铁蛋白示踪多肽缀合物及其用途的制作方法

1.本公开属于生物医学领域，涉及一种包含铁蛋白重链亚基突变体的多肽缀合物及其在示踪上的用途，具体地，涉及用于铁蛋白纳米造影剂及其制备方法，以及其在肿瘤外科手术中淋巴结染色和影像学诊断中的应用。


背景技术：

2.前哨淋巴结(sln)是指某器官的具体部位发生原发肿瘤，肿瘤细胞最早侵犯的第一站淋巴结。前哨淋巴结活检是评估早期乳腺癌腋窝淋巴结转移状态的可靠方法。选择合适的前哨淋巴结示踪技术是术中精准寻找前哨淋巴结的关键，提高前哨淋巴结的检出率、降低假阴性率可减少患者腋窝损伤。前哨淋巴结示踪方法主要有染料法(包括蓝染料和荧光染料等)、纳米炭法、放射性核素法、超顺磁氧化铁及上述染色剂的联合示踪法。蓝染料法成本低廉，应用广泛，但易出现跃迁。纳米炭法生物相容性高，但需严格把握染色时间。超顺磁氧化铁的检出率与假阴性率均与标准的联合法相似，但对手术器械材质要求高。荧光染料法可实时成像，敏感性高，但术中操作繁琐。目前最常用的荧光染料为吲哚菁绿(indocyanine green，icg)，是一种高灵敏近红外荧光素，其已经被美国fda批准用于临床。但其对淋巴结的显像也存在明显的局限性，一是icg缺乏特异性，无法区分肿瘤转移的前哨淋巴结与炎性增生的次级淋巴结；二是icg在手术过程中淬灭的问题也影响了其准确性。核素法检出率高，但肉眼无法直接识别。
3.目前仍旧缺乏能够快速、安全、低损伤、准确的在肿瘤外科手术中示踪前哨淋巴结的有效方法。而铁蛋白(ferritin)是一种大约450kda的大蛋白，由24个亚基自组装成球形笼状结构，其内部和外部尺寸分别为大约8nm和大约12nm。由于铁蛋白具有能与转铁蛋白受体(tfr1)结合的活性，而tfr1被发现在多种肿瘤细胞中高表达，具有主动靶向性。同时其又具备尺寸小的特点，能到达肿瘤组织深处，因此本领域已经尝试将铁蛋白在肿瘤领域中用作各种生活活性分子的运送载体，发挥诊断，影像示踪及治疗作用。铁蛋白作为运送载体的递送方式分为两种，一是将生物活性分子，如小分子药物阿霉素装载在笼状空腔内；另一种递送方式是可将生物活性分子偶联在铁蛋白外表面，该方式与包载于铁蛋白内腔的内包方式相比，可载带的生物活性分子类型更多，且不受铁蛋白内部空间的限制，也无需考虑到达靶部位后，如何将笼内分子释放方式等问题，因此该递送方式具备更广阔的应用前景。
4.目前文献报道的铁蛋白外表面偶联生物活性分子的方法可以通过生物学方式，也可通过化学方式。相对于繁复的生物学构建方式，用化学方法将生物活性分子偶联到铁蛋白外表面则更方便灵活，可通过各种化学反应高通量、快速的将各种生物活性分子偶联在铁蛋白表面，并可同时偶联多种功能分子。化学偶联法的关键在于提供优化的，适用于化学偶联场景的铁蛋白突变体。因为虽然野生型铁蛋白与其它载体蛋白相比，其已然具有良好的ph和温度稳定性，且易于用原核表达的方式方便的大规模制备，但其在化学反应条件中仍无法避免的出现易聚合、易生成杂质、偶联效率低(键合率低)、偶联产物不稳定等问题。而目前对于适用于化学偶联场景的铁蛋白突变体的研究和开发甚少，本领域对此有迫切的
需求。将铁蛋白突变体与不同的生物活性分子偶联，可以在肿瘤治疗、诊断或示踪中发挥积极作用。
5.发明概述
6.本公开构建了成药性、稳定性和偶联效果更好的铁蛋白突变体多肽，并用化学偶联方式将突变体多肽与前哨淋巴结显像分子缀合，获得的突变体多肽缀合物以及笼状蛋白，能解决目前哨淋巴结示踪技术存在的有效剂量高、分辨率低、易淬灭的问题，为肿瘤诊断和手术操作中对前哨淋巴区域的定位提供了更灵敏、准确、安全、损伤小的显像剂。
7.在第一方面，本公开提供铁蛋白h亚基突变体多肽，其相对于野生型铁蛋白h亚基，包含在对应于seq id no:1的第98位、第108位、和/或第156位的位置处的氨基酸取代。
8.在某些实施方式中，所述的突变体多肽，相对于野生型铁蛋白h亚基，所述突变体多肽在对应于seq id no:1的第98位、第108位、和/或第156位的位置处的氨基酸被亲水性更高的氨基酸例如带羧基侧链的氨基酸取代。
9.在某些实施方式中，所述的突变体多肽，其中所述带羧基侧链的氨基酸选自谷氨酸(e)、天冬氨酸(d)或组氨酸(h)。
10.在某些实施方式中，所述的突变体多肽在对应于seq id no:1的第98位的位置处的氨基酸例如天冬酰胺(n)被天冬氨酸(d)取代。
11.在某些实施方式中，所述的突变体多肽在对应于seq id no:1的第108位的位置处的氨基酸例如赖氨酸(k)被谷氨酸(e)取代。
12.在某些实施方式中，所述的突变体多肽在对应于seq id no:1的第156位的位置处的氨基酸例如精氨酸(r)被组氨酸(h)取代。
13.在某些实施方式中，所述的突变体多肽在对应于seq id no:1的第98位的位置处的氨基酸例如天冬酰胺(n)被天冬氨酸(d)取代，且在对应于seq id no:1的第108位的位置处的氨基酸例如赖氨酸(k)被谷氨酸(e)取代。
14.在某些实施方式中，所述的突变体多肽在对应于seq id no:1的第98位的位置处的氨基酸例如天冬酰胺(n)被天冬氨酸(d)取代，在对应于seq id no:1的第108位的位置处的氨基酸例如赖氨酸(k)被谷氨酸(e)取代，且在对应于seq id no:1的第156位的位置处的氨基酸例如精氨酸(r)被组氨酸(h)取代。
15.在某些实施方式中，其相对于野生型铁蛋白h亚基，所述的突变体多肽包含在对应于seq id no:1的第62位和/或第65位的位置处的氨基酸取代。
16.在某些实施方式中，所述的突变体多肽在对应于seq id no:1的第62位的位置处的氨基酸例如谷氨酸(e)被取代为赖氨酸(k)。
17.在某些实施方式中，所述的突变体多肽在对应于seq id no:1的第65位的位置处的氨基酸例如组氨酸(h)被取代为甘氨酸(g)。
18.在某些实施方式中，所述的突变体多肽在对应于seq id no:1的第62位的位置处的氨基酸例如谷氨酸(e)被取代为赖氨酸(k)，且在对应于seq id no:1的第65位的位置处的氨基酸例如组氨酸(h)被取代为甘氨酸(g)。
19.在某些实施方式中，其中相对于野生型铁蛋白h亚基，所述突变体多肽包含减少的半胱氨酸。
20.在某些实施方式中，所述突变体多肽在对应于seq id no:1的第90、102和130位的
位置处的半胱氨酸的至少一个被取代。其中所述半胱氨酸被选自以下的氨基酸取代：丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、谷氨酸、天冬氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、丙氨酸、甘氨酸，优选被丝氨酸或被野生型铁蛋白轻链(l)亚基多肽相应位置处的氨基酸取代。
21.在某些实施方式中，相对于野生型铁蛋白h亚基，所述突变体多肽在对应于seq id no:1的第90位的位置处包含半胱氨酸，和在对应于seq id no:1的第102位的位置处的半胱氨酸被取代，优选被丝氨酸或丙氨酸取代，任选地，在对应于seq id no:1的第130位的位置处的半胱氨酸被取代，优选被丝氨酸或丙氨酸取代。
22.在某些实施方式中，其中相对于野生型铁蛋白h亚基，所述突变体多肽在对应于seq id no:1的第102位的位置处包含半胱氨酸，和在对应于seq id no:1的第90位的位置处的半胱氨酸被取代，优选被丝氨酸或谷氨酸取代，任选地，在对应于seq id no:1的第130位的位置处的半胱氨酸被取代，优选被丝氨酸或丙氨酸取代。
23.在某些实施方式中，其中相对于野生型铁蛋白h亚基，所述突变体多肽在loop区中包含一个半胱氨酸，在对应于seq id no:1的第102位的位置处的半胱氨酸被取代，以及任选地，在对应于seq id no:1的第130位的位置处的半胱氨酸被取代。
24.在某些实施方式中，其中除了loop区中的一个半胱氨酸和任选的在对应于seq id no:1的第130位的位置处的半胱氨酸，所述突变体多肽不包含另外的半胱氨酸。
25.在某些实施方式中，其中所述突变体多肽在loop区外不包含半胱氨酸。
26.在某些实施方式中，其中相对于野生型铁蛋白h亚基，所述突变体多肽在对应于seq id no:1的第90和102的位置处的半胱氨酸被取代，任选地，在对应于seq id no:1的第130位的位置处的半胱氨酸被取代；且所述突变体多肽在对应于seq id no:1的第79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89和91位之一的位置处的氨基酸被半胱氨酸取代。
27.在某些实施方式中，其中相对于野生型铁蛋白h亚基，所述突变体多肽在对应于seq id no:1的第90、102和130位的位置处的半胱氨酸被取代；且所述突变体多肽在对应于seq id no:1的第79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89和91位之一的位置处的氨基酸被半胱氨酸取代。
28.在某些实施方式中，其中所述突变体多肽包含选自seq id no:5-8之一的氨基酸序列。
29.在第二方面，本公开提供一种多肽缀合物，其包含第一方面所述的铁蛋白h亚基突变体多肽，和通过所述铁蛋白h亚基突变体多肽的巯基与其缀合的生物活性部分。
30.在第三方面，本公开提供一种第二方面所述的多肽缀合物的制备方法。
31.在第四方面，本公开提供一种笼状蛋白，其包含至少一个第一方面所述的铁蛋白h亚基突变体多肽，和/或至少一个第二方面所述的多肽缀合物。
32.在第五方面，本公开提供包含第一方面的所述铁蛋白h亚基突变体多肽、或第二方面所述的多肽缀合物、或第三方面所述的笼状蛋白的药物组合物。
33.在第六方面，本公开提供包含上文所述的多肽、多肽缀合物、笼状蛋白、以及药物组合物的用途。
附图说明
34.图1.示出铁蛋白h亚基突变体的蛋白表达结果。
35.图2.示出铁蛋白h亚基突变体样品的透射电镜结果。
36.图3.示出mut-hfn-212、mut-hfn-241、mut-hfn-242和mut-hfn-243的sec图谱。
37.图4.示出偶联分子mut-hfn-243-icg的rp-hplc图谱。
38.图5.示出偶联分子hfn-icg和mut-hfn-243-icg的sec图谱。
39.图6.示出icg、hfn-icg和mut-hfn-243-icg偶联分子对大鼠前哨淋巴结和次级淋巴结的荧光显像结果。
具体实施方式
40.一、定义
41.在本公开中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的蛋白质和核酸化学、分子生物学、细胞和组织培养、微生物学、免疫学相关术语和实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的术语和常规步骤。同时，为了更好地理解本公开，下面提供相关术语的定义和解释。
42.如本文所用，术语“和/或”涵盖由该术语连接的项目的所有组合，应视作各个组合已经单独地在本文列出。例如，“a和/或b”涵盖了“a”、“a和b”以及“b”。例如，“a、b和/或c”涵盖“a”、“b”、“c”、“a和b”、“a和c”、“b和c”以及“a和b和c”。
[0043]“铁蛋白”是指由蛋白外壳和铁内核两部分构成的储铁结构。天然情况下，铁蛋白的蛋白外壳是通常由24个亚基自组装形成的笼状蛋白结构(外径12nm，内径8nm)，而铁内核的主要成分为水铁矿。不含铁内核的铁蛋白的蛋白外壳也称为“去铁蛋白”。本文所述“铁蛋白”包括真核生物铁蛋白和原核生物铁蛋白，优选真核生物铁蛋白，更优选哺乳动物铁蛋白，例如人铁蛋白。真核生物铁蛋白通常包括重链h亚基和轻链l亚基。在机体不同组织和器官中，铁蛋白分子中含有h和l亚基的比例有所不同。然而，通过重组方式，也可以获得仅由h亚基组装成的“h铁蛋白(hfn)”或仅由l亚基组装成的“l铁蛋白(lfn)”。
[0044]
本公开所述铁蛋白h亚基包括但不限于哺乳动物铁蛋白h亚基，例如人铁蛋白h亚基或马铁蛋白h亚基，优选人铁蛋白h亚基。示例性的野生型人铁蛋白h亚基包含seq id no:1所示氨基酸序列。
[0045]“笼状蛋白”，也称作“纳米笼”，是指由多个能够自组装的多肽(亚基)形成的具有内部中央空腔的三维蛋白结构，即笼状结构。组装成笼状蛋白的多肽(亚基)数目没有特别限制，只要其能够形成所述笼状结构。笼状蛋白可以具有对称结构，也可以具有非对称结构，取决于其亚基组成。典型的笼状蛋白包含铁蛋白/去铁蛋白。
[0046]“多肽”、“肽”、和“蛋白质”在本公开中可互换使用，指氨基酸的聚合物。该术语适用于其中一个或多个氨基酸是相应的天然氨基酸的人工化学类似物的氨基酸聚合物，以及适用于天然氨基酸的聚合物。术语“多肽”、“肽”、“氨基酸序列”和“蛋白质”还可包括修饰形式，包括但不限于糖基化、脂质连接、硫酸盐化、谷氨酸的γ羧化、羟化和adp-核糖基化。
[0047]
如本文所用，“多核苷酸”是指多个核苷酸通过磷酸二酯键连接而成的大分子，其中所述核苷酸包括核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸。本公开的多核苷酸的序列可以针对不同的宿主细胞(如大肠杆菌)进行密码子优化，从而改善多肽的表达。进行密码子优化的方法是本领域已知的。
[0048]“包含”一词在本文中用于描述蛋白质或核酸的序列时，所述蛋白质或核酸可以是
由所述序列组成，或者在所述蛋白质或核酸的一端或两端可以具有额外的氨基酸或核苷酸，但仍然具有本公开所述的活性。此外，本领域技术人员清楚多肽n端由起始密码子编码的甲硫氨酸在某些实际情况下(例如在特定表达系统表达时)会被保留，但不实质影响多肽的功能。因此，本技术说明书和权利要求书中在描述具体的多肽氨基酸序列时，尽管其可能不包含n端由起始密码子编码的甲硫氨酸，然而此时也涵盖包含该甲硫氨酸的序列。相应地，其编码核苷酸序列也可以包含起始密码子。
[0049]
如本文所用，“生物活性部分”指的是在生物体内能发挥治疗、诊断、示踪、预防等生物功能的分子，其可以是蛋白质、多肽、激素、寡肽、核酸等有机大分子，也可以是染料分子、荧光分子、纳米颗粒、金属络合物、放射性同位素等无机分子。通常而言，“生物活性部分”并不包含药物载体或赋形剂。
[0050]
如本文所用，“可检测分子”指的是在生物体内能发挥指示、检测、诊断、示踪、预测的生物功能的分子，如其可帮助操作者区分病灶和正常组织。
[0051]
本文使用的“接头”、“接头结构”或“连接子”或“连接单元”是指一端与铁蛋白h亚基突变体多肽连接而另一端与药物(药物化合物)相连的化学结构片段或键，也可以连接其它接头后再与药物化合物相连。本发明的接头结构可以通过本领域已知方法合成，也可使用本发明所述的方法进行合成。
[0052]
本文使用的“药学上可接受的赋形剂”是指在配制药物产品中所用的没有药理活性且无毒的任意成分，包括但不限于崩解剂、粘合剂、填充剂、缓冲剂、张力剂、稳定剂、抗氧化剂、表面活性剂或润滑剂。
[0053]
二、铁蛋白重链(h)亚基的突变体多肽
[0054]
为了改善铁蛋白重链亚基作为药物载体性质，发明人之前已经获得铁氧中心和/或半胱氨酸位点突变的改良的突变体(pct/cn2020/101312)。
[0055]
作为药物载体，铁蛋白可以通过其表面上的巯基(sh)化学偶联至功能性分子(抗体、示踪分子、小分子肽)，从而获得铁蛋白-功能性分子缀合物。在之前工作的基础上，发明人进一步对铁蛋白h亚基进行了改造，从而提供更灵活的偶联位点，降低副反应和提高偶联产物的均一性，并减少铁蛋白聚集，提高铁蛋白的可溶性。出乎意料的是，本公开的铁蛋白h亚基突变体还具有显著提高的化学偶联反应效率(键合率)。
[0056]
因此，在一个方面，本公开提供一种铁蛋白重链(h)亚基突变体多肽，其相对于野生型铁蛋白h亚基，包含在对应于seq id no:1的第98位、第108位、和/或第156位的位置处的氨基酸取代。
[0057]
不受任何理论限制，据认为在对应于seq id no:1的第98位、第108位、和/或第156位的位置处的氨基酸被亲水性更高的氨基酸取代将会增加铁蛋白的亲水性，减少其聚集。
[0058]
在一些实施方案中，在对应于seq id no:1的第98位、第108位、和/或第156位的位置处的氨基酸被亲水性更高的氨基酸例如带羧基侧链的氨基酸取代。在一些实施方案中，所述带羧基侧链的氨基酸包括谷氨酸(e)、天冬氨酸(d)或组氨酸(h)。
[0059]
在一些实施方案中，所述突变体多肽在对应于seq id no:1的第98位的位置处的氨基酸例如天冬酰胺(n)被天冬氨酸(d)取代，也称作n98d取代。在一些实施方案中，所述突变体多肽在对应于seq id no:1的第108位的位置处的氨基酸例如赖氨酸(k)被谷氨酸(e)取代，也称作k108e取代。在一些实施方案中，所述突变体多肽在对应于seq id no:1的第
156位的位置处的氨基酸例如精氨酸(r)被组氨酸(h)取代，也称作r156h取代。
[0060]
在一些实施方案中，所述突变体多肽在对应于seq id no:1的第98位的位置处的氨基酸例如天冬酰胺(n)被天冬氨酸(d)取代，且在对应于seq id no:1的第108位的位置处的氨基酸例如赖氨酸(k)被谷氨酸(e)取代。
[0061]
在一些实施方案中，所述突变体多肽在对应于seq id no:1的第98位的位置处的氨基酸例如天冬酰胺(n)被天冬氨酸(d)取代，在对应于seq id no:1的第108位的位置处的氨基酸例如赖氨酸(k)被谷氨酸(e)取代，且在对应于seq id no:1的第156位的位置处的氨基酸例如精氨酸(r)被组氨酸(h)取代。
[0062]
在一些实施方案中，相对于野生型铁蛋白h亚基，所述突变体多肽包含在对应于seq id no:1的第27位、第61位、第62位和/或第65位的位置处的氨基酸取代。不受任何理论限制，根据之前的研究结果，据认为在对应于seq id no:1的第27位、第61位、第62位和/或第65位的位置处的氨基酸取代可以降低所形成的铁蛋白的储铁能力，从而使得所述铁蛋白在用作偶联载体时具有更高的安全性。
[0063]
在一些实施方案中，所述突变体多肽在对应于seq id no:1的第27位的位置处的谷氨酸(e)被取代为苯丙氨酸(f)。在一些实施方案中，所述突变体多肽在对应于seq id no:1的第61位的位置处的谷氨酸(e)被取代为色氨酸(w)。在一些实施方案中，所述突变体多肽在对应于seq id no:1的第62位的位置处的氨基酸例如谷氨酸(e)被取代为赖氨酸(k)。在一些实施方案中，所述突变体多肽在对应于seq id no:1的第65位的位置处的氨基酸例如组氨酸(h)被取代为甘氨酸(g)。在一些实施方案中，所述突变体多肽在对应于seq id no:1的第62位的位置处的氨基酸例如谷氨酸(e)被取代为赖氨酸(k)，且在对应于seq id no:1的第65位的位置处的氨基酸例如组氨酸(h)被取代为甘氨酸(g)。
[0064]
野生型人铁蛋白h亚基上有3个巯基，分别位于第2-3段α螺旋之间的loop区(野生型人铁蛋白h亚基第90位半胱氨酸的巯基)，第3段α螺旋上(野生型人铁蛋白h亚基第102位半胱氨酸的巯基)，第4段α螺旋近三重对称轴区(野生型人铁蛋白h亚基第130位半胱氨酸的巯基)。然而，在缀合过程中，若存在多个反应位点，则无法控制缀合的具体位置、以及功能性分子与hfn的反应比例。
[0065]
因此，在一些实施方案中，相对于野生型铁蛋白h亚基，所述突变体多肽包含减少的半胱氨酸。
[0066]
在一些实施方案中，所述突变体多肽在对应于seq id no:1的第90、102和130位的位置处的半胱氨酸的至少一个被取代。在一些实施方案中，所述半胱氨酸被选自以下的氨基酸取代：丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、谷氨酸、天冬氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、丙氨酸、甘氨酸，优选被丝氨酸或被野生型铁蛋白轻链(l)亚基多肽相应位置处的氨基酸取代。示例性的野生型铁蛋白轻链(l)亚基多肽的氨基酸序列如seq id no:17所示。
[0067]
在一些实施方案中，相对于野生型铁蛋白h亚基，所述突变体多肽在对应于seq id no:1的第90位的位置处包含半胱氨酸，和在对应于seq id no:1的第102位的位置处的半胱氨酸被取代，优选被丝氨酸或丙氨酸取代，任选地，在对应于seq id no:1的第130位的位置处的半胱氨酸被取代，优选被丝氨酸或丙氨酸取代。
[0068]
在一些实施方案中，相对于野生型铁蛋白h亚基，所述突变体多肽在对应于seq id no:1的第102位的位置处包含半胱氨酸，和在对应于seq id no:1的第90位的位置处的半胱
氨酸被取代，优选被丝氨酸或谷氨酸取代，任选地，在对应于seq id no:1的第130位的位置处的半胱氨酸被取代，优选被丝氨酸或丙氨酸取代。
[0069]
此外，还可以通过仅在铁蛋白h亚基的loop区(对应于seq id no:1的第79-91位氨基酸)包含一个半胱氨酸，同时去除其它表面巯基，也可以使得每个铁蛋白亚基仅保留一个供化学缀合的位点。
[0070]
在一些实施方案中，相对于野生型铁蛋白h亚基，所述突变体多肽在loop区中包含一个半胱氨酸，在对应于seq id no:1的第102位的位置处的半胱氨酸被取代，以及任选地，在对应于seq id no:1的第130位的位置处的半胱氨酸被取代。在一些实施方案中，除了loop区中的一个半胱氨酸和任选的在对应于seq id no:1的第130位的位置处的半胱氨酸，所述突变体多肽不包含另外的半胱氨酸。在一些优选实施方案中，所述突变体多肽在loop区外不包含半胱氨酸。
[0071]
在一些实施方案中，相对于野生型铁蛋白h亚基，所述突变体多肽在对应于seq id no:1的第90和102的位置处的半胱氨酸被取代，任选地，在对应于seq id no:1的第130位的位置处的半胱氨酸被取代；且所述突变体多肽在对应于seq id no:1的第79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89和91位之一的位置处的氨基酸被半胱氨酸取代。在一些实施方案中，相对于野生型铁蛋白h亚基，所述突变体多肽在对应于seq id no:1的第90、102和130位的位置处的半胱氨酸被取代；且所述突变体多肽在对应于seq id no:1的第79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89和91位之一的位置处的氨基酸被半胱氨酸取代。在一些实施方案中，所述突变体多肽在对应于seq id no:1的第79位的位置处的氨基酸例如精氨酸(r)被半胱氨酸(c)取代。在一些实施方案中，所述突变体多肽在对应于seq id no:1的第80位的位置处的氨基酸例如异亮氨酸(i)被半胱氨酸取代。在一些实施方案中，所述突变体多肽在对应于seq id no:1的第81位的位置处的氨基酸例如苯丙氨酸(f)被半胱氨酸取代。在一些实施方案中，所述突变体多肽在对应于seq id no:1的第82位的位置处的氨基酸例如亮氨酸(l)被半胱氨酸取代。在一些实施方案中，所述突变体多肽在对应于seq id no:1的第83位的位置处的氨基酸例如谷氨酰胺(q)被半胱氨酸取代。在一些实施方案中，所述突变体多肽在对应于seq id no:1的第84位的位置处的氨基酸例如天冬氨酸(d)被半胱氨酸取代。在一些实施方案中，所述突变体多肽在对应于seq id no:1的第85位的位置处的氨基酸例如异亮氨酸(i)被半胱氨酸取代。在一些实施方案中，所述突变体多肽在对应于seq id no:1的第86位的位置处的氨基酸例如赖氨酸(k)被半胱氨酸取代。在一些实施方案中，所述突变体多肽在对应于seq id no:1的第87位的位置处的氨基酸例如赖氨酸(k)被半胱氨酸取代。在一些实施方案中，所述突变体多肽在对应于seq id no:1的第88位的位置处的氨基酸例如脯氨酸(p)被半胱氨酸取代。在一些实施方案中，所述突变体多肽在对应于seq id no:1的第89位的位置处的氨基酸例如天冬氨酸(d)被半胱氨酸取代。在一些实施方案中，所述突变体多肽在对应于seq id no:1的第91位的位置处的氨基酸例如天冬氨酸(d)被半胱氨酸取代。
[0072]
在一些具体实施方案中，所述突变体多肽包含seq id no:5-8中任一所示的氨基酸序列。
[0073]
在一些实施方案中，所述突变体多肽能够组装成笼状蛋白和/或能够在组装成笼状蛋白后赋予所述笼状蛋白结合、治疗、诊断、示踪的能力。
[0074]
三、多核苷酸、表达构建体、宿主细胞和铁蛋白h亚基突变体多肽制备方法
[0075]
在另一方面，本公开提供一种分离的多核苷酸，其包含编码本公开的重组铁蛋白h亚基多肽的核苷酸序列。
[0076]
在一些实施方式中，本公开的多核苷酸包含例如选自seq id no:13-16之一的核苷酸序列。
[0077]
在另一方面，本公开提供了一种表达构建体，其包含与表达调控序列可操作地连接的本公开的多核苷酸。
[0078]
用于本公开的表达构建体的载体包括那些在宿主细胞中自主复制的载体，如质粒载体；还包括能够整合到宿主细胞dna中并和宿主细胞dna一起复制的载体。可商购获得许多适于本公开的载体。在一个具体实施方案中，本公开的表达构建体衍生自novagen公司的pet22b。
[0079]
在另一方面，本公开提供一种宿主细胞，其含有本公开的多核苷酸或以本公开的表达构建体转化，其中所述宿主细胞能够表达本公开的铁蛋白h亚基突变体多肽。
[0080]
可用于表达本公开的铁蛋白h亚基突变体多肽的宿主细胞包括原核生物、酵母和高等真核细胞。示例性的原核宿主包括埃希氏菌属(escherichia)、芽孢杆菌属(bacillus)、沙门氏菌属(salmonella)以及假单胞菌属(pseudomonas)和链霉菌属(streptomyces)的细菌。在优选的实施方案中，宿主细胞是埃希氏菌属细胞，优选是大肠杆菌。在本公开的一个具体实施方案中，所使用的宿主细胞为大肠杆菌bl21(de3)菌株细胞。
[0081]
可以通过许多已熟知的技术之一将本公开的重组表达构建体导入宿主细胞，这样的技术包括但不限于：热激转化，电穿孔，deae-葡聚糖转染，显微注射，脂质体介导的转染，磷酸钙沉淀，原生质融合，微粒轰击，病毒转化及类似技术。
[0082]
在另一方面，本公开提供了一种产生本公开的铁蛋白h亚基突变体多肽的方法，包括：
[0083]
a)在允许多肽表达的条件下培养本公开的宿主细胞；
[0084]
b)从得自步骤a)的培养物获得由所述宿主细胞表达的多肽；及
[0085]
c)任选进一步纯化得自步骤b)的多肽。
[0086]
然而，本公开的铁蛋白h亚基突变体多肽也可以通过化学合成的方法获得。
[0087]
四、多肽缀合物
[0088]
在另一方面，本公开提供一种多肽缀合物，其包含本公开的铁蛋白h亚基突变体多肽和通过所述铁蛋白h亚基突变体多肽的巯基与其缀合的功能性部分。
[0089]
在一些实施方案中，所述功能性部分选自治疗性分子、可检测分子或靶向性分子。
[0090]
所述治疗性分子包括但不限于小分子药物、治疗性多肽、治疗性抗体等。示例性的治疗性小分子包括但不限于毒素、免疫调节剂、拮抗剂、细胞凋亡诱导剂、激素、放射性药物、抗血管生成剂、单克隆抗体、sirna、细胞因子、趋化因子、前药、化疗药物等。
[0091]
所述可检测分子包括但不限于染料分子、荧光分子、发光化学物质、酶、同位素、标签。
[0092]
在一些具体实施方案中，所述的染料分子选自美蓝、伊文思蓝、异硫蓝、亚甲蓝和专利蓝。
[0093]
在一些具体实施方式中，所述的荧光分子选自近红外荧光染料，包括但不限于菁染料类、罗丹明类、芳酸类、卟啉类，示例性的荧光染料为吲哚菁绿、cy3、cy3.5、cy5、cy5.5、
cy7、ir-782、ir820和ir-783。
[0094]
在其中一个具体实施方案中，所述的荧光染料分子为吲哚菁绿。
[0095]
在一些具体实施方式中，所述的同位素包括但不限于
99m tc。
[0096]
所述靶向性分子包括但不限于靶向性抗体、特异性受体配体等。例如，所述靶向性分子可以是特异性靶向肿瘤抗原的抗体。
[0097]
在一些实施方案中，所述的生物活性部分通过接头与所述铁蛋白h亚基突变体多肽缀合。
[0098]
在一些实施方案中，所述多肽缀合物能够组装成笼状蛋白和/或能够在组装成笼状蛋白后赋予所述笼状蛋白结合、治疗、诊断、示踪的能力。
[0099]
在一些实施方案中，所述多肽缀合物是分离的多肽缀合物，例如，其没有组装成笼状蛋白。在一些实施方案中，所述多肽缀合物组装成为笼状蛋白。
[0100]
五、笼状蛋白
[0101]
由于保留了野生型铁蛋白h亚基的自组装能力和/或受体结合能力，本公开的铁蛋白h亚基突变体多肽和/或本公开的多肽缀合物在合适的介质中可以独自组装成笼状蛋白(即h铁蛋白/去铁蛋白)，也可以与铁蛋白l亚基或其他铁蛋白h亚基或其它自组装多肽形成笼状蛋白，并且能够赋予所述笼状蛋白生物活性和功能，例如特异性靶向铁蛋白受体(tfr1)的能力。
[0102]
因此，在另一方面，本公开提供一种笼状蛋白，其包含至少一个本公开的铁蛋白h亚基突变体多肽和/或本公开的多肽缀合物。
[0103]
示例性的所述笼状蛋白可以包含例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、36、或48个本公开的铁蛋白h亚基突变体多肽和/或本公开的多肽缀合物。在一些优选实施方案中，所述笼状蛋白包含24个本公开的铁蛋白h亚基突变体多肽和/或本公开的多肽缀合物。
[0104]
在一些实施方案中，所述笼状蛋白仅包含本公开的铁蛋白h亚基突变体多肽和/或本公开的多肽缀合物，例如，仅包含本公开的多肽缀合物。例如，在一些优选实施方案中，所述笼状蛋白由24个本公开的多肽缀合物组装形成。
[0105]
在一些实施方案中，所述笼状蛋白包含多个本公开的多肽缀合物，所述多个本公开的多肽缀合物包含相同的或不同的生物活性部分。
[0106]
在一些实施方案中，所述笼状蛋白包含的生物活性部分为吲哚菁绿或
99m tc。
[0107]
在一些实施方案中，所述笼状蛋白还包含铁蛋白l亚基。在一些实施方案中，所述笼状蛋白包含至少一个本公开的铁蛋白h亚基突变体多肽和至少一个铁蛋白l亚基，优选地，所述铁蛋白h亚基突变体多肽与铁蛋白l亚基的比例范围例如可以是1:23-23:1。
[0108]
在一些实施方案中，所述笼状蛋白不包含铁蛋白l亚基。
[0109]
六、缀合方法
[0110]
本领域已知多种将功能性分子通过巯基与蛋白质缀合的方法，这些都可以应用于本公开。本领域技术人员可以根据具体的功能性分子以及所选的接头确定合适的缀合方法。示例性的方法可以参考moon,s.j.,et al.,antibody conjugates of 7-ethyl-10-hydroxycamptothecin(sn-38)for targeted cancer chemotherapy.j med chem,2008.51(21):p.6916-26。
[0111]
在一方面，本公开提供一种制备本公开的多肽缀合物的方法，所述方法包括：
[0112]
(1)制备第三部分所述的铁蛋白h亚基突变体多肽；
[0113]
(2)将(1)获得的铁蛋白h亚基突变体多肽在适合偶联反应的条件下与生物活性部分发生偶联反应，获得第四部分所述的多肽缀合物。
[0114]
在一些实施方案中，所述生物活性部分通过接头缀合至解聚的本公开的铁蛋白h亚基突变体多肽。
[0115]
在一些实施方案中，所述生物活性部分是吲哚菁绿(icg)。icg可以通过先与马来酰亚胺分子(接头)缩合为式(i)所示的icg-mal，然后再与铁蛋白h亚基突变体多肽上的巯基偶联。
[0116][0117]
在一些实施方案中，其中步骤(2)包括使式(i)所示化合物(带有接头的icg)与步骤(1)的本公开的解聚的铁蛋白h亚基突变体多肽接触。
[0118]
在一方面，本公开提供一种制备本公开的笼状蛋白的方法，所述笼状蛋白包含至少一个本公开的多肽缀合物，所述方法包括：
[0119]
a)提供包含至少一个本公开的铁蛋白h亚基突变体多肽的笼状蛋白，和
[0120]
b)使功能性分子缀合至所述笼状蛋白中的本公开的铁蛋白h亚基突变体多肽。
[0121]
在一些实施方案中，所述功能性分子通过接头缀合至所述笼状蛋白中的本公开的铁蛋白h亚基突变体多肽。
[0122]
在一些实施方案中，所述功能性分子是icg。在一些实施方案中，其中步骤b)包括使下式(i)所示化合物(带有接头的icg)与所述笼状蛋白接触。
[0123]
七、笼状蛋白-api复合物
[0124]
在另一方面，本发明提供一种笼状蛋白-api复合物，其中所述笼状蛋白-api复合物包含本发明的笼状蛋白，以及装载在所述笼状蛋白内部的药物活性成分(api)。
[0125]
在一些实施方案中，所述复合物中的笼状蛋白包含本发明的多肽缀合物，所述缀合物包含本发明的铁蛋白h亚基突变体多肽和可检测分子。缀合有可检测分子的本发明的笼状蛋白可以用于显示待检测的目标、监测(例如实时监测)药物的递送。
[0126]
装载在所述笼状蛋白内部的所述药物活性成分(api)并没有特别限制，只要其适合于装载于本发明的所述笼状蛋白中，例如，所述api不会破坏笼状蛋白的笼状结构和/或其大小适合于被所述笼状结构容纳。所述api的实例包括但不限于烷基化剂、铂类、抗代谢类、肿瘤抗生素类药物、天然提取物、激素类、放射性药物、神经递质类药物、多巴胺受体激动剂、神经中枢抗胆碱药、胆碱受体激动剂类药物、γ分泌酶抑制剂、抗氧剂、麻醉剂。
[0127]
八、药物组合物及其应用
[0128]
在另一方面，本公开提供一种药物组合物，其包含本公开的铁蛋白h亚基突变体多肽、本公开的多肽缀合物、本公开的笼状蛋白、和/或本公开的笼状蛋白-api复合物，以及药学上可接受的赋形剂。
[0129]
在一些实施方案中，药物组合物包含本公开的铁蛋白h亚基突变体多肽或本公开的多肽缀合物，以及本公开的笼状蛋白，和/或本公开的笼状蛋白-api复合物，其中所述铁蛋白h亚基突变体多肽、本公开的多肽缀合物以未组装成笼状蛋白的形式提供。所述铁蛋白h亚基突变体多肽或多肽缀合物，可以在体外或在递送至体内后，在适合条件下，自组装为笼状蛋白。
[0130]
在一些实施方案中，在本公开的多肽缀合物包含可检测分子的情况下，包含本公开的多肽缀合物的药物组合物还可以包含额外的api。
[0131]
本公开的铁蛋白h亚基突变体多肽、多肽缀合物、笼状蛋白、笼状蛋白-api复合物和/或药物组合物可以用于诊断和示踪的疾病取决于其所包含的治疗性分子或api。
[0132]
在另一方面，本公开提供本公开的铁蛋白h亚基突变体多肽、多肽缀合物、笼状蛋白、笼状蛋白-api复合物和/或药物组合物在制备药物、诊断试剂、示踪试剂中的用途。
[0133]
在一些实施方案中，所述的药物、诊断试剂、示踪试剂为肿瘤药物、肿瘤诊断试剂、肿瘤示踪试剂。
[0134]
在一些实施方案中，所述的肿瘤示踪试剂为肿瘤前哨淋巴结示踪试剂。
[0135]
在另一方面，本公开提供一种在对象中诊断疾病的方法，所述方法包括给所述对象施用有效量的本公开的铁蛋白h亚基突变体多肽、多肽缀合物、笼状蛋白、笼状蛋白-api复合物和/或药物组合物。所述疾病如上文所定义，优选是肿瘤。
[0136]
本公开的多肽、本公开的铁蛋白h亚基突变体多肽、多肽缀合物、笼状蛋白、笼状蛋白-api复合物和/或药物组合物可通过本领域普通技术人员已知的任何适当方法进行施用(参见例如，remington：the science and practice of pharmacy，第21版，2005)。药物组合物例如可通过静脉内、肌肉内、腹腔内、脑脊髓内、皮下、关节内、滑膜腔内、鞘内、口服、局部或吸入途径施用。
[0137]
九、制备笼状蛋白-api复合物的方法
[0138]
在另一方面，本公开提供一种制备本公开的笼状蛋白-api复合物的方法，所述方法包括使本公开的铁蛋白h亚基突变体多肽、本公开的多肽缀合物和/或本公开的笼状蛋白与api接触，由此获得笼状蛋白-api复合物。
[0139]
在一些实施方案中，所述方法包括：
[0140]
a)使解聚的本公开的笼状蛋白与api接触；和
[0141]
b)重组装所述笼状蛋白，由此获得笼状蛋白-api复合物。
[0142]
如本公开所用，“解聚”指的是在一定条件下，笼状蛋白的紧密闭合球状结构被打开，使其全部亚基或部分亚基相互分离的过程，所述条件例如是蛋白变性条件，例如含高浓度脲的缓冲溶液。
[0143]
如本公开所用，“重组装”指的是通过改变条件例如更换成生理学相容条件，使解聚的笼状蛋白，即分离的亚基重新自组装成笼状蛋白的过程。在笼状蛋白的重组装过程中，api将会被包裹在其内部，从而形成笼状蛋白-api复合物。所述生理学相容条件例如是生理缓冲溶液。
[0144]
在一些实施方案中，所述方法在步骤a)之前还包括使本公开的笼状蛋白解聚的步骤。在一些实施方案中，其中通过在高浓度(例如至少6m，优选8m)的脲存在下使本公开的笼状蛋白解聚。在一些实施方案中，其中通过逐步降低脲浓度(例如梯度透析)来重组装所述笼状蛋白。
[0145]
在一些实施方案中，所述方法包括：
[0146]
a)在非解聚条件下，使本公开的笼状蛋白与api接触，由此允许api结合至所述笼状蛋白和/或装载至所述笼状蛋白的内部中央空腔，
[0147]
b)获得笼状蛋白-api复合物。
[0148]
在一些实施方式中，所述非解聚条件包括使所述笼状蛋白和api置于生理可接受的缓冲液中。合适的生理可接受的缓冲液包括但不限于pbs溶液、生理盐水、纯水、hepes缓冲液等。
[0149]
在一些实施方案中，api通过被动扩散穿梭至所述笼状蛋白的内部中央空腔。通过使所述笼状蛋白和api至于生理可接受的缓冲液中，api可以在笼状蛋白不解聚的情况下通过扩散的方式进入笼状蛋白的内部内腔中。
[0150]
实施例
[0151]
通过参考在此给出的一些具体实施例可获得对本公开的进一步的理解，这些实施例仅用于说明本公开，其无意于对本公开的范围做出任何限制。显然，可以对本公开作出多种改动和变化而不脱离本公开的实质，因此，这些改动和变化同样在本技术要求保护的范围内。
[0152]
实施例1、构建具有提高键合率和水溶性的人h-铁蛋白
[0153]
1.1铁蛋白h亚基突变的设计
[0154]
根据人铁蛋白h亚基的野生型氨基酸序列(seq id no:1；参见pdb:3ajo_a)设计h亚基突变体的氨基酸序列，对h亚基中可能涉及铁装载的位点进行了突变，涉及第62位的谷氨酸(e62)和第65位的组氨酸(h65)的铁氧中心位点。同时为增加铁蛋白的亲水性，减少聚集，将第108位的带氨基侧链的赖氨酸(k108)用带羧基侧链的氨基酸取代；将第98位的天冬酰胺(n98)用带羧基侧链的氨基酸取代；和/或将第156位的带氨基侧链的精氨酸(r156)用带羧基侧链的氨基酸取代。所有的氨基酸位置均参考seq id no:1。同时，为增加铁蛋白偶联药物的均一性，将h亚基的三个活性巯基位点中的两个(第90位和第130位)突变成为其它氨基酸，仅保留第102位的半胱氨酸作为偶联位点。
[0155]
突变体的具体设计见表1。所得亚基突变体分别命名为mut-hfn-240(seq id no:5)、mut-hfn-241(seq id no:6)、mut-hfn-242(seq id no:7)和mut-hfn-243(seq id no:8)。
[0156]
此外，将突变体mut-hfn-212(seq id no:2)、mut-hfn-233(seq id no:3)和mut-hfn-203(seq id no:4)作为对照，该突变体未进行亲水性位点和铁装载相关位点的改良，仅保留了1个cys作为化学偶联位点，将其它两个在外表面的cys进行突变(c102s和c130s)。
[0157]
表1、hfn突变体的设计
[0158][0159]
1.2h-铁蛋白的制备和纯化
[0160]
获得突变的氨基酸序列后，针对大肠杆菌对其编码序列进行了密码子优化。野生型铁蛋白以及5个突变体的密码子优化的核苷酸序列分别示于seq id no：9-16。野生型hfn、mut-hfn-212、mut-hfn-203、mut-hfn-233、mut-hfn-242的构建方法为：选择大肠杆菌表达外源蛋白的常用载体pet-30a(+)，卡那霉素抗性(kan+)，选择nde i和hind iii酶切位点嵌入目的基因。经酶切图谱和基因测序确证表达载体构建成功。
[0161]
mut-hfn-240、mut-hfn-241、mut-hfn-243的构建方法为：选择大肠杆菌表达外源蛋白的常用载体pet-28a(+)，卡那霉素抗性(kan+)，选择nco i和xho i酶切位点嵌入目的基因。经酶切图谱和基因测序确证表达载体构建成功。
[0162]
上述表达载体构建成功后，选择e.coli bl21(de3)作为宿主菌，将含有目的基因的重组质粒转化至宿主菌感受态细胞中，通过含卡那霉素的抗性平板筛选阳性克隆，确定重组菌株。
[0163]
重组菌株接种于1l lb培养基/2l摇瓶，37℃低速摇瓶培养至od600 1.0左右，加入0.5mm iptg，诱导表达3～4h后离心收菌泥。每30ml菌液离心收集的菌泥加入25ml 20mm tris-hcl缓冲液重悬均匀，于高压均质机1000bar破碎0.5～2min，裂解液于5000r/min离心30min，取上清送检sds-page，上样量为10μl(样品:loading buffer＝1:1)。各蛋白的表达结果如图1所示。所有蛋白均表达在上清液中。
[0164]
蛋白纯化方法包括以下步骤：上述高压均质破碎的菌体裂解液，经离心(1500rpm，10min)去除大肠杆菌菌体碎片；上清液72℃加热15分钟；沉淀杂蛋白，离心去除沉淀；上清液在排阻色谱superdex 200pg柱上分离纯化；sds-page电泳鉴定纯度；bca测定蛋白浓度。所有样品纯度均达到96％以上。
[0165]
实施例2、铁蛋白h亚基突变体的表征
[0166]
2.1.突变体hfn tem结果
[0167]
制样方法：铁蛋白样品(20μl，0.1mg/ml)在普通碳支持膜上1min，然后用2％的醋酸双氧铀清洗两遍，最后用2％的醋酸双氧铀染色一分钟。fei tecnai spirit(120kv)电镜观察条件：使用透射电子显微镜(fei tecnai spirit(120kv))观察，观察条件：ht100kv。透射电镜结果(图2)表明，突变的h亚基多肽与野生型h亚基多肽均可形成均匀、规则的笼状蛋白结构，直径在大约12-19nm之间。
[0168]
2.2突变体hfn的sec结果
[0169]
分别取1ml蛋白浓度为1mg/ml的蛋白样品，置于干净的1.5ml ep管中，取10微升样品在高效液相层析系统(agilent technologies 1260infinityⅱ)通过凝胶过滤层析柱(agilent advance bio sec 300a 2.7um 7.8*300nm，色谱柱编号：ard-007流速：0.5ml/min)sec分析铁蛋白单体和聚体峰，流动相：50mm tris buffer，ph7.2。检测波长：280nm柱
温：25℃
[0170]
sec的结果如表2所示，图3则详细展示了mut-hfn-212、mut-hfn-241、mut-hfn-242和mut-hfn-243的sec图谱。相同制备条件下，mut-hfn-212的粒径稍大，且容易发生聚集。
[0171]
表2、突变体hfn的sec结果
[0172]
样品粒径(nm)mut-hfn-21219.23mut-hfn-23320.31mut-hfn-20320.98mut-hfn-24014.73mut-hfn-24116.97mut-hfn-24216.89mut-hfn-24317.076
[0173]
实施例3、hfn与示踪分子的偶联
[0174]
3.1野生型hfn、mut-hfn-243与icg的偶联
[0175]
试剂(表3)：
[0176]
表3：偶联用试剂
[0177]
试剂名称生产厂家批号icg-mal新研博美r00210890epps特伯化学21082903edta二钠麦克林c12297614dmso阿拉丁f2110074nah2po4
·
2h2o国药20190903na2hpo4
·
12h2o阿拉丁d1825031l-cys北京伊诺凯kyegv07
[0178]
3.1.1偶联方法
[0179]
实施例1制备的野生型hfn、mut-hfn-243纯化蛋白用100kd的超滤管换液并浓缩至50mm epps+5mm edta(ph 8.0)溶液中，使之浓度大于6mg/ml。用dmso溶解icg-mal。将各组hfn溶液置于冰水浴中，当溶液温度达到4℃时，边混匀边加入hfn 28摩尔当量的icg-mal的dmso溶液(dmso终浓度为15％)，充分混匀后将混合液置于4℃冰箱静置反应40min。体系中hfn应浓度为5mg/ml。反应完成后，加入hfn 28摩尔当量的l-cys(l-半胱氨酸)混匀，置于25℃摇床，30rpm慢摇反应10min。最后使用sephadex g-25填料将反应完的溶液脱盐换液于20mm pb(ph 7.5)，并浓缩至icg的浓度为0.2mg/ml。经无菌过滤后4℃保存。
[0180]
3.2偶联产物检测
[0181]
3.2.1rp-hplc检测
[0182]
将3.1.1制备的hfn-icg和mut-hfn-243-icg用rp-hplc(agilent，1260infinity ii)液相色谱柱(ii)液相色谱柱(beh c18 1.7μm 2.1
×
100mm)进行分析，检测280nm、397nm波长，梯度洗脱，流动相采用：a相：0.1％tfa/水；b相：乙腈，柱温20℃，流速0.4ml/min，进样量2μl。
[0183]
梯度洗脱条件为：
[0184]
时间(min)流速(ml/min)m.p.a(％)m.p.b(％)00.462.038.0 7.00.455.045.0
[0185]
根据rp-hplc结果测算，每个野生型hfn-icg的键合率为8.8，mut-hfn-243-icg偶联的键合率为12.3，即hfn突变体后提高了和小分子的键合率。
[0186]
图4显示了mut-hfn-243-icg的rp-hplc具体图谱。图中上面的线是样品在280nm的检测所得，其中左面的峰是未偶联的mut-hfn-243，右面的峰是偶联icg后的mut-hfn-243-icg。下面线是在397nm的检测所得，该波长是icg-mal的吸收峰。由此可见，mut-hfn-243在icg-mal小分子(397nm处)和hfn(280nm处)出峰时间重叠，表明icg-mal偶联到了铁蛋白突变体上。
[0187]
3.2.2sec检测
[0188]
对3.1.1节制备的野生型hfn-icg、mut-hfn-243-icg偶联产物采用sec(tsk gel g4000swxl 7.8
×
300mm，8μm)检测波长280nm、363nm，柱温30℃，等度洗脱，流动相为：0.1m pb&0.2m nacl&5％ipa，ph7.0。流速0.4ml/min，进样量30μl。
[0189]
sec结果如图5所示。相同制备条件下，hfn-icg的粒径稍大，且容易发生聚集。mut-hfn-243-icg则粒径更小，且未检测到聚集体，说明hfn突变体偶联小分子的均一性和稳定性均有所改善。
[0190]
实施例4、hfn-icg、mut-hfn-243-icg偶联物示踪实验
[0191]
4.1动物示踪方法
[0192]
(1)将实验动物分为5组，每组8只雄性无菌级实验用sd大鼠(该实验在北京维通利华实验动物技术有限公司完成)，详细分组和示踪剂使用剂量(剂量按照icg的浓度计算)参见表4；
[0193]
(2)将sd大鼠麻醉后，于后肢足垫皮下分别注射5种不同种类或剂量的淋巴结示踪剂；
[0194]
(3)经过充分引流后，使用荧光法(激发780nm，发射800nm)对每只大鼠的后肢淋巴引流通路的前哨淋巴结进行定位。荧光法是循荧光显像淋巴管检出第1枚荧光显像淋巴结。于1h时解剖大鼠后肢及腹部淋巴引流通路，分离大鼠的腘窝前哨淋巴结和腹腔见肾旁次级淋巴结；
[0195]
(4)在荧光显像模式下对比不同组分离的前哨淋巴结和次级淋巴结的荧光显像情况，以确定不同示踪剂在不同的淋巴部位的影像情况。
[0196]
表4：示踪动物分组和使用剂量
[0197][0198]
4.2示踪结果
[0199]
4.1节各组的示踪影像见图6。结果表明，mut-hfn-243-icg在低剂量下(0.2mg/ml)即可清晰的对前哨淋巴结进行显影，且比2.5mg/ml标准剂量的icg荧光强度强1.3倍(用软
件imagej检测，excel计算荧光强度)，说明本公开获得的突变体-icg在低至少一个数量级的用量下仍旧能清晰对前哨淋巴结进行显影。另外，2.5mg/ml标准剂量的icg对次级淋巴结也有显色，而mut-hfn-243-icg则基本未进入次级淋巴结，不会对次级淋巴结染色，这说明本公开获得的突变体-icg能够更好的区分前哨淋巴结和次级淋巴结，这给在肿瘤外科手术中的外科医生以很好的显像指引，不会造成次级淋巴结因为显色而被清除，能大大减少对因误扫除次级淋巴给肿瘤患者带来的伤害。

技术特征：
1.一种铁蛋白h亚基(hfn)突变体多肽，其包含选自seq id no:5-8之一的氨基酸序列。2.一种多肽缀合物，其包含铁蛋白h亚基突变体多肽，和通过所述铁蛋白h亚基突变体多肽的巯基与其缀合的生物活性部分，所述铁蛋白h亚基突变体多肽序列包含选自seq id no:5-8之一的氨基酸序列。3.根据权利要求2所述的多肽缀合物，其中所述生物活性部分选自治疗性分子、可检测分子或靶向性分子；优选地，所述可检测分子选自染料分子、荧光分子、发光化学物质、酶、同位素、标签；可选的，所述生物活性部分通过接头与所述铁蛋白h亚基突变体多肽的巯基缀合。4.根据权利要求3所述的多肽缀合物，其中所述染料分子选自美蓝、伊文思蓝、异硫蓝、亚甲蓝和专利蓝；所述的荧光分子为近红外荧光染料，例如菁染料类、罗丹明类、芳酸类、卟啉类，优选吲哚菁绿、cy3、cy3.5、cy5、cy5.5、cy7、ir-782、ir820和ir-783；所述同位素为
99m tc。5.根据权利要求3或4所述的多肽缀合物，其中所述生物活性部分为吲哚菁绿；所述的接头为马来酰亚胺。6.权利要求2-5中任一项所述的多肽缀合物的制备方法，其包括如下步骤：(1)制备权利要求1所述的铁蛋白h亚基突变体多肽；(2)将(1)获得的铁蛋白h亚基突变体多肽在适合偶联反应的条件下与生物活性部分发生偶联反应，获得多肽缀合物。7.一种笼状蛋白，其包含至少一个权利要求1中所述的铁蛋白h亚基突变体多肽，和/或至少一个权利要求2-5中任一项所述的多肽缀合物；优选地，所述笼状蛋白包含24个所述铁蛋白h亚基突变体多肽和/或所述多肽缀合物。8.一种笼状蛋白-api复合物，其中所述笼状蛋白-api复合物包含权利要求7的笼状蛋白，以及装载在所述笼状蛋白内部的药物活性成分(api)。9.一种药物组合物，其包含权利要求1所述的铁蛋白h亚基突变体多肽、权利要求2-5任一项所述的多肽缀合物、权利要求7所述的笼状蛋白、和/或权利要求8所述的笼状蛋白-api复合物，以及药学上可接受的赋形剂。10.权利要求1所述的铁蛋白h亚基突变体多肽、权利要求2-5任一项所述的多肽缀合物、权利要求7所述的笼状蛋白、权利要求8所述的笼状蛋白-api复合物、和/或权利要求9的药物组合物在制备药物、诊断试剂、示踪试剂中的用途；优选地，所述药物、诊断试剂、示踪试剂为肿瘤药物、肿瘤诊断试剂、肿瘤示踪试剂；更优选地，所述的肿瘤示踪试剂为肿瘤前哨淋巴结示踪试剂。

技术总结
本公开涉及一种铁蛋白示踪多肽缀合物及其用途。所述铁蛋白示踪多肽缀合物包含铁蛋白H亚基(HFn)突变体多肽，所述铁蛋白H亚基(HFn)突变体多肽包含选自SEQ ID NO:5-8之一的氨基酸序列。本公开还涉及一种多肽缀合物、由多肽或多肽缀合物形成的笼状蛋白，及其应用。本公开涉及的多肽或多肽缀合物、由多肽或多肽缀合物形成的笼状蛋白具有更好的亲水性和偶联特性，在肿瘤前哨淋巴示踪上有更好的分辨率、准确性和持久性。确性和持久性。


技术研发人员：柯天一 丁会 姚德惠 劳芳 刘岩 赵梦蕊 张泽译 闫西冲
受保护的技术使用者：昆山新蕴达生物科技有限公司
技术研发日：2023.03.21
技术公布日：2023/9/26