齐墩果酸在制备促进肝脏再生药物中的应用

1.本发明涉及生物医药领域，尤其是涉及齐墩果酸在制备促进肝脏再生药物中的应用。


背景技术：

2.肝癌是一种发病率极高的恶性肿瘤，对健康威胁极大。为了彻底清除目标病灶确保剩余肝脏结构的完整性和功能性体积最大化，目前对于肝癌的治疗主要以肝切除和肝移植为主。但在小体积肝移植或扩大的肝切除术后，由于剩余肝体积不足，易导致肝功能障碍，常出现高胆红素血症伴胆汁淤积，临床上称为肝综合征(small-for-size syndrome，sfss)。此外，约20％的术后患者的肝脏缺乏再生能力、延缓再生能力或者再生能力弱，易引起多种不良的综合病症，如手术后急性肝衰竭、脓毒性感染、腹水、出血、肾衰竭或肝性脑病。目前为止仍缺治疗肝切除或肝移植后，促进肝再生的治疗手段。
3.因此，研究肝切除或肝移植后促进肝脏再生的药物迫在眉睫。


技术实现要素：

4.本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出齐墩果酸或其药学上可接受的盐、酯、水合物或糖苷衍生物在制备促进肝脏再生药物中的应用。
5.本发明还提供一种促进肝脏再生药物。
6.根据本发明的第一方面实施例齐墩果酸或其药学上可接受的盐、酯、水合物或糖苷衍生物在制备促进肝脏再生药物中的应用。
7.根据本发明实施例的应用，至少具有如下有益效果：
8.齐墩果酸为五环三萜类化合物，分子式c
30h38
o3，分子量为456.70。具有如式(i)所示结构式。
[0009][0010]
齐墩果酸能够显著提高70％肝切除小鼠模型的肝再生能力，具体表现为显著增加肝重比，肝切除后48小时brdu、ki67、pcna阳性细胞数显著增加，并在肝切后48小时、72小时pcna、cyclin d1的蛋白表达水平上调，促进了肝脏再生。
[0011]
本发明揭示了齐墩果酸在促进肝切除后肝再生中的作用及其机制，确定齐墩果酸在肝再生方面的作用，为临床肝移植和肝切除后的肝再生提供新见解和新方法。
[0012]
根据本发明的一些实施例，所述促进肝脏再生药物可以促进肝切除或肝移植后的肝脏再生。
[0013]
根据本发明的一些实施例，所述促进肝脏再生药物可以刺激肝切除或肝移植后的肝细胞增殖。
[0014]
根据本发明的一些实施例，所述肝细胞包括brdu阳性细胞、ki67阳性细胞、pcna阳性细胞中的至少一种。
[0015]
根据本发明的一些实施例，所述促进肝脏再生药物可以提高肝切除或肝移植后肝脏中的细胞周期相关蛋白表达水平。
[0016]
根据本发明的一些实施例，所述细胞周期相关蛋白包括pcna蛋白和cyclin d1蛋白中的至少一种。
[0017]
根据本发明的一些实施例，所述促进肝脏再生药物可以提高肝切除或肝移植后的肝重比恢复能力。
[0018]
根据本发明的一些实施例，所述肝切除或肝移植包括但不限于由肝大部分切除术、门静脉结扎的二次肝切除术、联合肝脏分割和门静脉结扎的二次肝切除术导致的肝切除或肝移植。
[0019]
根据本发明的第二方面实施例的一种促进肝脏再生药物，所述促进肝脏再生药物的活性成分包括齐墩果酸或其药学上可接受的盐、酯、水合物或糖苷衍生物。
[0020]
根据本发明的一些实施例，所述活性成分还包括其他促肝脏再生成分；所述其他促肝脏再生成分包括促肝细胞生长素、前列腺素e、甘草甜素、胰高血糖素中的至少一种。
[0021]
根据本发明的一些实施例，所述促进肝脏再生药物还包括药学上可接受的载体或赋形剂。
[0022]
根据本发明的一些实施例，所述促进肝脏再生药物的剂型为丸剂、颗粒剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、片剂、滴丸剂或口服液体制剂。
[0023]
根据本发明的一些实施例，所述促进肝脏再生药物具有a1)至a4)中的至少一种功能，a1)促进肝切除或肝移植后的肝脏再生；
[0024]
a2)刺激肝切除或肝移植后的肝细胞增殖；
[0025]
a3)提高肝切除或肝移植后肝脏中的细胞周期相关蛋白表达水平；
[0026]
a4)提高肝切除或肝移植后的肝重比恢复能力。
[0027]
根据本发明的一些实施例，以小鼠体重计，所述齐墩果酸或其药学上可接受的盐、酯、水合物或糖苷衍生物对小鼠的给药有效剂量为80mg/kg/d～120mg/kg/d。具体可以为100mg/kg/d。
[0028]
在本发明中，药物治疗的对象为哺乳动物类，包括人、小鼠等。本领域技术人员可以根据人与实验动物的等剂量换算关系，利用动物的剂量推测出人的单位体重剂量。按照单位体重剂量换算，小鼠的等效剂量约为人的9倍。
[0029]
根据本发明的一些实施例，所述促进肝脏再生药物的给药方式包括但不限于灌胃。
[0030]
本发明的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变
得显而易见，或者通过实施本发明而了解。
附图说明
[0031]
图1为不同处理组的肝切除小鼠模型的肝重(a)及肝重比(b)的变化情况；
[0032]
图2为不同处理组的肝切除小鼠模型的肝脏照片；
[0033]
图3是齐墩果酸对肝切除小鼠模型肝脏中的brdu阳性细胞的影响；其中，a为免疫组化染色代表图，b为brdu阳性细胞数的统计结果；
[0034]
图4是齐墩果酸对肝切除小鼠模型肝脏中的ki67阳性细胞的影响；其中，a为免疫组化染色代表图，b为ki67阳性细胞数的统计结果；
[0035]
图5是齐墩果酸对肝切除小鼠模型肝脏中的pcna阳性细胞的影响；其中，a为免疫组化染色代表图，b为pcna阳性细胞数的统计结果；
[0036]
图6是不同处理组的肝切除小鼠模型肝脏中的pcna、cyclin d1蛋白表达水平的变化情况。
具体实施方式
[0037]
以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。
[0038]
实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
[0039]
5-溴脱氧尿嘧啶核苷(brdu)是一种胸腺嘧啶核苷类似物，能够在细胞增殖时期代替胸腺嘧啶(t)渗入正在复制的dna分子，通过检测brdu标记能准确地反映细胞的增殖情况。
[0040]
ki67是一种增殖细胞的相关抗原，其功能与有丝分裂密切相关，可用于反映细胞增殖情况。
[0041]
增殖细胞核抗原(pcna)在dna复制、细胞增殖和细胞周期调控中发挥重要作用，可用于反映细胞增殖情况。
[0042]
g1/s-特异性周期蛋白-d1(cyclin d1，ccnd1)是促进肝细胞通过细胞周期增殖阶段(g1～s期)的关键因子。其与细胞周期蛋白依赖性激酶(cdk4)结合形成复合物进而使rb磷酸化，诱导转录因子e2f活化并释放，促使肝细胞越过g1限制点。
[0043]
本发明的实施例中，齐墩果酸(纯度为97％)，购自上海阿拉丁生化科技有限公司；
[0044]
anti-ki67 antibody购自abcam公司；
[0045]
cyclin d1、pcna、β-actin一抗和兔二抗购自cell signaling technology；
[0046]
brdu一抗购自santa cruz biotechnology。
[0047]
齐墩果酸对肝脏再生的促进作用
[0048]
本实施例对c57bl/6j小鼠(雄性，8～9周龄，由广东省医学实验动物中心提供，饲养于中山大学实验动物中心)进行70％肝切除术后，给药齐墩果酸，以评估齐墩果酸对肝脏再生的促进作用。具体实验方法如下所示。
[0049]
(1)通过吸入异氟烷麻醉小鼠约10～30秒，并将其固定在手术台上。腹部用75％乙醇消毒后，切开腹膜约1～2cm，然后用缝线结扎左前叶并切除。随后，用缝线结扎右前叶和左后叶，并在胆囊和肝上腔静脉之间切除。手术后，将腹膜和皮肤一起取出，并使用7.5
×
1.75mm michel缝线夹闭合切口，将小鼠放在加热垫上直到清醒，然后转移到笼子中。70％肝切除术在5～7min内完成。得到肝切除小鼠模型。
[0050]
(2)将肝切除小鼠模型随机分为3组。一组为对照组(n＝6)，用于肝切除后0天(即术后第0天，该时间点小鼠未给药)的数据检测；一组为肝切+齐墩果酸组(phx+oa)，n＝30，术后苏醒后，按100mg/kg/d给药齐墩果酸灌胃液；一组为肝切组(phx)，n＝30，术后苏醒后给药等体积0.5％羧甲基纤维素钠溶液。
[0051]
其中，实验中所用齐墩果酸灌胃液均于实验前新鲜配制。齐墩果酸灌胃液的配制方法具体如下：
[0052]
精密称取适量齐墩果酸粉末置于干净的50ml离心管中，加入适量0.5％羧甲基纤维素钠溶液，超声10min，制得齐墩果酸浓度为5mg/ml的齐墩果酸灌胃溶液。
[0053]
(3)样品收集和指标检测。分别于肝切除后0天、1天、2天、3天、5天、7天称量小鼠体重；并于每个时间点随机每组处死6只小鼠，在处死小鼠前2h，给小鼠注射brdu 100mg/kg。收集肝脏，拍摄照片，并称取肝重，计算肝重比，以衡量肝脏恢复情况；并在肝中叶取一小块肝组织固定于10％中性甲醛24h后，通过免疫组化方法(包括脱蜡，抗原暴露，过氧化物酶淬灭，血清封闭后一抗4℃过夜，经二抗孵育1h后dab染色，盐酸分化，氨水反蓝，脱水封片挥干后镜下拍照)检测肝组织增殖标志物brdu、ki67、pcna的水平。提取肝脏的总蛋白，采用western blot法检测pcna、cyclin d1蛋白的表达水平。其余肝脏组织分装，于-80℃冰箱冷冻保存。
[0054]
其中，肝重比(％)＝再生肝重/术后体重
×
100％。
[0055]
在肝切除后2～7天，齐墩果酸可显著加快肝切除小鼠模型的肝重比的恢复；且肝脏重量恢复速度快。如图1所示。并且，经肝切除后，肝切+齐墩果酸组小鼠的肝脏体积相较于肝切组显著增加。如图2所示。这表明齐墩果酸能够有效促进肝脏再生，提高肝重比恢复能力。
[0056]
图1中，与同一时间点的肝切组样本相比，*p《0.05、**p《0.01、***p《0.001。
[0057]
在肝切除后2～7天，齐墩果酸可显著增加brdu、ki67、pcna阳性细胞数，且肝切除后2天达到峰值随后逐渐减少。如图3至图5所示。这表明齐墩果酸能够有效促进肝细胞增殖。
[0058]
图3至图5中，与肝切0天(即术后第0天)相比，*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001；与同一时间点的肝切组样本相比，#p《0.05，##p《0.01，##p《0.001。
[0059]
肝切除后，pcna、cyclin d1蛋白表达水平呈动态变化。在术后第2天时达到峰值，后逐渐下降。肝切+齐墩果酸组小鼠的pcna和cyclin d1的蛋白表达水平在2天和3天高于肝切组。如图6所示。这表明齐墩果酸可通过影响细胞周期相关蛋白加速肝切除后肝脏再生进程。
[0060]
上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。

技术特征：
1.齐墩果酸或其药学上可接受的盐、酯、水合物或糖苷衍生物在制备促进肝脏再生药物中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述促进肝脏再生药物可以促进肝切除或肝移植后的肝脏再生。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述促进肝脏再生药物可以刺激肝切除或肝移植后的肝细胞增殖。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述肝细胞包括brdu阳性细胞、ki67阳性细胞、pcna阳性细胞中的至少一种。5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述促进肝脏再生药物可以提高肝切除或肝移植后肝脏中的细胞周期相关蛋白表达水平。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述细胞周期相关蛋白包括pcna蛋白和cyclin d1蛋白中的至少一种。7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述促进肝脏再生药物可以提高肝切除或肝移植后的肝重比恢复能力。8.一种促进肝脏再生药物，其特征在于，所述促进肝脏再生药物的活性成分包括齐墩果酸或其药学上可接受的盐、酯、水合物或糖苷衍生物。9.根据权利要求8所述的促进肝脏再生药物，其特征在于，所述促进肝脏再生药物还包括药学上可接受的载体或赋形剂。10.根据权利要求8所述的促进肝脏再生药物，其特征在于，所述活性成分还包括其他促肝脏再生成分；所述其他促肝脏再生成分包括促肝细胞生长素、前列腺素e、甘草甜素、胰高血糖素中的至少一种。

技术总结
本发明公开了齐墩果酸在制备促进肝脏再生药物中的应用，涉及生物医药领域。齐墩果酸或其药学上可接受的盐、酯、水合物或糖苷衍生物在制备促进肝脏再生药物中的应用。齐墩果酸能够显著增加肝重比，显著增加肝切除后48小时BrdU、KI67、PCNA阳性细胞数，上调PCNA、Cyclin D1的蛋白表达水平，促进肝脏再生。促进肝脏再生。


技术研发人员：宋少飞 李垣 赵婷婷 曹仁杰 姜伊鸣 黄民
受保护的技术使用者：中山大学
技术研发日：2023.07.19
技术公布日：2023/9/26