一种利用地中海富盐菌CRISPR-Cas系统实现基因编辑及提高PHBV产量的方法

一种利用地中海富盐菌crispr-cas系统实现基因编辑及提高phbv产量的方法
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种利用地中海富盐菌crispr-cas系统实现基因编辑及提高phbv产量的方法。


背景技术：

2.crispr-cas(clustered regularly interspaced short palindromic repeats-crispr associated proteins)系统是一种广泛存在于细菌(＞50％)和古菌(＞90％)中的获得性免疫系统，目前已被开发作为基因编辑工具，获得了广泛的应用。目前，crispr-cas系统被分为class 1和class 2两大类群。class 1的i型系统，其特征基因是cas3，编码的标志性蛋白cas3具有解旋酶和核酸酶两个功能结构域，能解开双链dna并切割靶标dna。当grna与cascade效应物结合，识别靶序列后会招募cas3核酸内切酶对靶标进行切割，产生双链断裂(double strand break，dsb)，激活非同源末端连接或同源重组修复机制，从而在靶基因中引入突变或者对靶基因进行精确编辑。目前已基于模式古菌沃氏富盐菌(haloferax volcanii)和西班牙盐盒菌(haloarcula hispanica)开发了嗜盐古菌的crispr-cas基因编辑工具。
3.地中海富盐菌(haloferax mediterranei)是嗜盐古菌生理代谢研究的模式菌株，同时也是极具潜力的phbv(聚羟基丁酸羟基戊酸酯)工业生产菌株之一，具有i-b型crispr-cas系统。但目前该菌的基因编辑系统仅限于基于同源双交换的pop-in/out系统，单次编辑耗时长效率低，且无法进行多个基因的同时编辑以及对大片段基因的删除。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供一种利用地中海富盐菌crispr-cas系统实现基因编辑及提高phbv产量的方法。
5.第一方面，本发明要求保护一种对地中海富盐菌进行基因编辑的方法。
6.本发明要求保护的对地中海富盐菌进行基因编辑的方法，可包括如下步骤：向地中海富盐菌受体菌株中导入能够表达靶向目的区域的crrna的表达盒，从而实现对所述目的区域的编辑；所述表达盒由如下(1)-(3)顺次连接而成：
7.(1)pphar启动子；
8.(2)由n个spacer序列间隔的n+1个相同的repeat序列(两端为repeat序列)；n为大于等于1的正整数；(以n＝1为例，具体结构为：repeat-spacer-repeat)
9.(3)终止子序列；
10.所述pphar启动子序列如seq id no.1所示；所述repeat序列如seq id no.2所示；所述spacer序列靶向所述目的区域(所述spacer序列能够与所述目的区域中的具体靶点互补配对)。
11.n个spacer序列优选是不同的。
12.所述目的区域可为目的基因或目的基因簇。
13.第二方面，本发明要求保护一种对地中海富盐菌进行基因或基因簇定点敲除的方法。
14.本发明要求保护的对地中海富盐菌进行基因或基因簇定点敲除的方法，可包括如下步骤：向地中海富盐菌受体菌株中导入能够表达靶向目的基因或目的基因簇的crrna的表达盒和用于敲除所述目的基因或所述目的基因簇的上下游同源臂，从而实现敲除所述目的基因或所述目的基因簇；
15.所述表达盒由如下(1)-(3)顺次连接而成：
16.(1)pphar启动子；
17.(2)由n个spacer序列间隔的n+1个相同的repeat序列(两端为repeat序列)；n为大于等于1的正整数；(以n＝1为例，具体结构为：repeat-spacer-repeat)
18.(3)终止子序列；
19.所述pphar启动子序列如seq id no.1所示；所述repeat序列如seq id no.2所示；所述spacer序列靶向所述目的基因或所述目的基因簇的编码区或启动子区(所述spacer序列能够与所述目的基因或所述目的基因簇的编码区或启动子区中的具体靶点互补配对)；
20.所述同源臂为在所述地中海富盐菌受体菌株基因组中位于所述目的基因或所述目的基因簇的上下游的序列；
21.导入所述地中海富盐菌受体菌株中的所述表达盒为1个或1个以上，如2-3个；
22.若干个所述表达盒中的spacer序列是不同的。
23.所述目的基因为1个或1个以上，如2个。
24.第三方面，本发明要求保护一种对地中海富盐菌进行基因组精简(删除非必需基因)的方法。
25.本发明要求保护的对地中海富盐菌进行基因组精简(删除非必需基因)的方法，可包括如下步骤：
26.抑制地中海富盐菌受体菌株中reca基因的表达，并向其中导入能够表达靶向目的区域的crrna的表达盒，从而删除地中海富盐菌基因组上靶向位置周围的非必需基因(如果是必需基因被删除则菌株会出现致死或者其他重大缺陷，致死的无法获得相应菌株，重大缺陷的很容易被排除)，进而实现对基因组的精简；
27.所述表达盒由如下(1)-(3)顺次连接而成：
28.(1)pphar启动子；
29.(2)由n个spacer序列间隔的n+1个相同的repeat序列(两端为repeat序列)；n为大于等于1的正整数；(以n＝1为例，具体结构为：repeat-spacer-repeat)
30.(3)终止子序列；
31.所述pphar启动子序列如seq id no.1所示；所述repeat序列如seq id no.2所示；所述spacer序列靶向所述目的区域(所述spacer序列能够与所述目的区域中的具体靶点互补配对)。
32.理论上，基因组精简后菌株代谢消耗减小，其复制繁殖等能力会相应变强，通过精简基因组再辅以对精简后菌株性状的鉴定，很容易获得更加优异的底盘菌用于构建工程菌。
33.在前文第一至第三方面中，所述spacer序列的长度优选为36nt。
34.在前文第一至第三方面中，所述表达盒可通过含有所述表达盒的重组载体导入所述地中海富盐菌受体菌株。
35.在前文第三方面中，抑制所述地中海富盐菌受体菌株中reca基因的表达可通过向所述地中海富盐菌受体菌株中导入能够表达靶向reca基因的crrna的表达盒实现。
36.其中，所述reca基因序列如seq id no.3所示。所述能够表达靶向reca基因的crrna的表达盒的序列如seq id no.4所示。
37.在前文第三方面中，所述终止子序列具体为t8终止子序列，即tttttttt。
38.第四方面，本发明要求保护如下任一种crispr-cas系统：
39.(b1)一种用于对地中海富盐菌进行基因编辑的crispr-cas系统，由如下a1)和a2)组成：
40.a1)地中海富盐菌内源的cas蛋白复合体；
41.a2)前文第一方面中所述的表达盒组成或含有所述表达盒的重组载体。
42.(b2)一种对地中海富盐菌进行基因或基因簇定点敲除的crispr-cas系统，由如下b1)-b3)组成：
43.b1)地中海富盐菌内源的cas蛋白复合体；
44.b2)前文第二方面中所述的表达盒或含有所述表达盒的重组载体；
45.b3)前文第二方面中所述的同源臂或含有所述同源臂的重组载体。
46.(b3)一种对地中海富盐菌进行基因组精简(删除非必需基因)的crispr-cas系统，由如下c1)-c3)组成：
47.c1)地中海富盐菌内源的cas蛋白复合体；
48.c2)前文第三方面中所述的表达盒或含有所述表达盒的重组载体；
49.c3)能够抑制所述地中海富盐菌受体菌株中reca基因的表达的物质。
50.进一步地，能够抑制所述地中海富盐菌受体菌株中reca基因的表达的物质为前文第三方面中所述能够表达靶向reca基因的crrna的表达盒或含有所述表达盒的重组载体。
51.其中，所述地中海富盐菌内源的cas蛋白复合体为本领域所公知，具有由cas1,cas2,cas4,cas5,cas7,cas8,cas6和具有双向dna切割活性的cas3蛋白组成。
52.第五方面，本发明要求保护一种提高地中海富盐菌发酵生产聚羟基丁酸羟基戊酸酯(phbv)产量的方法。
53.本发明要求保护的提高地中海富盐菌发酵生产phbv产量的方法，可包括如下步骤：采用前文第二方面中所述方法定点敲除地中海富盐菌受体菌株的鞭毛基因簇(hfx_1210-hfx_1234共25个基因，共24,878bp；所在基因组在ncbi上的序列号为cp001868，该鞭毛基因簇序列位置为1146746-1171623)，得到重组地中海富盐菌；相比所述地中海富盐菌受体菌株，所述重组地中海富盐菌发酵生产phbv产量提高。
54.进一步地，定点敲除所述地中海富盐菌受体菌株的鞭毛基因簇是通过向所述地中海富盐菌受体菌株中导入cr-fla-d3tc片段(3个串联的前文第二方面中所述表达盒)、上游同源臂fla-u和下游同源臂fla-d实现的；所述cr-fla-d3tc片段的序列如seq id no.5所示；所述上游同源臂fla-u的序列如seq id no.6所示；所述下游同源臂fla-d的序列如seq id no.7所示。
55.第六方面，本发明要求保护一套用于生产phbv的产品。
56.本发明要求保护的用于生产phbv的产品，可包括如下：
57.(c1)地中海富盐菌受体菌株；
58.(c2)前文第五方面中所述的cr-fla-d3tc片段，或含有所述cr-fla-d3tc片段的重组载体；
59.(c3)前文第五方面中所述的上游同源臂fla-u和所述下游同源臂fla-d，或含有所述上游同源臂fla-u和所述下游同源臂fla-d的重组载体。
60.第七方面，本发明要求保护一种重组地中海富盐菌。
61.本发明所要求保护的重组地中海富盐菌具体为前文第五方面中所述的重组地中海富盐菌。
62.在上述各方面中，所述地中海富盐菌受体菌株为具有正常的内源cas蛋白复合体的菌株(如cas3未被敲除)。在前文第三方面中，所述地中海富盐菌受体菌株优选可为敲除了基因组中鞭毛基因簇后的地中海富盐菌。其中，敲地中海富盐菌基因组中鞭毛基因簇的方法可参见前文第五方面中所述。
63.在本发明具体实施方式中，所述地中海富盐菌受体菌株为地中海富盐菌δepsδ123。
64.本发明首次公开了一种利用i型crispr-cas系统实现地中海富盐菌双基因同时删除以及基因组精简的方法。当提供同源臂时，结合同源重组修复系统，crispr-cas系统可以实现对靶标的精确编辑；若同时提供靶向两个位点的spacer及其同源臂，则可实现双基因同时敲除；当靶向大片段目的基因时，通过增加靶向crrna的数量以提高大片段的敲除效率。当不提供同源臂时，依据cas3效应蛋白双向切割的特性以及微同源末端修复系统，crispr-cas系统可以实现对基因组上靶向位置周围的非必需基因的连续删除获得精简基因组；对同源重组修复系统进行抑制，可以提高该方法对基因组精简的效率。同时，通过该基因编辑工具敲除了地中海富盐菌中鞭毛基因簇，获得一株phbv产量提高了23.18％、基因组精简了1.11％的基因工程菌株δepsδ123δfla。
附图说明
65.图1为pwl502-phaj-zh1-d2tc质粒(a)，pwl502-rcrti-tc质粒(b)，pwl502-ri-ia质粒(c)，pwl502-fla-dtc质粒(d)，pwl502-fla-d2tc质粒(e)和pwl502-fla-d3tc质粒(f)结构示意图。
66.图2为本发明实施例1实验结果图。a、b、c为三组生物学重复，pcr验证phaj基因敲除结果，显示phaj为100％敲除。d、e、f为三组生物学重复，pcr验证pha zh1基因敲除结果，显示phaj为40％
±
17％的敲除效率。
67.图3为本发明实施例2实验结果图。a、b、c分别为三个质粒pwl502-fla-dtc、pwl502-fla-d2tc和pwl502-fla-d3tc转化δepsδ123菌株后筛选克隆验证鞭毛基因簇敲除的pcr结果。
68.图4为本发明实例3实验结果图。a为菌株生长od600检测，反映了菌体生物量积累情况；b为菌株phbv质量占细胞干重的百分含量，cdw以及phbv产量的比较。
69.图5为本发明实施例4靶向crti以删除周围非必需基因的筛选结果图。
70.图6为本发明实施例4实验结果图。ireca工具验证及提高随机非定向删除非必需基因的效率结果图。a为qpcr检测抑制reca基因表达效率的结果；b为带有ireca工具及靶向crti敲除模块的载体转化菌株后所得转化子。
具体实施方式
71.下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
72.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
73.下述实施例中所用到的培养基具体如下：
74.(1)mg-lp培养基配方：nacl 110g；mgso
4 29.52g；mgcl
2 20.51g；cacl
2 1g；kcl 5g；nh4cl 2g；glucose 10g；kh2po
4 0.01875g；mncl2·
4h2o 0.36mg；feso4·
7h2o50mg；pipes 15g；dh2o至1l，ph调至7.0-7.2(用naoh调整)。可添加1.2％的琼脂粉制成固体平板培养基。
75.灭菌条件：115℃，30min。
76.(2)ms培养基配方：nacl 110g；mgcl2·
6h2o 20.51g；mgso4·
7h2o
77.29.52g；cacl
2 1g；kcl 5g；nh4cl 2g；kh2po
4 0.0375g；yeast extract 3g；淀粉20g；mncl2·
4h2o 0.36mg；feso4·
7h2o 50mg；pipes 15g；dh2o至1l，ph调至7.0-7.2(用naoh调整)。可添加1.2％的琼脂粉制成固体平板培养基。
78.灭菌条件：115℃，30min。
79.下述实施例中所涉及的生物材料：
80.(1)地中海富盐菌δepsδ123：记载于“yang h,chen j,mitra r,xue q,xiang h,han j.2022.replication origin deletion enhances poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate)synthesis in haloarchaea.microbiol spectr 0:e0214922.”一文，公众可从申请人处获得，仅可用于重复本发明实验使用，不得他用。
81.(2)pwl502载体：记载于“chen j,mitra r,zhang s,zuo z,lin l,zhao d,xiang h,han j.2019.unusual phosphoenolpyruvate(pep)synthetase-like protein crucial to enhancement of polyhydroxyalkanoate accumulation in haloferax mediterranei revealed by dissection of pep-pyruvate interconversion mechanism.appl environ microbiol 85.”一文，公众可从申请人处获得，仅可用于重复本发明实验使用，不得他用。
82.下述实施例中所用到的引物序列如表1所示。
83.表1、本发明的引物序列
84.85.[0086][0087]
实施例1、利用地中海富盐菌内源crispr-cas系统同时靶向地中海富盐菌δepsδ123菌株的phaj和phazh1基因，实现双基因同时敲除。
[0088]
(1)同时含有靶向phaj和phazh1基因的spacer的crrna表达质粒pwl502-phaj-zh1-d2tc的构建
[0089]
①
在phaj基因(hfx_5217)和phazh1基因(hfx_6464)的模板连和编码链上分别寻找pam序列5
’‑
ttg-3’。选择紧邻pam的下游36nt作为protospacer序列，以此确定spacer序列。然后将强组成型启动子p
phar
(54nt，如seq id no.1所示)、由spacer序列间隔的两个相同的repeat序列(30nt，如seq id no.2所示)和t8终止子(8nt)合成为mini-crispr结构。该mini-crispr由4个spacer和5个repeat串联组成，同时靶向phaj的模板链和编码链，及phazh1的模板链和编码链。人工mini-crispr结构安升达公司合成，其序列如下：
[0090]
cr-phaj-zh1-d2tc(5
’‑3’
)：
[0091]
aatggtgtcgaagggaacatatatgttactgcaggtacaacaccgagttaggag-gttacagacgaaccctagttgggttgaagcaggcgaatcgagcgacactcgcagccttaggtctcagttacagacgaaccctagttgggttgaagccacaggattcaggaaccgcatgtcctgagagagatagttacagacgaaccctagttgggttgaagccctgtcaaggcggcggcagtcacacggcattcaccggttacagacgaaccctagttgggttgaagcttcacccaggtccattagctcctgtaagaacgccgggttacagacgaaccctagttgggttgaagc-tttttttt
[0092]
该序列中，前54nt为启动子p
phar
序列，后8nt为t8终止子，五处下划线部分为5个repeat序列，每两个repeat之间的为spacer序列。第一个spacer靶向phaj基因的模板链，第二个spacer靶向phaj基因的编码链，第三个spacer靶向phazh1基因的模板链，第四个spacer靶向phazh1基因的编码链。
[0093]
②
设计phaj基因和phazh1基因的上下游同源臂，分别记为phaj-ud和phazh1-ud
[0094]
分别使用引物对j-uf/j-ur,j-df/j-dr,zh1-uf/zh1-ur和zh1-df/zh1-dr,以地中海富盐菌δepsδ123菌株基因组为模板通过高保真酶pcr获得目标基因上下游同源臂片段。其中，引物对j-uf/j-ur用于扩增phaj基因上游同源臂，记为phaj-u。引物对j-df/j-dr用于扩增phaj基因下游同源臂，记为phaj-d。引物对zh1-uf/zh1-ur用于扩增phazh1基因上游同源臂，记为phazh1-u。引物对zh1-df/zh1-dr用于扩增phazh1基因下游同源臂，记为phazh1-d。
[0095]
③
用引物对cr-phaj-zh1-f/r将合成的mini-crispr结构进行扩增，利用多片段同源重组酶将该片段与phaj-u、phaj-d和phazh1-u、phazh1-d同时克隆至经bamhi和kpni双酶切的pwl502，构建了crrna表达质粒，记为pwl502-phaj-zh1-2dtc(图1中a)，经测序验证质粒构建正确。
[0096]
(2)crrna表达质粒转化地中海富盐菌
[0097]
上述质粒转化到e.coli jm110中进行去甲基化，提取质粒再转化到地中海富盐菌δepsδ123中，在不含尿嘧啶的mg-lp平板培养基上培养4天左右。
[0098]
(3)phaj基因和phazh1基因敲除验证
[0099]
分别设计两个基因外引物和内部引物进行敲除验证，分别记为j-uuf/j-ddr(phaj基因未敲除情况下理论产物大小为1764bp)和j-f1/j-r1(phaj基因未敲除情况下理论产物大小为272bp)，以及zh1-uuf/zh1-ddr(phazh1基因未敲除情况下理论产物大小为2195bp)和zh1-f1/zh1-r1(phazh1基因未敲除情况下理论产物大小为514bp)。其中，当phaj基因敲除时，引物j-uuf/j-ddr pcr获得目的条带为1104bp，而内部引物无目的条带；当phazh1基因敲除时，引物zh1-uuf/zh1-ddr pcr获得目的条带为1229bp，而内部引物无目的条带。结果如图2所示，a、b、c为phaj基因敲除验证结果，显示phaj为100％敲除。d、e、f为phazh1基因敲除验证结果，显示phaj为40％
±
17％的敲除效率。
[0100]
实施例2、利用地中海富盐菌内源crispr-cas系统靶向鞭毛基因簇，实现大片段鞭毛基因簇高效敲除。
[0101]
(1)含有靶向鞭毛基因簇的spacer的crrna表达质粒pwl502-fla-dtc、pwl502-fla-d2tc和pwl502-fla-d3tc的构建
[0102]
①
在鞭毛基因簇(hfx_1210-hfx_1234共25个基因，共24,878bp；所在基因组在ncbi上的序列号为cp001868，该鞭毛基因簇序列位置为1146746-1171623)的模板连和编码链上分别寻找pam序列5
’‑
ttg-3’。选择紧邻pam的下游36nt作为protospacer序列，以此确定spacer序列。然后将强组成型启动子p
phar
(54nt，如seq id no.1所示)、由spacer序列间隔的两个相同的repeat序列(30nt，如seq idno.2所示)和t8终止子(8nt)合成为mini-crispr结构。该mini-crispr由2个spacer和3个repeat串联组成，同时靶向鞭毛基因簇的模板链和编码链。人工mini-crispr结构安升达公司合成，其序列如下：
[0103]
一个mini-crispr结构片段，cr-fla-dtc(5
’‑3’
)：
[0104]
aatggtgtcgaagggaacatatatgttactgcaggtacaacaccgagttaggag-gttacagacgaacc ctagttgggttgaagcccccgcggccgccgagtcgttcgacgagatgggtacgttacagacgaaccctagttg ggttgaagcatgacgccctcgatagattcgtccttttcgagcggcgttacagacgaaccctagttgggttgaa gc-tttttttt
[0105]
该序列中，前54nt为启动子p
phar
序列，后8nt为t8终止子，三处下划线部分为3个repeat序列，每两个repeat之间的为spacer序列。第一个spacer靶向鞭毛基因簇模板链位置1，第二个spacer靶向鞭毛基因簇编码链位置1。
[0106]
两个串联的mini-crispr结构片段，cr-fla-d2tc(5
’‑3’
)：
[0107]
aatggtgtcgaagggaacatatatgttactgcaggtacaacaccgagttaggag-gttacagacgaacc ctagttgggttgaagcgctcgagcggagtgcctccgacgcctcctgtcggttgttacagacgaaccctagttg ggttgaagcatacgcgacccgtcggggagggtcgagtcgacgatggttacagacgaaccctagttgggttgaa gc-tttttttt-aatggtgtcgaagggaacatatatgttactgcaggtacaacaccgagttaggag-gttaca gacgaaccctagttgggttgaagcatgctgtcgactgtcagctcacttccggtatcgttggttacagacgaac cctagttgggttgaagcgcgagcgtcatcttcttcgaggttctcgaacggactgttacagacgaaccctagtt gggttgaagc-tttttttt
[0108]
该串联mini-crispr序列中，每个串联的mini-crispr结构组成与cr-fla-dtc相同，在spacer序列上不同。第一个mini-crispr的spacer分别靶向鞭毛基因簇的模板链位置2和编码链位置2；第二个mini-crispr的spacer分别靶向鞭毛基因簇的模板链位置3和编码链位置3。
[0109]
三个串联的mini-crispr结构片段，cr-fla-d3tc(5
’‑3’
)：
[0110]
aatggtgtcgaagggaacatatatgttactgcaggtacaacaccgagttaggag-gttacagacgaacc ctagttgggttgaagcccccgcggccgccgagtcgttcgacgagatgggtacgttacagacgaaccctagttg ggttgaagcatgacgccctcgatagattcgtccttttcgagcggcgttacagacgaaccctagttgggttgaa gc-tttttttt-aatggtgtcgaagggaacatatatgttactgcaggtacaacaccgagttaggag-gttaca gacgaaccctagttgggttgaagcatgctgtcgactgtcagctcacttccggtatcgttggttacagacgaac cctagttgggttgaagcgcgagcgtcatcttcttcgaggttctcgaacggactgttacagacgaaccctagtt gggttgaagc-tttttttt-aatggtgtcgaagggaacatatatgttactgcaggtacaacaccgagttagga g-gttacagacgaaccctagttgggttgaagcgctcgagcggagtgcctccgacgcctcctgtcggttgttac agacgaaccctagttgggttgaagcatacgcgacccgtcggggagggtcgagtcgacgatggttacagacgaa ccctagttgggttgaagc-tttttttt(seq id no.5)
[0111]
该序列中，三个个串联的mini-crispr结构片段分别为cr-fla-dtc(5
’‑3’
)和cr-fla-d2tc(5
’‑3’
)的mini-crispr结构片段的串联组合，记为cr-fla-d3tc(5
’‑3’
)。
[0112]
②
设计鞭毛基因簇的上下游同源臂
[0113]
分别使用引物对fla-uf/fla-ur和fla-df/fla-dr,以地中海富盐菌基因组为模板，通过高保真酶pcr获得目标基因上下游同源臂片段。其中，引物对fla-uf/fla-ur用于扩增鞭毛基因簇上游同源臂，记为fla-u。引物对fla-df/fla-dr用于扩增鞭毛基因簇上游同源臂，记为fla-d。
[0114]
其中，上游同源臂fla-u的序列如seq id no.6所示，下游同源臂fla-d的序列如seq id no.7所示。
[0115]
③
用引物cr-fla-f/r分别将合成的3种mini-crispr结构进行扩增，采用多片段同源重组酶将mini-crispr结构片段与fla-u、fla-d克隆至经bamhi和kpni双酶切的pwl502，构建了crrna表达质粒，分别记为pwl502-fla-dtc、pwl502-fla-d2tc和pwl502-fla-d3tc(图1中d、e和f)，经测序验证质粒构建正确。
[0116]
(2)crrna表达质粒转化地中海富盐菌
[0117]
上述3种质粒分别转化到e.coli jm110中进行去甲基化，提取质粒再转化到地中海富盐菌δepsδ123中，在不含尿嘧啶的mg-lp平板上培养4天左右。
[0118]
(3)鞭毛基因簇敲除验证
[0119]
分别设计鞭毛基因簇外引物和内部引物进行敲除验证，分别记为fla-uuf/fla-ddr(鞭毛基因簇未被敲除的情况下理论产物大小为26,501bp)和fla-f1/fla-r1(鞭毛基因簇未被敲除的情况下理论产物大小为529bp)。当鞭毛基因簇敲除时，引物fla-uuf/fla-ddr获得目的条带为1623bp，而内部引物fla-f1/fla-r1无目的条带。结果如图3所示，a、b、c分别为三个质粒pwl502-fla-dtc、pwl502-fla-d2tc和pwl502-fla-d3tc转化δepsδ123菌株获得的克隆进行鞭毛基因簇敲除pcr验证结果，显示鞭毛基因簇敲除的效率分别为0、5％和45％。结果显示，增加靶向crrna的数量可以提高大片段基因的敲除效率。此次获得的鞭毛基因簇敲除菌株记为δepsδ123δfla。
[0120]
实施例3、利用地中海富盐菌内源crispr-cas系统实现鞭毛基因簇的敲除，可以有效提高地中海富盐菌发酵生产phbv的产量
[0121]
采用ms培养基在250ml摇瓶里培养菌体至葡萄糖耗尽，培养条件为37℃，200rpm摇
床培养。以δepsδ123菌株为对照，检测实施例2构建的δepsδ123δfla菌株的生长情况、葡萄糖消耗情况和phbv积累情况。
[0122]
生长情况检测：每隔24h取样，在600nm波长下检测菌液的吸光度。
[0123]
葡萄糖消耗情况检测：每隔24h取样，12,000rpm，3min离心收集上清，吸取50μl上清，加950μl蒸馏水稀释，取25μl用测糖仪(sba-40d，china)检测，测得的葡萄糖浓度乘以稀释倍数(20倍)即为培养基中的葡萄糖浓度。标液为1g/l的葡萄糖溶液。
[0124]
phbv积累情况检测：取培养120h的菌液进行phbv检测，具体方法如下：
[0125]
(1)离心收集20-50ml菌液，冷冻干燥后称重并记录准确数值，取50mg左右干菌体于酯化管中；
[0126]
(2)配制酯化液：在甲醇和浓硫酸(体积比97:3)混合液中溶解1g/l的苯甲酸(内标)；
[0127]
(3)加入2ml酯化液和2ml三氯甲烷至酯化管中，100℃酯化4h；
[0128]
(4)自然冷却，加入1ml蒸馏水振荡混匀，静置分层；
[0129]
(5)取下层氯仿相进行气相色谱分析。使用agilent gc6820气相色谱仪，进样量1μl，设定柱温为200℃，进样器温度为200℃，检测器温度为220℃，柱长30m，柱头压力为0.25mpa。程序升温条件为：80℃维持1.5min后，以30℃/min的速度升温至140℃，再以40℃/min的速度升温至220℃并在此温度保持0.5min。
[0130]
发酵结果显示，相比对照菌株δepsδ123，鞭毛基因簇敲除菌株δepsδ123δfla具有更快的生物量积累速度(图4中a)。在培养120h时两株菌都耗完了所有的葡萄。相比对照菌株δepsδ123，δepsδ123δfla菌株的细胞干重和phbv积累量均有明显的提升(见图4中b)，其细胞干重由对照菌的16.02g/l提高到了17.44g/l，phbv产量由7.55g/l增加到了9.3g/l，phbv产量相比对照菌提高了23.18％。
[0131]
实施例4、利用地中海富盐菌内源crispr-cas系统实现非必需基因的大片段删除，实现基因组精简
[0132]
(1)含有靶向crti基因spacer的crrna表达质粒pwl502-rcrti-tc和pwl502-ri-ia的构建
[0133]
①
在crti基因(hfx_2550，所在基因组信息在ncbi上的序列号为cp001868)的模板连和编码链上分别寻找pam序列5
’‑
ttg-3’。选择紧邻pam的下游36nt作为protospacer序列，以此确定spacer序列。然后将强组成型启动子p
phar
(54nt，如seq id no.1所示)、由spacer序列间隔的两个相同的repeat序列(30nt，如seq id no.2所示)和t8终止子(8nt)合成为mini-crispr结构。该mini-crispr由2个spacer和3个repeat串联组成，靶向crti的模板链和编码链。人工mini-crispr结构安升达公司合成，其序列如下：
[0134]
cr-crti-tc(5
’‑3’
)：
[0135]
aatggtgtcgaagggaacatatatgttactgcaggtacaacaccgagttaggag-gttacagacgaacc ctagttgggttgaagccgggtcggcgcggcgggttcgccgtccgtacagagggttacagacgaaccctagttg ggttgaagcaagtcgacgtggctcatgagattgtagagcgcgggcgttacagacgaaccctagttgggttgaa gc-tttttttt
[0136]
该序列中，前54nt为启动子p
phar
序列，后8nt为t8终止子，三处下划线部分为3个repeat序列，每两个repeat之间的为spacer序列。第一个spacer靶向crti基因的模板链，第
二个spacer靶向crti基因的编码链。
[0137]
②
在reca基因(hfx_0116，具体序列如seq id no.3所示)的编码链上分别寻找pam序列5
’‑
ttg-3’。选择紧邻pam的下游24nt作为protospacer序列，以此确定spacer序列。然后将强组成型启动子p
phar
(54nt，如seq id no.1所示)、由spacer序列间隔的两个相同的repeat序列(30nt，如seq id no.2所示)和t8终止子(8nt)合成为mini-crispr结构。该mini-crispr由1个spacer和2个repeat串联组成，靶向reca的编码链。人工mini-crispr结构安升达公司合成，其序列如下：
[0138]
cr-ireca-24c(5
’‑3’
)：
[0139]
aatggtgtcgaagggaacatatatgttactgcaggtacaacaccgagttaggag-gttacagacgaacc ctagttgggttgaagccggcgtcggcccggctaccgccgagttacagacgaaccctagttgggttgaagc-tt tttttt(seq id no.4)
[0140]
该序列中，前54nt为启动子p
phar
序列，后8nt为t8终止子，两处下划线部分为3个repeat序列，每两个repeat之间的为spacer序列。
[0141]
③
用引物对cr-crti-f/r和cr-ireca-f/r分别将上述合成的2个mini-crispr结构进行扩增。然后利用单片段同源重组酶将cr-crti-tc扩增产物单独克隆至经bamhi和kpni双酶切的pwl502，构建了crrna表达质粒，记为pwl502-rcrti-tc质粒(图1中b)，经测序验证质粒构建正确。利用多片段同源重组酶将cr-crti-tc扩增产物和cr-ireca-24c扩增产物串联组合克隆至经bamhi和kpni双酶切的pwl502，构建了crrna表达质粒，记为pwl502-ri-ia质粒(图1中c)，经测序验证质粒构建正确。
[0142]
(2)crrna表达质粒转化地中海富盐菌
[0143]
上述质粒分别转化到e.coli jm110中进行去甲基化，提取质粒再转化到地中海富盐菌δepsδ123δfla中，在不含尿嘧啶的mg-lp平板上培养4天左右。
[0144]
(3)以crti基因为中心非必需基因大片段敲除验证
[0145]
设计以crti基因为中心的外引物进行敲除验证，记为crti-uuf/crti-ddr(crti基因未被敲除的情况下理论产物大小为27,158bp)，pcr后获得不同大小的目的片段，回收目的片段后测序。pwl502-rcrti-tc质粒转化δepsδ123δfla菌株获得白色转化子的比例为1.25％(14/800)。经pcr及测序检测共获得9种缺失片段：0.797kb，1.41kb，2.754kb，3.143kb，6.344kb，6.391kb，7.094kb，18.58kb，24.7kb(图5)，且最大缺失片段紧邻必需基因。结果显示，该方法可以实现地中海富盐菌的非必需基因大片段敲除，但效率较低。其中δepsδ123δflaδri18菌株(18.58kb大片段删除株)可通过连续传代获得纯合子。相比于δepsδ123菌株，该菌株基因组精简了1.11％。
[0146]
(4)ireca工具提高非必需基因大片段敲除效率
[0147]
设计reca基因内部引物对reca-f1/r1和reca-f2/r2，通过qrt-pcr验证reca基因的转录情况。如图6中a所示，crnt表示non-target序列，作为对照。该结果标明，ireca工具对reca基因的转录抑制效果最强可达80.89％。
[0148]
其中，crnt序列如下：
[0149]
aatggtgtcgaagggaacatatatgttactgcaggtacaacaccgagttaggag-gttacagacgaacc ctagttgggttgaagcctggagttgtcccaattcttgttgaattagatggtgttacagacgaaccctagttgg gttgaagc-tttttttt
[0150]
该序列中，前54nt为启动子p
phar
序列，后8nt为t8终止子，两处下划线部分为3个repeat序列，每两个repeat之间的为spacer序列，不靶向地中海富盐菌基因组任何序列。
[0151]
如图6中b所示，pwl502-ri-ia质粒转化δepsδ123δfla菌株后，白色转化子的比例可达59.37％(19/32)，比pwl502-rcrti-tc质粒的敲除效果高了46.5倍。说明ireca工具提高非必需基因大片段敲除效率。
[0152]
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本技术欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本技术中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。

技术特征：
1.一种对地中海富盐菌进行基因编辑的方法，包括如下步骤：向地中海富盐菌受体菌株中导入能够表达靶向目的区域的crrna的表达盒，从而实现对所述目的区域的编辑；所述表达盒由如下(1)-(3)顺次连接而成：(1)pphar启动子；(2)由n个spacer序列间隔的n+1个相同的repeat序列；n为大于等于1的正整数；(3)终止子序列；所述pphar启动子序列如seq id no.1所示；所述repeat序列如seq id no.2所示；所述spacer序列靶向所述目的区域。2.一种对地中海富盐菌进行基因或基因簇定点敲除的方法，包括如下步骤：向地中海富盐菌受体菌株中导入能够表达靶向目的基因或目的基因簇的crrna的表达盒和用于敲除所述目的基因或所述目的基因簇的上下游同源臂，从而实现定点敲除所述目的基因或所述目的基因簇；所述表达盒由如下(1)-(3)顺次连接而成：(1)pphar启动子；(2)由n个spacer序列间隔的n+1个相同的repeat序列；n为大于等于1的正整数；(3)终止子序列；所述pphar启动子序列如seq id no.1所示；所述repeat序列如seq id no.2所示；所述spacer序列靶向所述目的基因或所述目的基因簇的编码区或启动子区；所述同源臂为在所述地中海富盐菌受体菌株基因组中位于所述目的基因或所述目的基因簇的上下游的序列；导入所述地中海富盐菌受体菌株中的所述表达盒为1个或1个以上，如2-3个；所述目的基因为1个或1个以上，如2个。3.一种对地中海富盐菌进行基因组精简的方法，包括如下步骤：抑制地中海富盐菌受体菌株中reca基因的表达，并向其中导入能够表达靶向目的区域的crrna的表达盒，从而删除地中海富盐菌基因组上靶向位置周围的非必需基因，进而实现对基因组的精简；所述表达盒由如下(1)-(3)顺次连接而成：(1)pphar启动子；(2)由n个spacer序列间隔的n+1个相同的repeat序列；n为大于等于1的正整数；(3)终止子序列；所述pphar启动子序列如seq id no.1所示；所述repeat序列如seq id no.2所示；所述spacer序列靶向所述目的区域。4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：所述spacer序列的长度为36nt；和/或所述表达盒通过含有所述表达盒的重组载体导入所述地中海富盐菌受体菌株；和/或所述同源臂通过含有所述同源臂的重组载体导入所述地中海富盐菌受体菌株。5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：抑制所述地中海富盐菌受体菌株中reca基因的表达是通过向所述地中海富盐菌受体菌株中导入能够表达靶向reca基因的crrna的表达盒实现的；和/或所述reca基因序列如seq id no.3所示；和/或
所述能够表达靶向reca基因的crrna的表达盒的序列如seq id no.4所示。6.crispr-cas系统，为如下任一：(b1)一种用于对地中海富盐菌进行基因编辑的crispr-cas系统，由如下a1)和a2)组成：a1)地中海富盐菌内源的cas蛋白复合体；a2)权利要求1或4中所述的表达盒组成或含有所述表达盒的重组载体；(b2)一种对地中海富盐菌进行基因或基因簇定点敲除的crispr-cas系统，由如下b1)-b3)组成：b1)地中海富盐菌内源的cas蛋白复合体；b2)权利要求2或4中所述的表达盒或含有所述表达盒的重组载体；b3)权利要求2中所述的同源臂或含有所述同源臂的重组载体；(b3)一种对地中海富盐菌进行基因组精简的crispr-cas系统，由如下c1)-c3)组成：c1)地中海富盐菌内源的cas蛋白复合体；c2)权利要求3或4中所述的表达盒或含有所述表达盒的重组载体；c3)能够抑制所述地中海富盐菌受体菌株中reca基因的表达的物质；进一步地，能够抑制所述地中海富盐菌受体菌株中reca基因的表达的物质为权利要求5中所述能够表达靶向reca基因的crrna的表达盒或含有所述表达盒的重组载体。7.一种提高地中海富盐菌发酵生产phbv产量的方法，包括如下步骤：采用权利要求2或4所述方法定点敲除地中海富盐菌受体菌株的鞭毛基因簇，得到重组地中海富盐菌；相比所述地中海富盐菌受体菌株，所述重组地中海富盐菌发酵生产phbv产量提高；其中，所述鞭毛基因簇共24,878bp，所在基因组在ncbi上的序列号为cp001868，所述鞭毛基因簇的序列位置为第1146746-1171623位；进一步地，定点敲除所述地中海富盐菌受体菌株的鞭毛基因簇是通过向所述地中海富盐菌受体菌株中导入cr-fla-d3tc片段、上游同源臂fla-u和下游同源臂fla-d实现的；所述cr-fla-d3tc片段的序列如seq id no.5所示；所述上游同源臂fla-u的序列如seq id no.6所示；所述下游同源臂fla-d的序列如seq id no.7所示。8.一套用于生产phbv的产品，包括如下：(c1)地中海富盐菌受体菌株；(c2)权利要求7中所述的cr-fla-d3tc片段，或含有所述cr-fla-d3tc片段的重组载体；(c3)权利要求7中所述的上游同源臂fla-u和所述下游同源臂fla-d，或含有所述上游同源臂fla-u和所述下游同源臂fla-d的重组载体。9.权利要求7中所述的重组地中海富盐菌。10.根据权利要求1-9中任一所述的方法或crispr-cas系统或产品或重组地中海富盐菌，其特征在于：所述地中海富盐菌受体菌株为地中海富盐菌δepsδ123。

技术总结
本发明公开了一种利用地中海富盐菌CRISPR-Cas系统实现基因编辑及提高PHBV产量的方法。本发明基因编辑方法包括：向地中海富盐菌导入能表达靶向目的区域的crRNA表达盒(由PphaR启动子(SEQ ID No.1)、N个spacer序列(靶向所述目的区域)间隔的N+1个相同的repeat序列(SEQ ID No.2)和终止子组成)。有同源臂时，结合同源重组修复系统，可实现靶标精确编辑；增加crRNA数量可提高大片段删除效率。无同源臂时，依据Cas3效应蛋白双向切割特性及微同源末端修复系统，可实现基因组靶向位置周围非必需基因连续删除获得精简基因组。抑制同源重组修复系统，可提高基因组精简效率。可提高基因组精简效率。


技术研发人员：向华 陈军玉 韩静 徐桐
受保护的技术使用者：中国科学院微生物研究所
技术研发日：2023.03.20
技术公布日：2023/9/26