一种用于肿瘤治疗的载药水凝胶、其制备方法和应用

1.本发明属于生物医用材料技术领域，更具体地，涉及一种用于肿瘤治疗的载药水凝胶、其制备方法和应用。


背景技术：

2.恶性肿瘤威胁着人类健康，传统治疗手段如手术切除、化疗和放疗难以达到恶性肿瘤的完全治愈，治疗效果差强人意。手术切除作为恶性肿瘤最主要的临床治疗手段，但常面临术后残余的肿瘤细胞引发肿瘤复发和转移问题。常规临床措施是术后辅助以全身化疗或放疗，但毒性极大，且因患者术后身体虚弱具有使用空窗期。除此之外，术后带来的组织损伤、微环境中细胞的改变以及炎症都会对复发过程起到促进作用，这其中包括血管和组织损伤招募到切除部位的血小板的激活、损伤血管的血管新生以及脂肪等基质细胞的作用都会促进肿瘤的复发和转移。因此，及时清除术后残余肿瘤细胞并结合肿瘤术后微环境的改造是抑制肿瘤术后复发和转移、提高患者生存获益的重要策略。
3.原位给药系统是利用可固定于病灶部位的材料进行原位给药的一种治疗手段，具有显著的优越性。原位给药系统通常采用可降解并且生物相容性好的材料作为骨架，对一种或多种药物进行负载，将药物局部释放到靶部位，提高靶部位的药物浓度，同时降低血液及全身组织的药物浓度，在保证治疗效果的同时具有低毒性。这种给药体系一般具有缓释或控释的特性，可以根据手术切除部位特有的微环境进行药物智能精准释放，最大限度的发挥治疗效果、降低副作用。
4.水凝胶是一种具有亲水性的三维网状交联结构的高分子网络体系，通常通过共价键或非共价键交联。组成水凝胶的材料可以是多糖类(壳聚糖、透明质酸、明胶)、多肽类(聚(l-谷氨酸)、丝素蛋白)和聚合物(聚丙烯酰胺和聚乙烯醇)等。根据使用材料和交联方法的不同，水凝胶可具备弹性、韧性、可注射性、粘附性、抗粘连性、导电性、可拉伸性、可塑性和自愈合性等不同的物理特性，满足多种多样的应用需求，从载药系统到组织工程再到可穿戴电子元件，使水凝胶的应用范围越来越广。但是目前单一的水凝胶治疗手段难以取得很好的疗效，所以更加综合的治疗效果具有更好的应用前景。
5.脂肪细胞在构成乳房组织的所有细胞类型中所占比例最大，是乳腺癌肿瘤切除微环境中的关键细胞。在乳腺癌肿瘤微环境中，癌症相关脂肪细胞不仅在空间上与癌细胞相邻，而且会与癌细胞串扰，促进肿瘤的复发、进展和转移。研究表明，脂肪细胞不仅作为能量存储细胞，而且作为重要的内分泌细胞，产生多种被称为“脂肪因子”的生物活性分子，如瘦素、脂联素、il-6和抵抗素等，通过脂肪因子调节、代谢重编程、微环境重塑和免疫调节等途径参与乳腺癌的增殖、扩散、血管生成、侵袭和转移，但目前通过抑制肿瘤术后微环境中脂肪细胞来预防肿瘤复发和转移的研究较为匮乏。此外，血管生成和重建是肿瘤切除微环境中促进肿瘤生长的一个重要生物学过程。受损血管产生新的血管以运输氧气和养分，从而促进残余肿瘤的快速复发和转移。因此，在杀伤残存肿瘤细胞同时抑制脂肪细胞功能及血管新生，有望抑制手术后的肿瘤复发和转移。
6.met是一种临床常用的抗糖尿病药物，可通过激活ampk来调节代谢和抑制血管生成。近期研究表明，met可以通过影响脂肪细胞、减少脂肪因子分泌来重塑脂肪相关的肿瘤微环境，从而延缓肿瘤进展。然而，met全身给药半衰期短，体内生物利用度低，难以实现预期效果。
7.可植入载药平台通过直接植入肿瘤切除部位，可避免患者术后恢复空窗期，并且增加肿瘤切除部位药物积累，延长药物释放时间，降低全身药物副作用，为术后癌症治疗提供了一种具有前景的策略。水凝胶主要由三维大分子网络和大量水组成。生物粘附水凝胶具有孔隙率高、可塑性强、毒性低的特点，同时实现药物可控释放和良好的组织粘附。受贻贝粘附蛋白启发，富含儿茶酚和多巴胺(dopamine，da)、没食子酸(gallic acid，ga)等多酚的粘附水凝胶被应用于伤口敷料、组织工程、柔性装置等领域。然而，如何在肿瘤切除部位高效地从水凝胶中释放药物仍有待改进。


技术实现要素：

8.针对现有技术的缺陷，本发明的目的在于提供一种用于肿瘤治疗的载药水凝胶、其制备方法和应用，通过构建生物相容性良好的水凝胶材料用于化疗药物与肿瘤微环境改造药物的原位给药，以预防肿瘤术后复发和转移。
9.为实现上述目的，本发明提供了一种用于术后载药的水凝胶的制备方法，包括如下步骤：
10.(1)将1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、n-羟基琥珀酰亚胺与透明质酸的水溶液混合搅拌，并保持溶液为弱酸性，对所述透明质酸的羧基进行活化，得到活化的前驱体溶液；
11.(2)将步骤(1)所述活化的前驱体溶液与3-氨基苯硼酸和盐酸多巴胺混合，在惰性气体保护和弱酸性条件下反应，使所述3-氨基苯硼酸和盐酸多巴胺通过酰胺缩合反应接枝到所述透明质酸的骨架上，得到粗产物；
12.(3)将步骤(2)所述粗产物在酸性超纯水中进行透析，透析得到的液体调节ph至中性后进行搅拌，利用空气中的氧气使多巴胺氧化聚合，然后冷冻干燥得到用于载药的水凝胶。
13.优选地，步骤(1)所述1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、n-羟基琥珀酰亚胺与透明质酸的质量比为(0.4-0.8)：(0.1-0.5)：1，所述透明质酸的水溶液中透明质酸的质量百分数为0.5-1.5％；步骤(1)所述活化其活化时间为10-40分钟。
14.优选地，步骤(2)所述3-氨基苯硼酸和盐酸多巴胺的摩尔比为3:1-1:3，所述盐酸多巴胺与所述透明质酸的质量比为0.28～1.1:1。
15.优选地，步骤(2)所述惰性气体为氩气或氮气，所述反应其反应时间为12-36小时。
16.优选地，步骤(3)将所述粗产物转移到透析袋中，所述透析袋的截留分子量10000-14000da；所述搅拌的时间为3-8h；将搅拌产物真空冷冻干燥24-72小时，得到所述用于载药的水凝胶。
17.按照本发明的另一个方面，提供了一种所述的制备方法得到的用于抑制肿瘤术后复发和转移的载药水凝胶。
18.按照本发明的另一个方面，提供了一种术后载药水凝胶，其包括所述的水凝胶，还
包括抗肿瘤药物和能够改善肿瘤微环境的药物，所述抗肿瘤药物包括阿霉素、紫杉醇和喜树碱中的一种或多种，所述能够改善肿瘤微环境的药物包括二甲双胍和/或阿司匹林。
19.按照本发明的另一个方面，提供了一种所述的载药水凝胶在制备术后治疗和/或抑制肿瘤的药物中的应用。
20.按照本发明的另一个方面，提供了一种所述的载药水凝胶在制备抑制术后肿瘤脂肪细胞新生和/或抑制术后肿瘤血管生成的药物中的应用。
21.按照本发明的另一个方面，提供了一种所述的载药水凝胶在制备抑制肿瘤术后血小板激活的药物中的应用。
22.总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：
23.(1)本发明通过一锅法酰胺缩合反应将两种反应底物多巴胺和3-氨基苯硼酸接枝到透明质酸骨架上，制备得到用于载药的水凝胶，制备方法简单便捷，且安全可控。
24.(2)本发明制备的水凝胶采用多巴胺和3-氨基苯硼酸作为反应底物，具有双交联网络，使得水凝胶具有更紧密的交联网络和更优秀的流变特性。
25.(3)本发明水凝胶因多巴胺的接枝具有优秀的生物粘附性能，可以保证水凝胶粘附于生物组织而不位移。因多巴胺和3-氨基苯硼酸之间形成的苯硼酸酯键具有ph响应性，制备得到的水凝胶可对组织的酸性进行ph响应性药物缓慢释放。并且本发明通过利用空气中的氧气对制备得到的凝胶材料中的多巴胺进行氧化聚合，控制其达到合适的氧化聚合程度，从而控制凝胶材料在体内降解速度即对应合适的药物释放速度。
26.(4)本发明提供一种用于肿瘤术后治疗的载药水凝胶，可对化疗药物或者其他干预药物进行包裹。本发明提供的水凝胶支架材料，具备良好生物相容性、生物粘附性、溶胀特性和ph响应性。柔韧的流变特性和优秀的生物粘附性可保证其稳定的粘附于切除伤口处而不移位，缓慢且ph响应性释放以及体内保证药物长时间滞留的特征使水凝胶能够对肿瘤微环境进行响应并维持肿瘤切除微环境长期处于足够的药物浓度。
27.(5)本发明制备的水凝胶可以同时负载抗肿瘤化疗药物和能够改善肿瘤微环境的药物，使得化疗药物在抑制肿瘤的同时，肿瘤微环境还得到改善，协同促进对术后肿瘤复发和转移的抑制。本发明优选实施例中制备得到的同时载有阿霉素(dox)和二甲双胍(met)的载药水凝胶通过术后实验发现，其相对于对照组能够显著抑制肿瘤的术后复发和转移，并且能够抑制脂肪细胞的新生，进而抑制肿瘤的复发；而且还能够显著抑制肿瘤术后的血管的形成，减少残余肿瘤组织的氧气和营养供给。本发明有望为周围脂肪细胞较多的肿瘤，如乳腺癌、胰腺癌、肾细胞癌等术后治疗提供理论基础和治疗策略。另外制备得到的载dox和阿司匹林(asa)的载药水凝胶能在杀伤肿瘤细胞时，有效抑制血小板激活，有效抑制肿瘤术后复发和转移。
附图说明
28.图1为本发明用于肿瘤治疗载药的水凝胶的制备方法流程图。
29.图2内容a为不同多巴胺/apba配比的hdp水凝胶剪切粘度；内容b为不同多巴胺/apba配比的hdp水凝胶的g
′
和g
″
随频率的变化；内容c为不同多巴胺/apba配比的hdp水凝胶的g
′
和g
″
随应变程度的变化。
30.图3内容a为测量不同多巴胺/apba配比的hdp水凝胶粘附能力的万能试验机示意图；内容b为不同多巴胺/apba配比的hdp水凝胶粘附强度随位移的变化曲线；内容c为不同多巴胺/apba配比的hdp水凝胶粘附强度随位移的粘附强度统计。
31.图4内容a为hdp水凝胶形态照片；内容b为hdp水凝胶自愈合原理示意图；内容c为hdp水凝胶自自愈合过程照片；内容d为hdp水凝胶粘附于手指上的照片；内容e为hdp水凝胶伴随手指弯曲具有延展性的照片；内容f为hdp水凝胶组织粘附照片；内容g为hdp水凝胶拉伸特性照片。
32.图5内容a为hdp的sem观察(标尺：50μm，右图为左图虚线方框的放大图像)；内容b为hdp通过sem图像统计平均孔径。
33.图6内容a为dox/met@hdp在ph＝7.4和6.5条件下dox体外药物释放行为；内容b为dox/met@hdp在ph＝7.4和6.5条件下met体外药物释放行为。
34.图7内容a为hdp、dox@hdp、met@hdp和dox/met@hdp的剪切粘度研究；内容b为hdp、dox@hdp、met@hdp和dox/met@hdp的g
′
和g
″
随频率的变化；内容c为hdp、dox@hdp、met@hdp和dox/met@hdp的g
′
和g
″
随应变程度的变化。
35.图8内容a为4t1原位肿瘤切除后经cy5.5/icg和cy5.5/icg@hdp处理后小鼠体内cy5.5代表性小动物活体成像荧光图片；内容b为4t1原位肿瘤切除后经cy5.5/icg和cy5.5/icg@hdp处理后小鼠体内cy5.5荧光定量；内容c为4t1原位肿瘤切除后经cy5.5/icg和cy5.5/icg@hdp处理后小鼠体内icg代表性小动物活体成像荧光图片；内容d为4t1原位肿瘤切除后经cy5.5/icg和cy5.5/icg@hdp处理后小鼠体内icg荧光定量。
36.图9内容a为4t1原位肿瘤切除后经cy5.5/icg和cy5.5/icg@hdp处理后第10天小鼠主要器官和肿瘤内cy5.5代表性荧光图片；内容b为4t1原位肿瘤切除后经cy5.5/icg和cy5.5/icg@hdp处理后第10天小鼠主要器官和肿瘤内cy5.5荧光定量；内容c为4t1原位肿瘤切除后经cy5.5/icg和cy5.5/icg@hdp处理后第10天小鼠主要器官和肿瘤内icg代表性荧光图片；内容d为4t1原位肿瘤切除后经cy5.5/icg和cy5.5/icg@hdp处理后第10天小鼠主要器官和肿瘤内icg荧光定量。
37.图10内容a为cck-8法测定4t1细胞经pbs、hdp释放液、dox、met、dox@hdp释放液、met@hdp释放液或dox/met@hdp释放液(其中游离药物和释放液具有不同的dox和met浓度)处理24h后的细胞存活；内容b为annexin v凋亡试剂盒与7-aad检测4t1细胞经pbs、hdp释放液、dox、met、dox@hdp释放液、met@hdp释放液或dox/met@hdp释放液处理24h后的凋亡情况；内容c为活死细胞染色研究dox/met@hdp对4t1细胞的细胞毒性。
38.图11内容a为经pbs、hdp、dox、met、dox@hdp、met@hdp或dox/met@hdp处理后脂肪细胞的细胞存活；内容b为经pbs、hdp、dox、met、dox@hdp、met@hdp或dox/met@hdp处理后脂肪细胞的脂质含量；内容c为elisa法检测经pbs、hdp释放液、dox、met、dox@hdp释放液、met@hdp释放液或dox/met@hdp释放液处理后脂肪细胞上清液中il-6含量；内容d为经pbs、hdp释放液、dox、met、dox@hdp释放液、met@hdp释放液或dox/met@hdp释放液处理后脂肪细胞的脂肪因子il-6mrna表达水平；内容e为经pbs、hdp释放液、dox、met、dox@hdp释放液、met@hdp释放液或dox/met@hdp释放液处理后脂肪细胞的脂肪因子脂联素mrna表达水平；内容f为经pbs、hdp释放液、dox、met、dox@hdp释放液、met@hdp释放液或dox/met@hdp释放液处理后脂肪细胞的脂肪因子抵抗素mrna表达水平。
39.图12内容a为4t1细胞与经pbs、hdp释放液、dox、met、dox@hdp释放液、met@hdp释放液或dox/met@hdp释放液处理后脂肪细胞后对4t1细胞增殖的影响；内容b为与经pbs、hdp释放液、dox、met、dox@hdp释放液、met@hdp释放液或dox/met@hdp释放液处理的脂肪细胞共孵育后的4t1细胞划痕愈合实验划痕面积定量；内容c为与经pbs、hdp释放液、dox、met、dox@hdp释放液、met@hdp释放液或dox/met@hdp释放液处理的脂肪细胞共孵育后的4t1细胞划痕愈合实验代表性图像(标尺：100μm)；内容d为与经pbs、hdp释放液、dox、met、dox@hdp释放液、met@hdp释放液或dox/met@hdp释放液处理的脂肪细胞共孵育后迁移的4t1细胞结晶紫染色迁移细胞数定量；内容e为与经pbs、hdp释放液、dox、met、dox@hdp释放液、met@hdp释放液或dox/met@hdp释放液处理的脂肪细胞共孵育后迁移的4t1细胞结晶紫染色代表性图像(标尺：50μm)。
40.图13内容a为4t1原位肿瘤切除模型及给药治疗流程图；内容b为原位肿瘤切除后经pbs、hdp、dox、met、dox/met、dox@hdp、met@hdp或dox/met@hdp处理后肿瘤平均生长曲线；内容c为原位肿瘤切除后经pbs处理后单只小鼠的肿瘤曲线；内容d为原位肿瘤切除后经hdp处理后单只小鼠的肿瘤曲线；内容e为原位肿瘤切除后经dox处理后单只小鼠的肿瘤曲线；内容f为原位肿瘤切除后经met处理后单只小鼠的肿瘤曲线；内容g为原位肿瘤切除后经dox/met处理后单只小鼠的肿瘤曲线；内容h为原位肿瘤切除后经dox@hdp处理后单只小鼠的肿瘤曲线；内容i为原位肿瘤切除后经met@hdp处理后单只小鼠的肿瘤曲线；内容j为原位肿瘤切除后经dox/met@hdp处理后单只小鼠的肿瘤曲线。
41.图14内容a为4t1原位肿瘤切除后经pbs、hdp、dox、met、dox/met、dox@hdp、met@hdp或dox/met@hdp处理20天后剥离肿瘤的照片；内容b为4t1原位肿瘤切除后经pbs、hdp、dox、met、dox/met、dox@hdp、met@hdp或dox/met@hdp处理20天后剥离肿瘤的重量统计；内容c为4t1原位肿瘤切除后经pbs、hdp、dox、met、dox/met、dox@hdp、met@hdp或dox/met@hdp处理20天后剥离肿瘤的h&e染色切片代表性图像。
42.图15为经pbs、hdp、dox、met、dox@hdp、met@hdp或dox/met@hdp处理对huvecs细胞小管形成的影响。
43.图16为各样品组对4t1原位肿瘤术后肿瘤中il-6和cd31表达的影响。
44.图17为4t1原位肿瘤切除后各样品组(pbs为对照组1、hdp为对照组2、dox为对照组3、asa为对照组4、dox@hdp为对照组5、asa@hdp为对照组6，dox/asa@hdp为实验组)处理后肿瘤体积检测情况。
45.图18为4t1原位肿瘤切除后各样品组(pbs为对照组1、hdp为对照组2、dox为对照组3、asa为对照组4、dox@hdp为对照组5、asa@hdp为对照组6，dox/asa@hdp为实验组)处理后肺部结节数量比较。
46.图19为4t1原位肿瘤切除后各样品组(pbs为对照组1、hdp为对照组2、dox为对照组3、asa为对照组4、dox@hdp为对照组5、asa@hdp为对照组6，dox/asa@hdp为实验组)处理对瘤内血小板激活表型蛋白表达量的影响。
具体实施方式
47.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并
不用于限定本发明。
48.本发明提供的一种用于抑制术后肿瘤复发和转移的载药水凝胶的制备方法，如图1所示，包括如下步骤：
49.(1)将1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(edc)、n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)与透明质酸的水溶液混合搅拌，并保持溶液为弱酸性，对所述透明质酸的羧基进行活化，得到活化的前驱体溶液；
50.(2)将步骤(1)所述活化的前驱体溶液与3-氨基苯硼酸(apba)和盐酸多巴胺混合，在惰性气体保护和弱酸性条件下反应，使所述3-氨基苯硼酸(apba)和盐酸多巴胺通过酰胺缩合反应接枝到所述透明质酸的骨架上，得到粗产物；
51.(3)将步骤(2)所述粗产物在酸性超纯水中进行透析，透析得到的液体调节ph至中性后在空气中进行搅拌，利用空气中的氧气使多巴胺氧化聚合，然后冷冻干燥得到用于载药的水凝胶。
52.一些实施例中，步骤(1)所述1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(edc)、n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)与透明质酸的质量比为(0.4-0.8)：(0.1-0.5)：1，所述透明质酸的水溶液中透明质酸的质量百分数为0.5-1.5％；步骤(1)所述活化其活化时间为10-40分钟。
53.一些实施例中，步骤(1)所述弱酸性和步骤(2)所述弱酸性，其ph＝5-6。
54.一些实施例中，步骤(2)所述3-氨基苯硼酸(apba)和盐酸多巴胺的摩尔比为3:1-1:3，所述盐酸多巴胺与所述透明质酸的质量比为0.28～1.1:1。步骤(2)所述惰性气体为氩气或氮气，所述反应其反应时间为12-36小时。
55.一些实施例中，步骤(3)将所述粗产物转移到透析袋中，所述透析袋的截留分子量10000-14000da，在超纯水中添加稀盐酸得到酸性超纯水(超纯水中添加稀盐酸)中(ph＝5)透析2-4天，期间每4-8h换一次酸性超纯水，然后通过加入碱液将所述透析得到的液体调节ph至中性，然后将透析过后的溶液在搅拌器上进行搅拌，通过空气中的氧气进行3-8h的氧化后将水凝胶产物进行冷冻成固体，再于真空冷冻冻干机中进行冷冻干燥24-72小时，得到所述用于载药的水凝胶。
56.本发明上述制备方法得到的载药的水凝胶，可包载荧光分子模型药物比如icg和cy5.5，模拟小分子药物在动物体内的滞留情况；也可用于包载抗肿瘤药物和能够改善肿瘤微环境的药物，所述抗肿瘤药物包括阿霉素、紫杉醇和喜树碱等中的一种或多种，所述能够改善肿瘤微环境的药物包括二甲双胍和/或阿司匹林等。。将水凝胶与抗肿瘤药物和/或能够改善肿瘤微环境的药物在pbs溶液中混合均匀后，静置即得到载药水凝胶。一些实施例中，所述载药水凝胶中药物的负载量为小于或等于100μg/mg。
57.本发明提供的载药水凝胶经实验证实可用于制备术后治疗和/或抑制肿瘤的药物，还可以制备抑制术后肿瘤脂肪细胞新生和/或抑制术后肿瘤血管生成的药物，并且还能够抑制肿瘤术后血小板的激活。
58.本发明提供一种用于肿瘤术后治疗的载药水凝胶及其制备方法，可对化疗药物或者其他干预药物进行包裹。本发明提供的水凝胶支架材料，具备良好生物相容性、生物粘附性、溶胀特性和ph响应性。柔韧的流变特性和优秀的生物粘附性可保证其稳定的粘附于切除伤口处而不移位，缓慢且ph响应性释放以及体内保证药物长时间滞留的特征使水凝胶能够对肿瘤微环境进行响应并维持肿瘤切除微环境长期处于足够的药物浓度。
59.本发明优选实施例中通过一锅法将多巴胺和apba接枝到ha骨架上，同时加载化疗药物dox和met，构建载药水凝胶(dox/met@hdp)用于乳腺癌的术后复发和转移，研究此载药水凝胶性能、细胞水平上直接杀伤肿瘤细胞、抑制脂肪细胞诱导的肿瘤细胞生长和迁移以及对血管新生的影响，并在动物水平上评价其对肿瘤切除后复发转移的干预效果。同时加载化疗药物dox和asa，也具有同样良好的肿瘤术后复发转移抑制效果。
60.以下为实施例：
61.实施例1
62.不同多巴胺/3-氨基苯硼酸比例的接枝有多巴胺和3-氨基苯硼酸的透明质酸水凝胶及其制备方法
63.1、实验材料和试剂
64.透明质酸(ha)、盐酸多巴胺(da)、3-氨基苯硼酸(apba)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(edc)、n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)。
65.2、实验步骤
66.1)称取1g ha粉末加入100ml超纯水中，将烧杯置于磁力搅拌器上搅拌直至ha完全溶解，得到质量分数为1％的ha溶液。将ha溶液置于圆底烧瓶中，采用循环水式真空水泵将烧瓶抽至真空，并充入氩气保护以防止氧化。
67.2)称取575mg edc和345mg nhs，依次缓慢加入ha溶液中，通过加入盐酸和氢氧化钠溶液保持溶液ph值在5和6之间。搅拌活化20min后，称取不同物质的量比例的apba和盐酸多巴胺，依次缓慢加入混合体系中，整个体系在保持氩气保护和酸性ph 5.5下反应24h。
68.3)将反应得到的体系转移到透析袋中(截留分子量14000da)，在酸性超纯水中(ph＝5)透析4天，期间每8h换一次酸性超纯水。通过加入氢氧化钠溶液将透析得到液体的ph调整到7.4后，然后将透析过后的溶液在搅拌器上进行搅拌，通过空气中的氧气氧化处理4h，然后将水凝胶产物进行冷冻成固体，再于真空冷冻冻干机中进行冷冻干燥72小时，得到海绵状产物。
69.4)称取10mg上述产物，加入200μl pbs制得质量分数为5％的hdp水凝胶。
70.其他条件同步骤1)至步骤4)，不同的是合成过程中，步骤3)只加入盐酸多巴胺，不加入apba，制备得到hd水凝胶。
71.其他条件同步骤1)至步骤4)，不同的是合成过程中，步骤3)只加入apba，不加入盐酸多巴胺，制备得到hp水凝胶。
72.3、实验结果
73.五种多巴胺/apba配比的hdp水凝胶剪切粘度相似，当多巴胺与apba比例为3:1、2:1、1:1、1:2、1:3的剪切粘度分别为5.42
×
103pa
·
s、5.59
×
103pa
·
s、7.38
×
103pa
·
s、7.56
×
103pa
·
s、9.28
×
103pa
·
s(图2内容a、内容b和内容c)。不同多巴胺/apba配比的hdp水凝胶的g
′
始终高于g
″
，表示均具备稳定的粘弹性状态。
74.hdp水凝胶具有较强的生物粘附强度，其中多巴胺与apba比例为1:1的hdp水凝胶具有最高的临界抗拉强度(9.24kpa)，其他比例水凝胶则较低(多巴胺与apba比例为3:1、2:1、1:2、1:3的临界抗拉强度分别为2.84kpa、5.47kpa、4.58kpa、6.34kpa)(图3内容a、内容b和内容c)。
75.实施例2
76.按照实施例方法制备得到的多巴胺/3-氨基苯硼酸比例为1:1的接枝有多巴胺和3-氨基苯硼酸的透明质酸水凝胶。
77.(1)水凝胶形态
78.由图4内容a中可以看出，水凝胶以5％的浓度成胶后可以在倾斜的样品瓶中保持原有形态，不具有流动性，具备水凝胶的基本形态。
79.(2)可愈合特性
80.由图4内容b和内容c中可知，当hdp水凝胶被切割后，hdp中存在的可逆苯硼酸酯键发生断裂，断面在切割后进行持续三分钟的接触后硼酸酯键逐渐重新连接，即可愈合，并可接受较大拉伸力，赋予hdp水凝胶较优秀的可愈合性能。这保证水凝胶在肿瘤切除腔中能够应对可能存在的剪切应力，维持完整水凝胶形态。
81.(3)粘附作用
82.由图4内容d和内容f中可知，hdp水凝胶对于乳胶手套和小鼠肝脏都具有较好粘附性，提示水凝胶具有稳定粘附于肿瘤切除腔内不移位的潜能。
83.(4)延展性
84.由图4内容e中可知，hdp水凝胶可粘附于手指上，并根据手指关节的弯曲程度进行相应的形变，具备较好的延展性和附着性。这种特性可以保证hdp水凝胶应对不同切除面并稳定贴合，防止在复杂的肿瘤切除腔环境中因为被植入者的行为举止导致hdp水凝胶的脱落和断裂。
85.(5)拉伸性
86.hdp可承受较大拉伸力，被拉伸至原有长度的4.8倍而不断裂(图4内容g)。这种较好的拉伸性可保证hdp在复杂的肿瘤切除腔环境中保持稳定的水凝胶状态。
87.图5内容a结果显示,hdp呈现多孔蜂窝状网络结构，具有较为均匀且致密的孔洞，通过image j软件对电镜图片中的孔径进行统计得出其平均孔径为39.7μm(图5内容b)，这为hdp具有较好载药性创造了条件。
88.对比例1
89.1)称取1g ha粉末加入100ml超纯水中，将烧杯置于磁力搅拌器上搅拌直至ha完全溶解，得到质量分数为1％的ha溶液。将ha溶液置于圆底烧瓶中，采用循环水式真空水泵将烧瓶抽至真空，并充入氩气保护以防止氧化。
90.2)称取575mg edc和345mg nhs，依次缓慢加入ha溶液中，通过加入盐酸和氢氧化钠溶液保持溶液ph值在5和6之间。搅拌活化20min后，称取不同物质的量比例的apba和盐酸多巴胺，依次缓慢加入混合体系中，整个体系在保持氩气保护和酸性ph 5.5下反应24h。
91.3)将反应得到的体系转移到透析袋中(截留分子量14000da)，在酸性超纯水中(ph＝5)透析4天，期间每8h换一次酸性超纯水。通过加入氢氧化钠溶液将透析得到液体的ph调整到7.4后，将水凝胶产物进行冷冻成固体，再于真空冷冻冻干机中进行冷冻干燥72小时，得到海绵状产物。
92.4)称取10mg上述产物，加入170μl超纯水混匀后，加入10μl h2o2溶液(0.5mol l-1
)和20μl hrp辣根过氧化物酶溶液(1mg ml-1
)，并搅匀。制得质量分数为5％的hdp-1水凝胶。
93.对比例1和实施例1制备水凝胶的其他步骤相同，不同在于实施例1步骤(4)中在空气中搅拌氧化得到hdp水凝胶，而对比例1采用过氧化氢和辣根过氧化物酶制备得到hdp-1
水凝胶。实验中偶然发现，采用对比例1的氧化方式得到的水凝胶降解速度很慢，势必会影响后续载药后的药物释放速度，使药物释放速度太慢。为此尝试直接在空气中搅拌数小时，利用空气中的氧气对多巴胺进行氧化，得到了降解速度适中的水凝胶hdp。
94.将实施例1和对比例1得到的水凝胶分别在ph＝7、37℃、100rpm恒温摇床中条件下测试水凝胶降解速度，实验发现对比例1得到的hdp-1水凝胶降解需要的时间为95天，而实施例1得到的hdp水凝胶降解需要的时间仅为30天。可见，本发明实施例中通过一锅法制备得到的hdp水凝胶，其多巴胺氧化聚合的方式对最终得到的凝胶的降解速度有较大的影响。空气氧化可能使得hdp具有中的多巴胺的氧化程度较低且可控。
95.另外，其他实验条件同实施例1，改变步骤3)通过空气中的氧气氧化处理时间分别为36小时和48小时，测试发现其降解速度同样较慢，分别需要56天和65天。
96.实施例3
97.多巴胺/3-氨基苯硼酸比例为1:1的接枝有多巴胺和3-氨基苯硼酸的透明质酸水凝胶(hdp)药物负载能力以及药物释放特性
98.1、实验材料和试剂
99.透明质酸(ha)、盐酸多巴胺(da)、3-氨基苯硼酸(apba)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(edc)、n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)、盐酸阿霉素(dox)、盐酸二甲双胍(met)。
100.2、实验步骤
101.1)水凝胶制备同实施例1(多巴胺/3-氨基苯硼酸比例为1:1)。
102.2)称取10mg实施例1制备得到的hdp，加入200μl含有60μg ml-1
dox和30mg ml-1
met的pbs中混匀后静置30min，即得到双载药水凝胶dox/met@hdp。
103.3)取10ml离心管，将200μl dox/met@hdp浸入5ml不同ph(ph＝6.5、7.4)的pbs溶液中，将释放体系放置在恒温振荡器中进行药物释放实验，设定温度为37℃，摇床速度为100rpm。在不同时间点(1h、2h、4h、8h、12h、24h、36h、48h、72h等)取出1ml释放液，同时补充1ml新鲜pbs到释放体系，用1260型高效液相色谱仪测定释放液dox和met浓度，计算累计药物释放量。
104.3、实验结果
105.研究了dox/met@hdp在不同ph条件下的体外释药性能(图6内容a和内容b)。dox/met@hdp在ph＝7.4时，dox在120h的释放量约为40.3％，而在ph＝6.5时则为88.2％(图6内容a)；同样，dox/met@hdp在ph＝7.4时，met在8h的释放量约为38.5％，而ph＝6.5时为58.6％(图6内容b)，表明dox/met@hdp具有ph响应性的药物释放性能。dox/met@hdp的ph响应性释放可能是由于hdp水凝胶网络中苯硼酸酯键在低ph下断裂，有助于dox和met在肿瘤酸性微环境的快速释放。dox/met@hdp中dox和met的释放动力学不同可能是由于dox和met在pbs中的溶解度不同，以及dox与聚多巴胺之间的π-π堆积或氢键相互作用。
106.dox和met的载入对hdp的剪切粘度(图7内容a)以及g
′
和g
″
随频率(图7内容b)和应变程度(图7内容c)的变化均没有明显的影响，表明dox@hdp、met@hdp和dox/met@hdp均具有稳定的水凝胶特性。hdp为对照组一，dox@hdp为对照组二，met@hdp为对照组三，dox/met@hdp为实验组。
107.实施例4：多巴胺/3-氨基苯硼酸比例为1:1的接枝有多巴胺和3-氨基苯硼酸的透
明质酸水凝胶药物负载能力以及体内药物滞留特性
108.1、实验材料和试剂
109.透明质酸(ha)、盐酸多巴胺(da)、3-氨基苯硼酸(apba)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(edc)、n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)、cyanine 5.5carboxylic acid(cy5.5)、indocyanine green(icg)。
110.2、实验步骤
111.1)水凝胶制备同实施例1。
112.2)称取10mg hdp，加入200μl含1μg ml-1
cy5.5和1μg ml-1
icg的pbs中混匀，得到双载药水凝胶cy5.5/icg@hdp。
113.3)选取对数生长期4t1细胞，消化重悬后进行细胞计数，用pbs稀释密度至1
×
107ml-1
。将6周龄雌性balb/c小鼠进行麻醉，剪开小鼠右侧第四对乳腺周围皮肤，将50μl混匀细胞悬液注入脂肪垫后进行缝合，随后涂抹碘伏并对小鼠采取保温措施直至苏醒。所用手术器械均经过严格灭菌处理。待肿瘤体积达到300mm3时进行手术切除。先对小鼠进行备皮处理，将小鼠肿瘤附近毛发进行修剪并用碘伏进行消毒，将小鼠麻醉后在肿瘤周围将皮肤剪开，去除90％左右的实体肿瘤，用棉球擦拭血液，将水凝胶材料置于肿瘤切除腔后，将伤口缝合并用碘酒擦拭、保持体温直至小鼠苏醒。
114.4)构建4t1乳腺癌手术切除模型并植入cy5.5/icg@hdp，对照组小鼠采取向切除腔内注入与实验组等量的游离cy5.5和icg混合溶液的给药方式。在术后3h、6h、9h、12h、24h、36h、48h、72h等时间点，使用ivis lumina xr型小动物成像系统对小鼠体内的cy5.5和icg荧光进行成像和拍照，并对荧光总量进行统计分析。并在术后10天，对小鼠进行解剖，取出肿瘤及相关脏器(心、肝、脾、肺、肾)进行离体成像，对肿瘤和不同脏器中cy5.5和icg荧光总量进行统计分析。
115.3、实验结果
116.从活体成像系统(ivis)的荧光图像可以看出，植入cy5.5/icg@hdp的小鼠cy5.5(图8内容a)和icg(图8内容c)的荧光信号减弱速率明显慢于注射游离cy5.5/icg溶液的小鼠。游离cy5.5/icg组的cy5.5荧光在切除肿瘤后第10天减弱至不可见，而cy5.5/icg@hdp组荧光清晰明亮；48h时游离cy5.5/icg组中icg荧光消失，而cy5.5/icg@hdp组荧光仍然较为明显。从统计数据来看，cy5.5/icg@hdp组的cy5.5(图8内容b)和icg(图8内容d)药物滞留程度显著优于游离cy5.5/icg组。植入后第10天，cy5.5/icg@hdp组的cy5.5荧光值为6.45
×
108photons s-1
cm-2
sr-1
，而游离cy5.5/icg组仅为3.06
×
108photons s-1
cm-2
sr-1
；植入后48h时，cy5.5/icg@hdp组的icg荧光值为3.68
×
109photons s-1
cm-2
sr-1
，而游离cy5.5/icg组仅为0.54
×
109photons s-1
cm-2
sr-1
。由此可知，hdp水凝胶可以明显增加cy5.5和icg在肿瘤部位的滞留量，表明dox/met@hdp也具有将dox和met高效滞留于肿瘤部位的能力。通过在第10天将小鼠安乐死，取出肿瘤和主要器官后进行荧光成像拍照，分析给药后组织内药物浓度。从离体组织荧光图像可以看出(图9内容a和内容c)，cy5.5/icg@hdp组小鼠肿瘤部位的cy5.5和icg荧光值均高于其他器官(心、肝、肺、脾、肾)。且cy5.5/icg@hdp组肿瘤部位的cy5.5和icg荧光值均明显高于游离cy5.5/icg组(图9内容b和内容d)。以上数据证明cy5.5/icg@hdp可提高肿瘤部位药物浓度，降低主要器官内药物浓度。游离cy5.5/icg组为对照组，cy5.5/icg@hdp组为实验组。
117.实施例5：多巴胺/3-氨基苯硼酸比例为1:1的接枝有多巴胺和3-氨基苯硼酸的透明质酸水凝胶负载盐酸阿霉素和盐酸二甲双胍用于杀伤肿瘤细胞
118.1、实验材料和试剂
119.透明质酸(ha)、盐酸多巴胺(da)、3-氨基苯硼酸(apba)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(edc)、n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)、盐酸阿霉素(dox)、盐酸二甲双胍(met)、4t1乳腺癌细胞。
120.2、实验步骤
121.1)水凝胶制备同实施例1。
122.2)称取10mg hdp，加入200μl含有60μg ml-1
dox和30mg ml-1
met的pbs中混匀后静置30min，即得到双载药水凝胶dox/met@hdp。同样的方法，获得单载药dox@hdp、met@hdp。
123.3)收集hdp、dox@hdp、met@hdp、dox/met@hdp水凝胶于pbs(37℃恒温摇床，100rpm)中释放7天的释放液。将对数生长期的4t1细胞以8
×
103/孔的密度接种在96孔板中并培养过夜，舍弃原培养基并分别用含有pbs、hdp释放液、dox、met、dox@hdp释放液、met@hdp释放液、dox/met@hdp释放液的培养基处理4t1细胞，其中dox和met的药物浓度分别为dox/met＝0.25μg ml-1
/125μg ml-1
、0.5μg ml-1
/250μg ml-1
、1μg ml-1
/500μg ml-1
、2μg ml-1
/1000μg ml-1
。处理细胞24h后，去除原培养基并更换为含有cck-8试剂的新鲜培养基进行显色反应，显色结束后使用全波长酶标仪对培养液在450nm波长处的吸光度进行检测，计算dox/met@hdp处理后的4t1细胞存活率。
124.(4)将对数生长期的4t1细胞处理24h后(dox和met的药物浓度分别为1μg ml-1
和500μg ml-1
)，收集上清并通过胰酶消化收集底层贴壁细胞，300g离心5min，去除上清后pbs清洗三遍，加入100μl含有5μl annexin v-fitc和10μl 7-aad的染色工作液重悬混匀，避光孵育10～15min，孵育结束后加入300μl缓冲液并置于冰上，于1h内通过流式细胞仪进行检测，研究dox/met@hdp诱导4t1细胞凋亡比例情况。
125.(5)将对数生长期4t1细胞处理24h后，收集上清并通过胰酶消化收集底层贴壁细胞，300g离心5min，去除上清后pbs清洗三遍，随后加入300μl含有2μm钙黄绿素乙酰氧基甲基酯和4.5μm碘化丙啶的染色工作液并重悬混匀，于37℃下避光孵育15min，孵育结束后以300g离心5min，去除上清并用pbs清洗两遍，将pbs重悬的细胞悬液滴加到共聚焦皿中，通过激光共聚焦显微镜进行观测，活细胞被calcein-am标记为绿色而死细胞被pi标记为红色，检测dox/met@hdp诱导的4t1细胞活死变化。pbs为对照组1、hdp为对照组2、dox为对照组3、met为对照组4、、dox@hdp为对照组5、met@hdp为对照组6、dox/met@hdp为实验组。
126.3、实验结果
127.如图10内容a所示，每一个阿霉素浓度条件下的柱状图从左到右分别对应对照组1、对照组2、对照组3、对照组4、对照组5、对照组6实验组，各浓度hdp均不影响4t1细胞的存活，进一步证明hdp具有良好的生物安全性。而对于met和met@hdp组，在met高浓度时对4t1细胞存活具有轻微影响。在不同dox浓度下的dox、dox@hdp和dox/met@hdp组细胞存活均较低，且随着dox浓度的升高杀伤效果更加明显，具有很强的浓度依赖性。当dox浓度低于1μg ml-1
时，dox/met@hdp释放的met会略微增加dox的杀伤效果，使其具有最低的细胞存活率。而当dox浓度高于1μg ml-1
，效果则不明显。
128.如图10内容b所示(柱状图从左只有分别对应对照组1、对照组2、对照组3、对照组
4、对照组5、对照组6和实验组)，pbs、hdp、met和met@hdp组的细胞凋亡均不明显，dox和dox@hdp引起4t1细胞相同程度的凋亡，而dox/met@hdp由于met的协同作用则导致了更强的4t1凋亡。
129.如图10内容c所示，经过pbs、hdp、met和met@hdp处理的4t1细胞几乎都是绿色标记的活细胞，只有零星红色标记的死细胞，证明其对4t1细胞几乎不具有杀伤效果。而经过dox、dox@hdp和dox/met@hdp处理的4t1细胞具有较多、较密集的红色标记的死细胞，上述结果表明，dox/met@hdp对4t1细胞具有良好的杀伤性。
130.实施例6
131.多巴胺/3-氨基苯硼酸比例为1:1的接枝有多巴胺和3-氨基苯硼酸的透明质酸水凝胶负载盐酸阿霉素和盐酸二甲双胍用于抑制脂肪细胞及其相关功能
132.1、实验材料和试剂
133.透明质酸(ha)、盐酸多巴胺(da)、3-氨基苯硼酸(apba)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(edc)、n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)、盐酸阿霉素(dox)、盐酸二甲双胍(met)、3t3-l1小鼠胚胎成纤维细胞。
134.2、实验步骤
135.1)水凝胶制备同实施例2。
136.2)称取10mg hdp，加入200μl含有60μg ml-1
dox和30mg ml-1
met的pbs中混匀后静置30min，即得到双载药水凝胶dox/met@hdp。
137.3)脂肪细胞诱导过程：将3t3-l1小鼠胚胎成纤维细胞以5
×
104/孔的密度接种在24孔板中，待细胞增殖融合度达到100％后，将培养基更换为脂肪细胞分化培养基继续培养，每两天进行细胞换液。分化四天后将培养基替换为脂肪细胞维持培养基，每两天进行细胞换液。分化第十天将培养基替换为dmem完全培养基，脂肪细胞即诱导成功。
138.4)收集hdp、dox@hdp、met@hdp、dox/met@hdp水凝胶于pbs(37℃恒温摇床，100rpm)中释放7天的释放液。将24孔板中分化完成的脂肪细胞的原培养基舍弃，并分别加入含有pbs、hdp释放液、dox、met、dox@hdp释放液、met@hdp释放液、dox/met@hdp释放液的培养基。处理48h后去除上清，胰酶消化收集处理后的脂肪细胞，随后加入200μl含有2μm bodipy 493/503的pbs溶液，于37℃下避光孵育15min，随后离心并用pbs洗涤三次，通过流式细胞仪检测bodipy荧光强度，研究dox/met@hdp对脂肪细胞脂质含量的影响。5)使用4)相同方式处理脂肪细胞48h，收集脂肪细胞到1.5ml无核酶离心管，加入1ml trizol混匀，随后加入200μl氯仿并剧烈震荡15s后静置5min，13800g离心15min(4℃)，沿上液面吸取500μl上清与500μl异丙醇混匀，继续静置15min后13800g离心10min(4℃)，弃去上清，用75％乙醇清洗后5400g离心5min(4℃)，重复三次后将沉淀静置至沉淀透明，最后加入15～20μl depc水溶解，测定其rna浓度。rna保存方式是-80℃超低温冰箱保存。取1μg rna，采用hiscript
○
r r ii q rt supermix将rna逆转录为cdna，并按照taq pro universal sybr qpcr master mix说明书所述方法加入引物和cdna，于实时定量pcr仪上进行rt-qpcr。所用引物如下表所示：
139.表1所用引物序列
[0140][0141]
5)使用相同方式处理脂肪细胞48h，舍弃培养基后缓慢加入300μl无血清培养基继续孵育12h，收集上清后采用小鼠il-6检测试剂盒检测脂肪细胞分泌的il-6含量。
[0142]
6)脂肪细胞和4t1细胞共孵育体系采用24孔transwell(0.4μm)培养板进行。将对数生长期4t1细胞以2
×
104/孔的密度接种在24孔板中并培养过夜，舍弃培养基后加入600μl新鲜无血清培养基。使用相同方式处理脂肪细胞48h，通过胰酶消化收集处理后的脂肪细胞并用200μl无血清培养基重悬，将脂肪细胞置于transwell上室中，与培养过夜的4t1细胞共孵育48h后，去除原培养基，更换为含有cck-8试剂的新鲜培养基进行显色反应，显色结束后使用全波长酶标仪对450nm波长处的吸光度进行检测，研究dox/met@hdp作用于脂肪细胞后对肿瘤细胞增殖的影响。
[0143]
7)建立4t1细胞划痕模型后，使用相同方式处理脂肪细胞48h，胰酶消化并收集处理后的脂肪细胞，采用200μl无血清培养基重悬，将处理后脂肪细胞置于transwell(0.4μm)上室中，与4t1细胞划痕共孵育培养24h。在共孵育培养的0h和24h使用倒置显微镜对4t1细胞划痕愈合情况进行观察和拍照，划痕面积通过image j软件进行统计，研究dox/met@hdp作用于脂肪细胞后对4t1细胞迁移的影响。
[0144]
8)脂肪细胞和4t1细胞共孵育体系采用24孔transwell(8μm)培养板进行。使用相同方式处理脂肪细胞48h，舍弃原培养基后更换为新鲜无血清培养基。取对数生长期4t1细胞以8
×
104/孔的密度接种在transwell(8μm)上室中，与处理后的脂肪细胞共孵育培养10h。培养结束后取出上室，用棉签将上表面的细胞轻轻擦拭去除，并用pbs清洗，随后用4％多聚甲醛固定液对小室底部迁移的4t1细胞固定10min，pbs洗涤后使用0.1％结晶紫染色，用pbs洗涤去除多余染料，使用倒置显微镜对染色后4t1细胞进行观察和拍照。
[0145]
无脂肪细胞共孵育组为对照组，pbs为对照组1、hdp为对照组2、dox为对照组3、met为对照组4、、dox@hdp为对照组5、met@hdp为对照组6或dox/met@hdp为实验组。图11内容a至内容f，每一个内容中的柱状图从左至右分别对应对照组1、对照组2、对照组3、对照组4、对照组5、对照组6和实验组。
[0146]
3、实验结果
[0147]
由图11内容a中可知，经过处理后各组脂肪细胞存活率没有显著性差异，表明dox/met@hdp并不会对诱导后的脂肪细胞产生明显的细胞毒性。
[0148]
如图11内容b中bodipy是脂质染料，其荧光强度可以反映脂肪细胞内脂质的多少所示，与pbs组相比，dox和dox@hdp对脂肪细胞脂质无明显影响，而经过met、met@hdp和dox/met@hdp处理则显著降低了脂肪细胞内的脂质含量，其降低比率分别为20.3％、21.5％和21.9％。因此dox/met@hdp表现出影响脂肪细胞功能的潜能。
[0149]
由图11内容c可知，hdp、dox或dox@hdp处理对脂肪细胞il-6的分泌无明显影响。
pbs组上清中il-6的浓度为4.0ng ml-1
，而met、met@hdp或dox/met@hdp处理后上清中il-6含量仅为1.86ng ml-1
、1.82ng ml-1
和1.81ng ml-1
，相比pbs组明显降低，表明dox/met@hdp可有效抑制脂肪细胞功能。
[0150]
由图11内容d、内容e和内容f可知，met、met@hdp或dox/met@hdp处理可显著降低能促进肿瘤细胞增殖和迁移的炎症相关因子il-6和抵抗素的mrna表达水平，分别只有对照组pbs的33.8％、42.6％、46.6％和79.6％、71.6％、68.3％，而其他各组之间没有明显的趋势。脂联素能抑制肿瘤发展，经met、met@hdp或dox/met@hdp处理后的脂联素mrna表达明显上调，是pbs组表达量的1.7倍左右，而其他各组之间没有明显的趋势。但瘦素的表达量经过各组处理后均没有呈现明显差异。dox/met@hdp可有效调控脂肪细胞脂肪因子mrna的表达水平。
[0151]
图12内容a至内容e中，从左至右的样品，分别对应对照组、脂肪细胞+对照组1、脂肪细胞+对照组2、脂肪细胞+对照组3、脂肪细胞+对照组4、脂肪细胞+对照组5、脂肪细胞+对照组6以及脂肪细胞+实验组。由图12内容a可知，与脂肪细胞共孵育的pbs组4t1细胞增殖明显高于未加脂肪细胞组(1.9倍)，证实脂肪细胞能促进4t1细胞增殖。hdp、dox或dox@hdp组处理对4t1细胞增殖则无明显影响。而经met、met@hdp或dox/met@hdp组处理则减缓了脂肪细胞促4t1细胞增殖作用，仅约为无脂肪细胞组的1.3倍，表明dox/met@hdp可有效抑制脂肪细胞诱导的肿瘤细胞增殖。
[0152]
由图12内容b和内容c中可知，0h时各组初始划痕距离相当，共孵育24h后无脂肪细胞组划痕还保留较大间隙，而pbs组划痕基本愈合，表面脂肪细胞可促进4t1细胞的迁移。hdp、dox或dox@hdp处理组对脂肪细胞促进的划痕愈合无明显影响。而met、met@hdp和dox/met@hdp处理组的4t1细胞划痕仍保留较大间隙。通过image j软件对划痕面积进行量化后得到的结果与观察结果保持一致，表明dox/met@hdp减缓了脂肪细胞促进的4t1细胞迁移。
[0153]
由图12内容d和内容e中可知，hdp、dox或dox@hdp处理脂肪细胞则对迁移4t1细胞数目无明显影响，而met、met@hdp或dox/met@hdp，处理组的迁移4t1细胞数目相对pbs组明显减少，对迁移4t1细胞数目进行定量统计也得出一致结果。
[0154]
实施例7
[0155]
多巴胺/3-氨基苯硼酸比例为1:1的接枝有多巴胺和3-氨基苯硼酸的透明质酸水凝胶负载盐酸阿霉素和盐酸二甲双胍于4t1乳腺癌原位肿瘤切除术后抗肿瘤效果研究
[0156]
1、实验材料和试剂
[0157]
透明质酸(ha)、盐酸多巴胺(da)、3-氨基苯硼酸(apba)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(edc)、n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)、盐酸阿霉素(dox)、盐酸二甲双胍(met)、4t1乳腺癌细胞。
[0158]
2、实验步骤
[0159]
1)水凝胶制备同实施例1。
[0160]
2)称取10mg hdp，加入200μl含有60μg ml-1
dox和30mg ml-1
met的pbs中混匀后静置30min，即得到双载药水凝胶dox/met@hdp。
[0161]
3)将6周龄雌性balb/c小鼠随机分为8组，每组6只，构建4t1乳腺癌手术切除模型。分别植入hdp、dox@hdp、met@hdp、dox/met@hdp，与此同时pbs、dox、met、dox/met组通过将药物溶液注入肿瘤切除腔内进行给药(dox给药量为0.6mg kg-1
，met给药量为300mg kg-1
)。通
过游标卡尺对肿瘤体积进行持续监测(肿瘤体积＝肿瘤长径
×
肿瘤短径
×
肿瘤短径
×
0.5)，并同时持续监测小鼠体重，如图13内容b所示。pbs为对照组1、hdp为对照组2、dox为对照组3、met为对照组4、dox/met为对照组5、dox@hdp为对照组6、met@hdp为对照组7或dox/met@hdp为实验组。
[0162]
3、实验结果
[0163]
如图13内容b、内容c、内容d、内容e、内容f、内容g、内容h、内容i和内容j所示，与预期相符，hdp和met处理均无明显抑瘤效果，而dox和dox/met处理的小鼠肿瘤较pbs组相比复发略慢，其肿瘤抑制率分别为31.6％和32.8％；dox@hdp和met@hdp的抑制效果好于dox，抑制率分别提高至61.2％和48.9％，而dox/met@hdp组相比于pbs组的抑制率高达89.8％，具有最好的抑瘤效果。
[0164]
通过肿瘤的照片(图14内容a)以及重量统计(图14内容b)可以得出与上述肿瘤体积一致的结论，dox和dox/met的抑瘤率仅为20.1％和30.5％，dox@hdp和met@hdp抑瘤率分别为49.9％和66％，而dox/met@hdp处理后的荷瘤小鼠复发程度最慢，相比于pbs组具有最好的抑瘤效果，抑瘤率高达87.2％。通过肿瘤的h&e染色切片也可以看出，dox/met@hdp组处理后增殖细胞的面积最小且坏死区域面积最大(图14内容c)。
[0165]
实施例8
[0166]
多巴胺/3-氨基苯硼酸比例为1:1的接枝有多巴胺和3-氨基苯硼酸的透明质酸水凝胶负载盐酸阿霉素和盐酸二甲双胍用于抑制huvecs(人脐静脉内皮细胞)其相关功能。
[0167]
如图15所示，各组处理对huvecs细胞小管形成的影响。收集hdp、dox@hdp、met@hdp、dox/met@hdp水凝胶于pbs(37℃恒温摇床，100rpm)中释放7天的释放液。经pbs(对照组1)、hdp释放液(对照组2)、dox(对照组3)、met(对照组4)、dox@hdp释放液(对照组5)、met@hdp释放液(对照组6)和dox/met@hdp释放液(实验组)(dox浓度为1μg ml-1
，met浓度为500μg ml-1
)处理的huvecs细胞小管形成实验代表性图片(标尺：100μm)(内容a)以及对网格数量(内容b)、网格面积(内容c)以及成管总长度(内容d)的定量分析(n＝6)。dox/met@hdp处理对huvecs细胞划痕愈合的影响。内容e，内容f为经pbs、hdp释放液、dox、met、dox@hdp释放液、met@hdp释放液或dox/met@hdp释放液(dox浓度为1μg ml-1
，met浓度为500μg ml-1
)处理的huvecs细胞划痕愈合的代表性图像(标尺：100μm)(内容e)以及划痕面积统计(f)(n＝6)。
[0168]
在临床肿瘤切除术中大量血管被破坏，血管新生是肿瘤在切除后重建营养供应和复发的必要条件。为了探讨dox/met@hdp对血管生成的影响，采用pbs、hdp释放液、dox、met、dox@hdp释放液、met@hdp释放液或dox/met@hdp释放液(含有1μg ml-1
dox和500μg met)处理huvecs细胞，4h后观察小管形成情况。如内容a所示，pbs、hdp、dox、dox@hdp组huvecs形成的小管网络分支多、密集、规则且高度相交，而met、met@hdp、dox/met@hdp组形成的小管网络稀疏且不完整，多不能形成完整闭环。通过image j软件对形成的网格数量、网格覆盖面积和总管长度进行定量分析(内容b、内容c、内容d)发现，met、met@hdp或dox/met@hdp组在各项指标的统计结果均显著少于对照组，表明dox/met@hdp对huvecs的小管形成具有明显的抑制作用。
[0169]
除去小管形成，huvecs的迁移能力也是血管生成的重要指标，故采用细胞划痕愈合实验对dox/met@hdp处理的huvecs迁移能力进行研究。在各组初始划痕面积相等的前提下，pbs、hdp、dox、dox@hdp处理组huvecs细胞划痕愈合速度较快，在24h时具有较小空隙(内
容e)；而met、met@hdp和dox/met@hdp处理组24h仍具有相对较大空隙，细胞迁移较为缓慢。对各组细胞划痕面积进行定量分析(内容f)也得出一致结论，表明dox/met@hdp可显著抑制血管新生。
[0170]
实施例9
[0171]
多巴胺/3-氨基苯硼酸比例为1:1的接枝有多巴胺和3-氨基苯硼酸的透明质酸水凝胶负载盐酸阿霉素和盐酸二甲双胍于4t1乳腺癌原位肿瘤切除术后改善脂肪细胞及抑制血管生成研究。
[0172]
1、实验材料和试剂
[0173]
透明质酸(ha)、盐酸多巴胺(da)、3-氨基苯硼酸(apba)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(edc)、n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)、盐酸阿霉素(dox)、盐酸二甲双胍(met)、4t1乳腺癌细胞。
[0174]
2、实验步骤
[0175]
1)水凝胶制备同实施例1。
[0176]
2)称取10mg hdp，加入200μl含有60μg ml-1
dox和30mg ml-1
met的pbs中混匀后静置30min，即得到双载药水凝胶dox/met@hdp。
[0177]
3)将6周龄雌性balb/c小鼠随机分为8组，每组6只，构建4t1乳腺癌手术切除模型。分别植入hdp、dox@hdp、met@hdp、dox/met@hdp，与此同时pbs、dox、met、dox/met组通过将药物溶液注入肿瘤切除腔内进行给药(dox给药量为0.6mg kg-1
，met给药量为300mg kg-1
)。通过对治疗后的小鼠肿瘤进行免疫荧光染色，探究dox/met@hdp对脂肪细胞和血管生成的影响，如图16所示。pbs为对照组1、hdp为对照组2、dox为对照组3、met为对照组4、dox/met为对照组5、dox@hdp为对照组6、met@hdp为对照组7，dox/met@hdp为实验组。
[0178]
3、实验结果
[0179]
图16为dox/met@hdp对4t1原位肿瘤术后肿瘤中il-6和cd31表达的影响。4t1原位肿瘤切除后经pbs、hdp、dox、met、dox/met、dox@hdp、met@hdp或dox/met@hdp(dox：0.6mg kg-1
，met：300mg kg-1
)处理20天后剥离肿瘤的il-6和cd31免疫荧光染色代表性图像(内容a和内容c)以及对il-6
+
、cd31
+
统计结果(内容b和内容d)(标尺：50μm)(n＝6)。可以看出，实验组和对照组7组中的荧光切片il-6和cd31的免疫荧光阳性面积较pbs组较少，明显抑制了肿瘤细胞内脂肪细胞il-6的分泌以及血管生成。
[0180]
实施例10
[0181]
多巴胺/3-氨基苯硼酸比例为1:1的接枝有多巴胺和3-氨基苯硼酸的透明质酸水凝胶负载盐酸阿霉素和阿司匹林于4t1乳腺癌原位肿瘤切除术后抑制肿瘤复发和血小板激活研究。
[0182]
1、实验材料和试剂
[0183]
透明质酸(ha)、盐酸多巴胺(da)、3-氨基苯硼酸(apba)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(edc)、n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)、盐酸阿霉素(dox)、阿司匹林(asa)、4t1乳腺癌细胞。
[0184]
2、实验步骤
[0185]
1)水凝胶制备同实施例1。
[0186]
2)称取10mg hdp，加入200μl含有60μg ml-1
dox和7.5mg ml-1
asa的pbs中混匀后静
置30min，即得到双载药水凝胶dox/asa@hdp。
[0187]
3)将6周龄雌性balb/c小鼠随机分为8组，每组6只，构建4t1乳腺癌手术切除模型。分别植入hdp、dox@hdp、asa@hdp、dox/asa@hdp，与此同时pbs、dox、asa组通过将药物溶液注入肿瘤切除腔内进行给药(dox给药量为0.6mg kg-1
，asa给药量为75mg kg-1
)。通过游标卡尺对肿瘤体积进行持续监测(肿瘤体积＝肿瘤长径
×
肿瘤短径
×
肿瘤短径
×
0.5)，并同时持续监测小鼠体重，对处理后的肿瘤组织进行cd41和cd62p免疫荧光染色。肿瘤组织经过剪碎、消化、过筛后制备单细胞悬液，经cd41、cd62p和cd63荧光抗体染色后检测肿瘤内血小板激活情况。pbs为对照组1、hdp为对照组2、dox为对照组3、asa为对照组4、dox@hdp为对照组5、asa@hdp为对照组6，dox/asa@hdp为实验组。
[0188]
3、实验结果
[0189]
如图17内容a、内容b、内容c、内容d、内容e、内容f、内容g、内容h、内容i和内容j所示，在肿瘤切除后pbs、hdp、dox、asa和asa@hdp组复发速度均较快，治疗后25天后平均肿瘤体积分别为1351mm3、1342mm3、957mm3、1306mm3和1150mm3；且各组之间没有显著性差异。dox@hdp组具有一定程度的肿瘤抑制，肿瘤体积小于pbs组，平均为372mm3和380mm3。而dox/asa@hdp组具有最小体积的肿瘤，平均仅为125mm3，并且肿瘤生长速度平缓。给药治疗后25天，通过剥离肿瘤的照片和重量也可知，dox/asa@hdp组具有最小的肿瘤体积和重量，且有一只小鼠肿瘤消除。各组单只小鼠肿瘤生长曲线趋势与上述结果相符，表明dox/asa@hdp可显著抑制4t1荷瘤小鼠术后肿瘤复发。
[0190]
于治疗后25天将4t1荷瘤小鼠肺部剥离，清洗后于bouin's固定液中固定染色，并对肺部结节进行统计。如图18内容a、内容b和内容c所示，经pbs、hdp、dox和asa治疗组的小鼠肺部结节数较多，平均在37～44个之间；dox@hdp和asa@hdp组肺结节数较少并且相当，平均在17～22个之间；而dox/asa@hdp具有最少的肺部转移结节，平均只有7个左右。小鼠肺部h&e染色能清晰的观察到肺部转移结节，并且数量和面积与上述趋势相符，表明dox/asa@hdp具有良好的抑制肿瘤转移的效果。为研究肿瘤术后dox/asa@hdp对肿瘤微环境中血小板的抑制效果，在上述给药处理25天后，剥离小鼠肿瘤，并将肿瘤研磨消化成单细胞悬液后采用流式细胞仪分析瘤内血小板激活情况。根据图19内容a、内容b、内容c、内容d和内容e可知，相比于其他对照组，asa@hdp和dox/asa@hdp组的瘤内血小板激活表型cd62p
+
和cd63
+
表达最低，具有显著抑制血小板激活的作用。由肿瘤免疫荧光切片可知，同样的，与其他组相比asa@hdp和dox/asa@hdp组肿瘤切片中cd41+(代表血小板)和cd62p+(代表血小板激活)细胞比例都最低，统计数据也具有相同趋势。综上所述，dox/asa@hdp可有效抑制肿瘤微环境中血小板的数量和激活状态。本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种用于术后载药的水凝胶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)将1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、n-羟基琥珀酰亚胺与透明质酸的水溶液混合搅拌，并保持溶液为弱酸性，对所述透明质酸的羧基进行活化，得到活化的前驱体溶液；(2)将步骤(1)所述活化的前驱体溶液与3-氨基苯硼酸和盐酸多巴胺混合，在惰性气体保护和弱酸性条件下反应，使所述3-氨基苯硼酸和盐酸多巴胺通过酰胺缩合反应接枝到所述透明质酸的骨架上，得到粗产物；(3)将步骤(2)所述粗产物在酸性超纯水中进行透析，透析得到的液体调节ph至中性后进行搅拌，利用空气中的氧气使多巴胺氧化聚合，然后冷冻干燥得到用于载药的水凝胶。2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、n-羟基琥珀酰亚胺与透明质酸的质量比为(0.4-0.8)：(0.1-0.5)：1，所述透明质酸的水溶液中透明质酸的质量百分数为0.5-1.5％；步骤(1)所述活化其活化时间为10-40分钟。3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述3-氨基苯硼酸和盐酸多巴胺的摩尔比为3:1-1:3，所述盐酸多巴胺与所述透明质酸的质量比为0.28～1.1:1。4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述惰性气体为氩气或氮气，所述反应其反应时间为12-36小时。5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)将所述粗产物转移到透析袋中，所述透析袋的截留分子量10000-14000da；所述搅拌的时间为3-8h；将搅拌产物真空冷冻干燥24-72小时，得到所述用于载药的水凝胶。6.如权利要求1至5任一项所述的制备方法得到的用于术后载药的水凝胶。7.一种术后载药水凝胶，其特征在于，其包括如权利要求6所述的水凝胶，还包括抗肿瘤药物和能够改善肿瘤微环境的药物，所述抗肿瘤药物包括阿霉素、紫杉醇和喜树碱中的一种或多种，所述能够改善肿瘤微环境的药物包括二甲双胍和/或阿司匹林。8.如权利要求7所述的术后载药水凝胶在制备术后治疗和/或抑制肿瘤的药物中的应用。9.如权利要求7所述的术后载药水凝胶在制备抑制术后肿瘤脂肪细胞新生和/或抑制术后肿瘤血管生成的药物中的应用。10.如权利要求7所述的术后载药水凝胶在制备抑制肿瘤术后血小板激活的药物中的应用。

技术总结
本发明属于生物医用材料技术领域，更具体地，涉及一种用于术后肿瘤治疗的载药水凝胶、其制备方法和应用。通过一锅法将两种反应底物多巴胺和3-氨基苯硼酸利用酰胺缩合反应接枝到透明质酸骨架上，制备得到水凝胶支架材料。柔韧的流变特性和优秀的生物粘附性可保证其稳定的粘附于切除伤口处而不移位，缓慢且pH响应性释放以及体内保证药物长时间滞留的特征使水凝胶能够对肿瘤微环境进行响应并维持肿瘤切除微环境长期处于足够的药物浓度。本发明制备的水凝胶可以同时负载抗肿瘤化疗药物和能够改善肿瘤微环境的药物，使得化疗药物在抑制肿瘤的同时，肿瘤微环境还得到显著改善，二者协同作用，促进对术后肿瘤复发和转移的干预抑制。抑制。抑制。


技术研发人员：甘璐 李建业 杨祥良 雍土莹
受保护的技术使用者：华中科技大学
技术研发日：2023.07.14
技术公布日：2023/9/26