一步的，所述改善肠道菌群失调还包括增加拟杆菌门、疣微菌门和放线菌门中至少一种的丰度，和/或降低厚壁菌门和变形菌门中至少一种的丰度。
14.进一步的，所述饮食为低纤维饮食。
15.进一步的，在属分类水平，所述改善肠道菌群失调包括增加monoglobus属、prevotellaceae ucg-001属、roseburia属、muribaculum属、anaerovorax属、alloprevotella属、butyricicoccus属、barnesiella属、未分类的oscillospirales和subdoligranulum属。
16.进一步的，在种分类水平，所述改善肠道菌群失调包括增加oscillibacter sp.pea192、lachnospiraceae下属种、muribaculum下属种、allobaculum sp.、oscillospiraceae下属种、roseburia下属种、alloprevotella下属种、monoglobus下属种、prevotellaceae ucg-001下属种、anaerovorax下属种、eubacterium sp.14-2、clostridia vadinbb60 group、muribaculaceae下属种、barnesiella下属种、subdoligranulum下属种、oscillospirales下属种、butyricicoccus下属种、candidatus soleaferrea下属种、butyrate-producing bacterium l2-10、odoribacter下属种；其中，oscillospiraceae和roseburia下属种均为两个，monoglobus下属种为三个。
17.进一步的，所述药物为洛哌丁胺。
18.进一步的，属分类水平，所述改善肠道菌群失调包括增加未分类的oscillospirales、anaerostipes属和未分类的christensenellaceae。
19.进一步的，在种分类水平，所述改善肠道菌群失调包括增加clostridia vadinbb60 group、gca-900066575下属种、oscillospirales下属种、anaerostipes caccae dsm 14662、christensenellaceae下属种和candidatus soleaferrea massiliensis。
20.本发明的有益效果为：
21.1、天天胶囊能够基本恢复“低纤维饮食或哌洛丁胺致使的物种丰富度和多样性降低”，尤其是恢复有益菌物种丰富度和多样性，使得肠道菌群物种丰富度和多样性接近恢复至正常水平。肠道菌群alpha多样性的结果也反应天天胶囊的上述作用。低纤维饮食或哌洛丁胺会导致肠道菌群α-多样性大幅度降低，天天胶囊则能够改善这种情况，显著增加肠道菌群α-多样性，使其趋近于正常肠道菌群。
22.2、天天胶囊对于物种组成及丰度同样也有积极作用。天天胶囊能够恢复“低纤维饮食或哌洛丁胺致使的有益菌丰度降低，有害菌丰度升高”。同时，低纤维饮食或哌洛丁胺会导致肠道菌群物种组成及丰度偏离正常肠道菌群，而天天胶囊则能够改善这种情况，使其逐渐恢复至正常肠道菌群水平。
附图说明
23.下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
24.图1为本发明实施例1的稀释曲线；
25.图2为本发明实施例1三组sd大鼠肠道菌群属水平物种丰富度的otu比较venn-韦恩图；
26.图3为本发明实施例1三组sd大鼠肠道菌群属水平的α-多样性变化示意图；
27.图4为本发明实施例1三组sd大鼠肠道菌群门分类水平物种组成的丰度示意图；
28.图5为本发明实施例1三组sd大鼠肠道菌群otu层级聚类树示意图；
29.图6为本发明实施例1三组sd大鼠肠道菌群在丰度上有显著差异的物种lda分布柱状图；
30.图7为本发明实施例1三组sd大鼠肠道菌群差异微生物lefse分析示意图；
31.图8为本发明实施例2的稀释曲线；
32.图9为本发明实施例2三组sd大鼠肠道菌群属水平物种丰富度的otu比较venn-韦恩图；
33.图10为本发明实施例2三组sd大鼠肠道菌群属水平的α-多样性变化示意图；
34.图11为本发明实施例2三组sd大鼠肠道菌群在丰度上有显著差异的物种lda分布柱状图；
35.图12为本发明实施例2三组sd大鼠肠道菌群差异微生物lefse分析示意图。
具体实施方式
36.下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都涉及本发明保护的范围。
37.本发明中，所述五种果蔬的组合物重量配比具体为：南瓜衣30％、南瓜蒂18.5％、南瓜络11.5％、茯苓7％、银耳8％、芦荟11％和低聚木糖14％。其制备方法为：按重量配比选取南瓜衣、南瓜蒂、南瓜络、茯苓、银耳原料，挑选、去杂后，加水浸泡；浸泡完成后，开始煎煮，煎煮3次，每次30min，将3次的煎液合并，过滤；开始浓缩，直至成为稠膏；按重量比选取芦荟，粉碎、过筛；将前述浓缩稠膏和粉碎后的芦荟混合均匀；混合均匀后进行低温干燥，使混合物中水分≤8％、灰分≤5％；检测符合要求后，将其用气流磨超细微粉碎，最终粉碎为500目；粉碎完成后，将其与低聚木糖充分混合混匀；分装胶囊，即得。该产品的商品名称为变通牌天天胶囊，生产厂家为河北御芝林药业有限公司。
38.本发明中，otus又称作操作分类单元，所有的有效序列以97％的一致性聚类成为otus。
39.本发明中，稀释曲线可直接反映测序数据量的合理性，并间接反映样品中物种的丰富程度。当曲线趋向平坦时，说明测序数据量逐渐合理，更多的数据量只会产生少量新的物种(otus)。以抽到的序列数与它们所能代表otu的数目构建稀释曲线。
40.本发明中，venn-韦恩图是在对所有的样本进行均一化处理之后，对各组之间共有的或特有的物种数量(otus)进行展示。可以比较直观的表示出各样本之间共同或独有的部分。
41.本发明中，alpha多样性用于分析样品内的微生物群落多样性，常简写做α-多样性。通过单样本的多样性分析，可以考察样品内的微生物群落的丰富度和多样性。常用的度量标准有chao指数、shannon指数、ace指数、simpson指数、coverage指数。本研究选用的是shannon指数、ace指数、chao指数。shannon指数：用来估算样本中微生物多样性的指数之一。常用于反映群落alpha多样性。chao指数是用chao1算法估计样本中所含otu数目的指数，chao1在生态学中常用来估计物种总数。ace指数是用来估计群落中otu数目的指数，由chao提出，是生态学中估计物种总数的常用指数之一。shannon指数、chao指数和ace指数的数值越大，说明群落多样性越高。
42.本发明中，低纤维饮食采用的是去除纤维素的ain-93标准纯化饲料，与正常饮食的区别仅在于无纤维素，其他均相同。
43.需要说明的是，由于本发明的部分附图必须在有颜色的情况下才能进行分析，故在提交申请文件时，一并提交彩色的其他证明文件。该其他证明文件与说明书附图完全相同，区别仅在于附图用颜色加以区分。
44.实施例1五种果蔬的组合物改善由于低纤维饮食造成的肠道菌群失调
45.1.1sd大鼠分组及饲喂
46.sd大鼠分别置于单独鼠笼中适应性喂养一周，不限水和食物，将其按体重随机分为3组，每组10只。具体的分组、造模方式和给药方式如表1所示：
47.表1实验sd大鼠分组及饲喂情况
[0048][0049]
1)空白组(nc，n＝10)：全程给予正常饮食，自第5周开始给药，连续给药两周。每天灌胃给药0.3wt％羧甲基纤维素钠(cmc-na)，每日的给药量按照sd大鼠的体重计算，具体为10ml/kg；
[0050]
2)模型组(lfd，n＝10)：除第一周外，全程给予低纤维饮食，自第5周开始给药，连续给药两周。每天灌胃给药0.3wt％羧甲基纤维素钠(cmc-na)，每日的给药量按照sd大鼠的体重计算，具体为10ml/kg；
[0051]
3)天天胶囊组(ttc，n＝10)：除第一周外，全程给予低纤维饮食，自第5周开始给药，连续给药两周。每天灌胃给药天天胶囊(ttc)，每日的给药量按照sd大鼠的体重计算，具体为36mg/kg，该给药量的计算仅包含内容物，不包含外部包材。
[0052]
1.2sd大鼠16s rrna测序分析肠道菌群
[0053]
根据soil dnakit(omegabio-tek,norcross,ga,u.s.)说明书进行微生物群落总dna抽提，使用1％的琼脂糖凝胶电泳检测dna的提取质量，使用nanodrop2000测定dna浓度和纯度；接下来对16s rrna基因v3-v4可变区进行pcr扩增，使用的是338f(5
’‑
actcctacgggaggcagcag-3’)和806r(5
’‑
ggactachvgggtwtctaat-3’)。将同一样本的pcr产物混合后使用2％琼脂糖凝胶回收pcr产物，利用axyprep dnagel extraction kit(axygen biosciences,union city,ca,usa)进行回收产物纯化。回收产物纯化完成后，用2％琼脂糖凝胶电泳检测，并用quantus
tm fluorometer(promega,usa)对回收产物进行检测定量。
[0054]
使用nextflextm rapid dna-seq kit(bioo scientific，美国)进行建库。利用illumina公司的miseq pe300/novaseq pe250平台进行测序(上海美吉生物医药科技有限公司)。使用fastp(https://github.com/opengene/fastp，version0.20.0)软件对原始测序序列进行质控，使用flash
[0055]
(http://www.cbcb.umd.edu/software/flash,version 1.2.7)软件进行拼接。使用uparse[3]软件(http://drive5.com/uparse/,version 7.1)，根据97％的相似度对序列进行otu聚类并剔除嵌合体。利用rdp classifier(http://rdp.cme.msu.edu/，version 2.2)对每条序列进行物种分类注释，比对silva 16s rrna数据库(version138)，设置比对阈值为70％。需要说明的是，本发明的物种丰富度otu分析、alpha多样性、lefse分析、otu层级聚类树、物种组成及丰富度，均是采用上海美吉生物医药科技有限公司的微生物分析平台分析的。
[0056]
alpha多样性用于分析样本中物种多样性的复杂性，通过chao1、shannon和ace三个指标进行分析。lefse分析是通过检测不同组间的物种丰度差异，获得显著性差异物种，再分析上步骤获得的显著性差异物种的所有亚种是否都趋同于同一分类级别，最后使用线性判别分析(lda)，得到最终的差异物种。本发明中，默认设置lda score的筛选值为3。
[0057]
1.3结果分析
[0058]
需要说明的是，所有的实验数据以均数
±
标准差(mean
±
sd)表示，使用graphpad 8.0统计软件对两组间采用t检验进行分析；当组数超过两个时，则使用单因素或多因素方差分析(one or two wayanova)；p《0.05则表示差异有统计学意义。测得的数据结果如图1至图7所示。
[0059]
1.3.1物种丰富度otu结果分析
[0060]
图1示出了本实施例的稀释曲线，图1中shannon-curves曲线已经进入平台期，说明测序数据量足以覆盖所有类群，可以反映本实施例需要的绝大多数的微生物信息，满足分析要求。
[0061]
1.3.1.1属分类水平
[0062]
图2a示出了本实施例三组sd大鼠肠道菌群属水平物种丰富度的otu比较韦恩图(venn)。通过venn图可观察到的otus的分析结果显示，nc组共有144个otus，lfd组共有130个otus，ttc组共有145个otus，3组之间共有物种数目为119个otus。此外，nc组特有10个otus，lfd组特有2个otus，ttc组特有10个otus。相比于nc组，lfd组的otus水平降低，但是相比于lfd组，ttc组显著提升otus的相对丰度。由此可知，由于低纤维饮食，使得大鼠肠道菌群的多样性降低；在天天胶囊进行干预两周后，大鼠肠道菌群的属水平多样性已经恢复至正常水平。
[0063]
将图2a中具体的菌属导出，进一步分析图2a。在nc组中，monoglobus属(属于厚壁菌门)、prevotellaceae ucg-001属(属于拟杆菌门)、roseburia属(属于厚壁菌门)、muribaculum属(属于拟杆菌门)、anaerovorax属(属于厚壁菌门)和alloprevotella属(属于拟杆菌门)这6种菌属可以检测到。具体的，roseburia属通过产生丁酸盐改善肠道屏障完整性和抑制炎症反应。
[0064]
muribaculum是一种主要的粘蛋白单糖觅食菌，可阻碍病原体定植，同时维持肠道内稳态。anaerovorax能够产生短链脂肪酸，改善肠道ph值。prevotellaceae ucg-001属、alloprevotella属和ucg-007属尤其对于溃疡性结肠炎具有保护作用。
[0065]
但是，进行低纤维饮食干预五周后，lfd组却未检测到前述6种有益菌属。由此可知，由于低纤维饮食，造成sd大鼠肠道菌群缺失该6种有益菌属。对于同样是低纤维饮食干预的sd大鼠，在第5周和第6周对其进行天天胶囊干预。两周后，这6种有益菌属再次恢复。由此可知，在属分类水平，对于lfd导致的肠道有益菌属缺失，天天胶囊能够恢复部分有益菌属。
[0066]
更进一步分析图2a，经过天天胶囊干预两周后，除恢复了上述6种有益菌属外，还增加了如下的有益菌属：butyricicoccus属(属于厚壁菌门)、barnesiella属(属于拟杆菌门)、未分类的oscillospirales(属于厚壁菌门)和subdoligranulum属(属于厚壁菌门)。这4种菌属均为对肠胃环境友好的有益菌属。具体的，butyricicoccus产生的丁酸能发挥改善机体免疫功能的作用，属于保护类益生菌。candidatus soleaferrea一方面具有抗炎症的
作用，另一方面还利于代谢。
[0067]
barnesiella肠道保护细菌，可以帮助抑制甚至清除肠道中的有害细菌。
[0068]
oscillospirales可以保护肠道屏障。subdoligranulum会产生丁酸盐，能通过增强肠道屏障及机体免疫力来帮助降低机体患结肠疾病的风险。由此可知，在属分类水平，对于lfd导致的肠道有益菌属缺失，天天胶囊除了能够恢复部分有益菌属外，还能够另外增加一些有益菌属，进一步丰富肠道菌群物种丰富度和多样性。
[0069]
1.3.1.2种分类水平
[0070]
图2b示出了本实施例三组sd大鼠肠道菌群种水平物种丰富度的otu比较韦恩图(venn)。通过venn图可观察到的otus的分析结果显示，nc组共有239个otus，lfd组共有206个otus，ttc组共有235个otus，3组之间共有物种数目为179个otus。此外，nc组特有19个otus，lfd组特有5个otus，ttc组特有23个otus。相比于nc组，lfd组的otus水平降低，但是相比于lfd组，ttc组显著提升otus的相对丰度。由此可知，由于低纤维饮食，使得大鼠肠道菌群的多样性降低；在天天胶囊进行干预两周后，大鼠肠道菌群的种水平多样性已经基本恢复至正常水平。
[0071]
将图2b中具体的菌种导出，进一步分析图2b。在nc组中，oscillibacter sp.pea192(属于厚壁菌门)、lachnospiraceae下属种(属于厚壁菌门)、muribaculum下属种(属于拟杆菌门)、allobaculum sp.(属于拟杆菌门)、oscillospiraceae下属种(属于厚壁菌门)、roseburia下属种、alloprevotella下属种、monoglobus下属种、prevotellaceae ucg-001下属种、anaerovorax下属种、eubacterium sp.14-2(属于厚壁菌门)、clostridia vadinbb60 group(属于厚壁菌门)和muribaculaceae下属种(属于拟杆菌门)可以检测到。其中，oscillospiraceae、roseburia和monoglobus下属种均为两个。
[0072]
具体的，oscillibacter sp.pea192，是一种产丁酸菌。lachnospiraceae属于厚壁菌门，是一种潜在的有益菌，参与多种碳水化合物的代谢，其发酵导致乙酸和丁酸的产生。allobaculum sp.是一种保护性菌，能通过产生短链脂肪酸来保护肠屏障功能，可以直接或间接地起到抗炎作用。eubacterium sp.能够产丁酸盐，属于对人类肠道健康有益的菌种。muribaculaceae，是主要的粘蛋白单糖觅食者，有助于缓解炎症、抑制有害菌并具有免疫调节功能，维持肠道稳态。clostridia vadinbb60 group，其有助于缓解肠炎、溃疡性结肠炎等炎症型肠道疾病。
[0073]
但是，进行低纤维饮食干预五周后，lfd组却未检测到前述16种有益菌种。由此可知，由于低纤维饮食，造成sd大鼠肠道菌群缺失该16种有益菌种。对于同样是低纤维饮食干预的sd大鼠，在第5周和第6周对其进行天天胶囊干预。两周后，这16种有益菌种再次恢复。由此可知，在种分类水平，对于lfd导致的肠道有益菌种缺失，天天胶囊能够恢复部分有益菌种。
[0074]
更进一步分析图2b，经过ttc干预两周后，除恢复了上述16种有益菌种外，还增加了如下的有益菌种：barnesiella下属种、monoglobus下属种、subdoligranulum下属种、oscillospirales下属种、butyricicoccus下属种(属于厚壁菌门)、candidatus soleaferrea下属种(属于厚壁菌门)、butyrate-producing bacterium l2-10、odoribacter下属种(属于拟杆菌门)。
[0075]
具体的，odoribacter能够有效抵御肠道炎症。butyricicoccus产生的丁酸能发挥
改善机体免疫功能的作用，属于保护类益生菌。candidatus soleaferrea，一方面具有抗炎症的作用，另一方面还利于代谢。butyrate-producingbacterium l2-10是人体肠道菌群中的重要功能类群，其产生的丁酸盐具有抗炎和免疫调节功能，对人体健康十分重要。由此可知，在种分类水平，对于lfd导致的肠道有益菌种缺失，天天胶囊除了能够恢复部分有益菌种外，还能够增加一些有益菌种，进一步肠道菌群丰富物种丰富度和多样性。
[0076]
1.3.2α-多样性分析结果分析
[0077]
本领域技术人知晓，shannon指数可以反应α-多样性。图3(a)为三组sd大鼠肠道菌群shannon指数的箱式图，以中位线为准，图3(b)为三组sd大鼠肠道菌群shannon指数的柱形图，纵坐标显示的数值为其平均值。分析图3可知，lfd组的物种相对丰富度和多样性显著低于nc组；经过ttc干预后，其物种相对丰富度和多样性显著提高。由此可知，lfd会导致肠道菌群α-多样性大幅度降低，ttc则能够改善这种情况，显著增加肠道菌群α-多样性，使其趋近于nc组肠道菌群。
[0078]
1.3.3物种组成及丰度结果分析
[0079]
图4示出了实施例1三组sd大鼠肠道菌群门分类水平物种组成的丰度。由图4可知，在门水平上，三组中共鉴定出99％的门主要是由以下6个门组成：厚壁菌门(firmicutes)和拟杆菌门(bacteroidetes)为优势门，其次为变形菌门(proteobacteria)、放线菌门(actinobacteria)、疣微菌门(verrucomicrobiota)和脱硫菌门(desulfobacterota)。与nc组相比，lfd组中厚壁菌门(firmicutes)和拟杆菌门(bacteroidetes)的相对丰度分别呈现升高和降低的变化，而在灌胃ttc后变化趋势呈现出明显相反的状态。
[0080]
由此说明，在门水平上，与nc组相比，lfd致使厚壁菌门和变形菌门的丰度增加，拟杆菌门、疣微菌门、放线菌门的丰度降低。本领域技术人员知晓，拟杆菌门、疣微菌门和放线菌门大部分有益菌，而变形菌门大部分为有害菌。换句话说，lfd致使有益菌的丰度降低，有害菌的丰度升高。灌胃ttc后，再与lfd组相比，拟杆菌门、疣微菌门和放线菌门的丰度逐渐增加，厚壁菌门和变形菌门的丰度逐渐降低。即，ttc能够恢复“lfd致使的有益菌丰度降低、有害菌丰度升高”。
[0081]
1.3.4otu层级聚类树结果分析
[0082]
图5示出了实施例1三组sd大鼠肠道菌群otu层级聚类树，该聚类树是基于门分类水平的相对丰度和bray-curtis距离。由图5可知，lfd组全部被聚类到一起，而nc组和ttc组则被聚类到另外两个分支，且nc组和ttc组在该另外两个分支中交叉分布。由此可知，lfd组的肠道菌群组成与nc组、ttc组均存在较大差异；nc组和ttc组的肠道菌群组成则非常相近。由此证明，lfd会导致肠道菌群组成偏离nc组，而ttc则能够改善这种“肠道菌群组成偏离nc组”情况，使其逐渐恢复至正常肠道菌群组成。
[0083]
1.3.5三组sd大鼠肠道菌群差异微生物lefse结果分析
[0084]
运用lefse分析得出三组sd大鼠肠道微生物物种差异显著，结果如图6和图7所示。图6示出了实施例1三组sd大鼠肠道菌群在丰度上有显著差异的物种lda分布柱状图，图7示出了实施例1三组sd大鼠肠道菌群差异微生物lefse分析示意图。图6中，由上至下分别代表的是nc组、lfd组和ttc组；纵坐标为组间具有显著差异的分类单元，横坐标条形图为对应分类单元的lda差异分析对数得分值，按照分值大小排序。
[0085]
通过图6和图7可以看出，三组sd大鼠的微生物物种差异显著。由lda分布柱状图可
知，三组sd大鼠肠道环境微生物具有明显差异的菌群聚类为lachnospiraceae、dorea和marinifilaceae。lachnospiraceae属于厚壁菌门，其可以产生大量的短链脂肪酸，来调节机体免疫反应和炎症反应。dorea属于厚壁菌门，marinifilaceae属于拟杆菌门，两者均具有抗炎作用。由此可知，由于天天胶囊的干预，这三种有益菌特异性增加，对于肠道环境的有益菌物种丰富度和多样性、以及物种结构均具有积极效果。
[0086]
综上所述，在属分类水平，对于lfd导致的肠道有益菌属缺失，天天胶囊不仅能够恢复部分有益菌属，还能够增加一些有益菌属，进一步丰富有益菌物种丰富度和多样性，使得肠道菌群物种多样性接近恢复至nc组水平。在种分类水平，亦同样如此。即，天天胶囊能够基本恢复“lfd致使的物种丰富度和多样性降低”，尤其是恢复有益菌物种丰富度和多样性，使得肠道菌群物种多样性接近恢复至nc组水平。肠道菌群alpha多样性的结果也反应天天胶囊的上述作用。lfd会导致肠道菌群α-多样性大幅度降低，天天胶囊则能够改善这种情况，显著增加肠道菌群α-多样性，使其趋近于nc组肠道菌群。
[0087]
除了物种丰富度和多样性，天天胶囊对于物种组成及丰度同样也有积极作用。物种组成及丰度结果表明，天天胶囊能够恢复“lfd致使的有益菌丰度降低、有害菌的丰度升高”。同时，otu层级聚类树结果表明，lfd会导致肠道菌群组成偏离nc组，而天天胶囊则能够改善这种“肠道菌群组成偏离nc组”情况，使其逐渐恢复至正常肠道菌群组成。lefse结果表明，天天胶囊能够改善“lfd致使的物种多样性降低和有益菌丰度降低”，对于肠道环境的有益菌物种丰富度和多样性、以及物种结构均具有积极效果。
[0088]
实施例2五种果蔬的组合物改善由于洛哌丁胺饮食造成的肠道菌群失调
[0089]
2.1sd大鼠分组及饲喂
[0090]
sd大鼠分别置于单独鼠笼中适应性喂养一周，不限水和食物，将其按体重随机分为3组，每组10只。具体的分组、造模方式和给药方式如表2所示：
[0091]
表2实验sd大鼠分组及饲喂情况
[0092][0093]
1)空白组(control，n＝10)：全程给予正常饮食，自第8天开始皮下注射生理盐水，每天两次；生理盐水每日的给药量按照sd大鼠的体重计算，具体为10ml/kg。自第18天开始，连续每天皮下注射生理盐水并灌胃给药至第31天；此期间，皮下注射生理盐水，每天一次，生理盐水每日的给药量按照sd大鼠的体重计算，具体为10ml/kg；灌胃给药为0.3wt％羧甲基纤维素钠(cmc-na)，每日的给药量按照sd大鼠的体重计算，具体为10ml/kg。
[0094]
2)模型组(lop，n＝10)：全程给予正常饮食，自第8天开始皮下注射洛哌丁胺
(lop)，每天两次；每次的注射量按照sd大鼠的体重计算，具体为16mg/kg。自第18天开始，连续每天皮下注射lop并灌胃给药至第31天。需要说明的是，洛哌丁胺需要溶解于生理盐水，再进行注射，此阶段生理盐水的用量同control组。自第18天开始，皮下注射lop仅每天一次。灌胃给药为0.3wt％羧甲基纤维素钠(cmc-na)，每日的给药量按照sd大鼠的体重计算，具体为10ml/kg。
[0095]
3)天天胶囊组(ttc，n＝10)：全程给予正常饮食，自第8天开始皮下注射洛哌丁胺(lop)，每天两次；每次的注射量按照sd大鼠的体重计算，具体为16mg/kg。自第18天开始，连续每天皮下注射lop并灌胃给药至第31天。自第18天开始，皮下注射lop仅每天一次。灌胃给药为ttc，每日的给药量按照sd大鼠的体重计算，具体为36mg/kg，该给药量的计算仅包含内容物，不包含外部包材。
[0096]
2.2sd大鼠16s rrna测序分析肠道菌群
[0097]
本实施例的分析方法同实施例1.2，此处不再赘述。
[0098]
2.3结果分析
[0099]
需要说明的是，所有的实验数据以均数
±
标准差(mean
±
sd)表示，使用graphpad 8.0统计软件对两组间采用t检验进行分析；当组数超过两个时，则使用单因素或多因素方差分析(one or two wayanova)；p《0.05则表示差异有统计学意义。测得的数据结果如图8至图12所示。
[0100]
2.3.1物种丰富度otu结果分析
[0101]
图8示出了本实施例的稀释曲线，图8中shannon-curves曲线已经进入平台期，说明测序数据量足以覆盖所有类群，可以反映本实施例需要的绝大多数的微生物信息，满足分析要求。
[0102]
图9a示出了本实施例三组sd大鼠肠道菌群属水平物种丰富度的otu比较韦恩图(venn)。通过venn图可观察到的otus的分析结果显示，control组共有138个otus，lop组共有128个otus，ttc组共有137个otus，3组之间共有物种数目为109个otus。此外，control组特有18个otus，lop组特有2个otus，ttc组特有6个otus。由此可知，control与lop组大鼠的肠道菌群存在差异性。相比于control组，lop组的otus水平降低，但是相比于lop组，ttc组显著提升otus的相对丰度。由此可知，由于注射lop，使得大鼠肠道菌群的多样性降低；在天天胶囊进行干预两周后，大鼠肠道菌群的属水平多样性已经恢复至正常水平。
[0103]
2.3.1.1属分类水平
[0104]
将图9a中具体的菌属导出，进一步分析图9a。经过皮下注射lop后，lop组的物种丰富度和多样性降低，经过天天胶囊干预两周后，增加了如下的有益菌属：未分类的oscillospirales、anaerostipes属和未分类的christensenellaceae(属于厚壁菌门)。christensenellaceae是一种产丁酸盐微生物。这3种菌属均为对肠胃环境友好的有益菌属。由此可知，在属分类水平，对于lop导致的肠道有益菌属缺失，天天胶囊能够增加部分有益菌属，进而丰富肠道菌群物种丰富度和多样性，尤其是有益菌。
[0105]
2.3.1.2种分类水平
[0106]
图9b示出了本实施例三组sd大鼠肠道菌群种水平物种丰富度的otu比较韦恩图(venn)。通过venn图可观察到的otus的分析结果显示，control组共有228个otus，lop组共有211个otus，ttc组共有225个otus，3组之间共有物种数目为177个otus。此外，control组
特有31个otus，lop组特有4个otus，ttc组特有10个otus。相比于control组，lop组的otus水平降低，但是相比于lop组，ttc组显著提升otus的相对丰度。由此可知，由于注射lop，使得大鼠肠道菌群的多样性降低；在天天胶囊进行干预两周后，大鼠肠道菌群的种水平多样性已经恢复至正常水平。
[0107]
将图9b中具体的菌种导出，进一步分析图9b。在control组中，clostridia vadinbb60 group、、gca-900066575下属种(属于厚壁菌门)、oscillospirales下属种这3种菌种可以检测到。具体的，gca-900066575属于产丁酸盐。
[0108]
但是，进行皮下注射lop干预24天后，lop组却未检测到前述3种有益菌种。由此可知，由于皮下注射lop，造成sd大鼠肠道菌群缺失该3种有益菌种。对于同样是皮下注射lop干预的sd大鼠，在对其进行天天胶囊干预两周后，这3种有益菌种再次恢复。由此可知，在种分类水平，对于lop导致的肠道有益菌属缺失，天天胶囊能够恢复部分有益菌种。
[0109]
更进一步分析图9b，经过天天胶囊干预两周后，除恢复了上述3种有益菌种外，还增加了如下的有益菌种：anaerostipes caccae dsm 14662(属于厚壁菌门)、christensenellaceae下属种(属于厚壁菌门)和candidatus soleaferrea massiliensis(属于厚壁菌门)。这3种菌种均为对肠胃环境友好的有益菌种。具体的，anaerostipes caccae dsm 14662和christensenellaceae是一种丁酸产生菌株；candidatus soleaferrea massiliensis具有肠粘膜保护作用和抗炎作用。由此可知，在种分类水平，对于lop导致的肠道有益菌属缺失，天天胶囊除了能够恢复部分有益菌属外，还能够增加一些有益菌属，进一步丰富肠道菌群的物种丰富度和多样性。
[0110]
2.3.2α-多样性分析结果分析
[0111]
本领域技术人知晓，shannon指数、ace指数和chao指数可以反应α-多样性。三组大鼠的shannon指数、ace指数和chao指数如图10所示。其中，图10(a)为三组sd大鼠肠道菌群shannon指数的箱式图，图10(b)为三组sd大鼠肠道菌群shannon指数的柱形图；图10(c)为三组sd大鼠肠道菌群ace指数的箱式图，图10(d)为三组sd大鼠肠道菌群ace指数的柱形图；图10(e)为三组sd大鼠肠道菌群chao指数的箱式图，图10(f)为三组sd大鼠肠道菌群chao指数的柱形图。分析图10可知，lop组的物种相对丰富度和多样性显著低于control组；经过ttc干预后，其物种相对丰富度和多样性显著提高。由此证明，lop会导致肠道菌群α-多样性大幅度降低，ttc则能够改善这种情况，显著增加肠道菌群α-多样性，使其趋近于control组肠道菌群。换句话说，ttc能够恢复“lop致使的α-多样性降低”。
[0112]
2.3.3三组sd大鼠肠道菌群差异微生物lefse结果分析
[0113]
运用lefse分析得出三组sd大鼠肠道微生物物种差异显著，结果如图11和图12所示。图11示出了实施例2三组sd大鼠肠道菌群在丰度上有显著差异的物种lda分布柱状图，图12示出了实施例2三组sd大鼠肠道菌群差异微生物lefse分析示意图。图11中，由上至下分别代表的是nc组、lop组和ttc组；纵坐标为组间具有显著差异的分类单元，横坐标条形图为对应分类单元的lda差异分析对数得分值，按照分值大小排序。
[0114]
通过图11和图12可以看出，三组sd大鼠的微生物物种差异显著。由lda分布柱状图可知，与control组和lop组相比，lop组的物种丰富度和多样性是最少的。此外，三组sd大鼠肠道环境微生物具有最明显差异的菌群聚类为bacteroidota、bacteroidia、bacteroidales、bacteroidaceae和bacteroides。本领域技术人员知晓，拟杆菌门大部分有
益菌。同时，除去一些由于分类水平较高导致无法确定有益菌还是有害菌的差异菌群，对lop干预的大鼠进行天天胶囊灌胃，还增加了属分类水平的dorea和alistipes，以及科分类水平的rikenellaceae，三者均属于拟杆菌门。其中，rikenellaceae属于短链脂肪酸产生菌，alistipes是一种肠道细菌，能够生产短链脂肪酸并减少肠道炎症。由此可知，对于lop导致的肠道菌群物种丰富度和多样性降低、有益菌缺失，天天胶囊不仅能够增加拟杆菌门丰度，而且能够增加部分有益菌群，进一步丰富物种丰富度和多样性。
[0115]
综上所述，在属分类水平和种分类水平，天天胶囊能够基本恢复“lop致使的物种丰富度和多样性降低”，尤其是恢复有益菌物种丰富度和多样性，使得肠道菌群物种多样性接近恢复至nc组水平。肠道菌群alpha多样性的结果也反应天天胶囊的上述作用。lop会导致肠道菌群α-多样性大幅度降低，天天胶囊则能够改善这种情况，显著增加肠道菌群α-多样性，使其趋近于nc组肠道菌群。对于lop导致的肠道物种丰富度和多样性降低、有益菌属缺失，天天胶囊不仅能够增加拟杆菌门丰度，而且能够增加部分有益菌群，进一步丰富物种丰富度和多样性。

技术特征：
1.五种果蔬的组合物在制备改善肠道菌群失调食品或药品中的应用，其特征在于：所述组合物为各原料重量配比为：南瓜衣30％、南瓜蒂18.5％、南瓜络11.5％、茯苓7％、银耳8％、芦荟11％和低聚木糖14％；所述肠道菌群失调由肠道疾病治疗药物或饮食引起。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述改善肠道菌群失调包括增加肠道菌群的α-多样性。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述改善肠道菌群失调还包括增加拟杆菌门、疣微菌门和放线菌门中至少一种的丰度，和/或降低厚壁菌门和变形菌门中至少一种的丰度。4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述饮食为低纤维饮食。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：在属分类水平，所述改善肠道菌群失调包括增加monoglobus属、prevotellaceaeucg-001属、roseburia属、muribaculum属、anaerovorax属、alloprevotella属、butyricicoccus属、barnesiella属、未分类的oscillospirales和subdoligranulum属。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：在种分类水平，所述改善肠道菌群失调包括增加oscillibactersp.pea192、lachnospiraceae下属种、muribaculum下属种、allobaculumsp.、oscillospiraceae下属种、roseburia下属种、alloprevotella下属种、monoglobus下属种、prevotellaceaeucg-001下属种、anaerovorax下属种、eubacteriumsp.14-2、clostridiavadinbb60group、muribaculaceae下属种、barnesiella下属种、subdoligranulum下属种、oscillospirales下属种、butyricicoccus下属种、candidatussoleaferrea下属种、butyrate-producingbacteriuml2-10、odoribacter下属种；其中，oscillospiraceae和roseburia下属种均为两个，monoglobus下属种为三个。7.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述肠道疾病治疗药物为洛哌丁胺。8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：在属分类水平，所述改善肠道菌群失调包括增加未分类的oscillospirales、anaerostipes属和未分类的christensenellaceae。9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：在种分类水平，所述改善肠道菌群失调包括增加clostridiavadinbb60group、gca-900066575下属种、oscillospirales下属种、anaerostipescaccaedsm14662、christensenellaceae下属种和candidatussoleaferreamassiliensis。

技术总结
本发明涉及一种五种果蔬的组合物在在制备改善肠道菌群失调食品或药品中的应用，其各原料重量配比为：南瓜衣30％、南瓜蒂18.5％、南瓜络11.5％、茯苓7％、银耳8％、芦荟11％和低聚木糖14％；所述肠道菌群失调由肠道疾病治疗药物或饮食引起。天天胶囊能够基本恢复“低纤维饮食或哌洛丁胺致使的物种丰富度和多样性降低”，尤其是恢复有益菌物种丰富度和多样性，使得肠道菌群物种丰富度和多样性接近恢复至正常水平。肠道菌群Alpha多样性的结果也反应天天胶囊的上述作用。低纤维饮食或哌洛丁胺会导致肠道菌群α-多样性大幅度降低，天天胶囊则能够改善这种情况，显著增加肠道菌群α-多样性，使其趋近于正常肠道菌群。使其趋近于正常肠道菌群。


技术研发人员：孙静 朱志铭 赵大鹏 李寅庆 李丽丽 殷志琦 张健 贾雪莲
受保护的技术使用者：河北御芝林药业有限公司
技术研发日：2023.03.10
技术公布日：2023/9/25