一种由紫丁香苷和木香烃内酯组成的组合物在制备抗肝损伤的药物中的应用的制作方法

1.本发明涉及抗肝损伤组合制剂技术领域，具体涉及一种由紫丁香苷和木香烃内酯组成的组合物在制备抗肝损伤的药物中的应用。


背景技术：

2.肝脏是机体功能极其复杂且重要的器官，在许多生理过程中起着关键性的作用，包括在体内起着合成、排毒、储存肝糖、分泌蛋白、排泄、利用各种养分循环等作用。肝损伤是影响人类健康最常见的临床疾病之一，由于肝脏有着丰富的血供同时也是体内物质代谢最重要的场所，故而较容易受到体内外的各类致病因子的攻击并引发肝损伤等肝脏疾病的发生。引起肝损伤的原因多种多样，按照来源分大体可以分为外源性(化学物质，如ccl4等)或内源性(人体代谢产生的有毒有害物质，如lps等)的原因导致的肝细胞受损(肝细胞坏死和凋亡)、肝功异常、炎症产生、肝脏结构发生改变如纤维化等。肝损伤的临床表现为：轻者ast、alt持续升高，重者可导致肝脏衰竭、凝血功能障碍、肝性脑病等，进而影响其它脏器功能及身体机能的正常发挥，甚至导致死亡。肝损伤按照病程时间长短可分为急性肝损伤和慢性肝损伤，在我国的肝损伤人数约有1.3亿人左右，其导致死亡的人数将近50万人，己成为了全球导致死亡原因的第5位。
3.目前，西药治疗肝损伤的主要作用机制包括调节肝功指标、抗病毒、抗氧化、抗炎症、阻止肝细胞凋亡等，但这些药物都存在一定的毒副作用或不足。例如还原型谷胱甘肽可能引起恶心、呕吐和皮疹；拉米夫定只能暂时控制病毒，停药后反弹率高，而且长期服用易产生耐药性；多烯磷脂酰胆碱可能引发腹痛和腹泻；硫普罗宁可能引发皮疹、搔痒、恶心、呕吐、发热甚至过敏性休克；联苯双酯可能引起口干、轻度恶心和皮疹，在停药后易反弹；干扰素价格高，免疫反应强，毒副作用较大。目前临床上使用的药物大多毒副作用明显，易产生耐药性，因此需要寻找毒副作用小、安全有效、价格低的具有肝损伤保护作用的药物。


技术实现要素：

4.本发明意在提供一种由紫丁香苷和木香烃内酯组成的组合物在制备抗肝损伤的药物中的应用，以解决目前临床上缺少毒副作用小、安全有效、价格低的具有肝损伤保护作用的药物的技术问题。
5.为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
6.一种由紫丁香苷和木香烃内酯组成的组合物在制备抗肝损伤的药物中的应用。
7.上述技术方案的原理在于：
8.肝损伤是由多种有害因素和物质引起的，如免疫、病毒、酒精、药物、毒物和缺氧等疾病以肝细胞为靶细胞，对其直接造成损害，或产生一系列介质，诱发肝细胞炎症、纤维化、凋亡、坏死等病理变化，导致肝功能不全和部分丧失，最终导致各种肝病。据报道，肝损伤发生后的修复、再生这个过程主要是由肝细胞、kupffer细胞等多种细胞协同作用来完成的。
而肝脏的修复过程会涉及多种基因和信号通路，因此对这些相关基因和信号通路的研究非常重要。在对关键节点基因进行了文献调研后，发现凋亡、周期、炎症这几个主要的信号通路可能在肝细胞损伤的发生及发展进程中发挥了极其重要的作用，因此试验对通路上的关键蛋白进行研究。
9.紫丁香苷(syr)和木香烃内酯(cos)是从川木香中提取到的单体化合物，syr+cos对于lps诱导的l-02细胞肝损伤的保护作用及其潜在机制尚不清楚，研究也不深入。因此，本研究旨在探讨syr+cos对lps诱导的l-02肝细胞损伤的保护作用，并阐明其作用机制。发明人采用lps诱导l-02肝细胞作为体外肝细胞损伤模型，研究syr对l-02细胞损伤的保护作用机制。本实验采用mtt法检测syr+cos对l-02细胞的生长抑制率，试验结果显示syr+cos为40μm的浓度时对l-02细胞有显著的保护作用。
10.为了进一步探讨syr+cos保护l-02肝细胞的分子机制，通过多种方法检测了syr+cos对l-02细胞增殖、细胞周期和细胞凋亡的影响。据文献报道，肝脏的修复过程较为复杂，主要包括引发阶段的由细胞因子等因素导致的静止期(g0期)肝细胞获得进入细胞周期的能力；增殖阶段的细胞经过持续分裂增殖(历经g1、s、g2和m期)最终直到恢复肝功能。另有文献报道，在肝损伤发生的很短时间内，约有95％的g0期肝细胞将会通过增殖来同步进入细胞周期的过程，从而增加肝细胞的整体数量。基于以上的报道，试验中通过brdu荧光染色的手段来反映细胞增殖情况。结果表明，与lps模型组相比，syr+cos组的brdu阳性细胞数增加了10％，证明syr+cos给药能够使得l-02细胞增殖。另外通过流式pi单染法检测给药后的l-02细胞的周期分布情况，结果表明在syr给药以后，和lps模型组相比，40μm syr组的l-02细胞呈现增长的趋势，说明syr+cos可降低lps诱导的l-02细胞在g2/m期的阻滞作用，达到肝细胞保护作用。有研究表明，肝损伤发生后，药物能够促进肝实质细胞增殖再生最终会阻止细胞坏死或凋亡的发生、同时代替坏死或凋亡的肝细胞，逐渐恢复肝脏功能。本试验中，通过annexinv/pi实验结果表明，syr+cos作用l-02细胞48h后能够显著抑制l-02细胞凋亡的发生，从而到达保护l-02细胞的作用。
11.细胞凋亡是指机体为维持细胞内环境稳态，在基因的宏观调控下自主的程序性死亡。研究表明，暴发性肝衰竭(fhf)、肝损伤(hi)、病毒性肝炎(vh)、肝纤维化(hf)、肝硬化(hc)、肝癌(hc)多种类型的肝病的发病机制皆与细胞凋亡密切相关。caspase-3是caspase家族中的最重要的凋亡执行者之一，是细胞凋亡过程中的主要效应因子，其活化标志着凋亡进入不可逆阶段。caspase-7是执行细胞凋亡的效应器，激活的caspase-3和caspase-7能分裂多种结构蛋白和调控蛋白，而这些蛋白对细胞的生存和维持至关重要，能介导和放大凋亡过程中的级联反应。据研究报道，线粒体凋亡途径中，当其接收到信号被激活后会导致cyto-c进入细胞质，与apaf-1结合形成凋亡体后诱导caspase-9活化，最后caspase-9又将凋亡信息传递给凋亡执行蛋白caspase-3从而引发凋亡反应，caspase-3,7也可以作为lps受体，在调节免疫稳态中发挥重要作用。在本试验中，凋亡相关蛋白的western blot结果表明：syr+cos能够通过抑制促凋亡蛋白(caspase-3,7,9)的表达，调节凋亡通路发挥作用，从而保护由lps诱导的l-02肝细胞损伤。
12.肝细胞增殖阶段涉及多种细胞周期蛋白(cyclin)及细胞周期蛋白依赖激酶(cdks)。cdks是一组丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，其通过对丝氨酸/苏氨酸蛋白的化学作用驱动细胞周期和cyclin b协同作用，是细胞周期调控中的重要因子。当细胞遭受严重的损伤
dna修复变得不可能完成时，凋亡相关程序被启动；而当细胞遭受轻微损伤dna能够进行修复时，p53被激活诱导细胞周期停滞。细胞进入分裂，cyclin b可与cdk1结合，受磷酸化、去磷酸化调节，促进细胞的g2/m期转变；并能通过磷酸化调节多种蛋白的活性与分布。在本试验中，周期相关蛋白的western blot结果表明：syr+cos能够通过增加cyclin b和cdk1蛋白的表达量来保护由lps诱导的l-02肝细胞损伤。
13.tnf-α是具有多种生物学效应的细胞因子，试验表明其可诱导肝细胞凋亡，其受体在肝毒性药物、脓毒血症等引起的肝损伤方面起着重要的作用。有研究证明tnf-α在敲除nf-κb基因的小鼠中表达量显著降低。在静息状态下，nf-κb与iκb以三聚体的形式结合于动物的细胞质中，nf-κb通路此时并未开启和激活。然而，在受到外界刺激或者上游的分子信号时，iκb就会在ikk复合体的诱导下发生磷酸化现象并降解，nf-κb则在激活后由细胞质移位至细胞核，使得炎症因子(如il-6、tnf-α等)释放。maeda等发现nf-κb在免疫细胞的活化也能促进肝再生及通过tnf-α和其他细胞因子的合成促进肝细胞增殖。western blot结果显示：在nf-κb通路上，syr+cos可能通过下调nf-κb、tnf-α蛋白表达水平和来抑制由lps诱导的l-02肝细胞损伤。
14.进一步，紫丁香苷和木香烃内酯的用量比为1：1。
15.进一步，抗肝损伤的药物用于提升肝细胞的存活率。
16.进一步，抗肝损伤的药物用于提升肝细胞的增殖能力。
17.进一步，抗肝损伤的药物用于缓解肝细胞的细胞周期的g2/m期阻滞。
18.进一步，抗肝损伤的药物用于抑制肝细胞的凋亡。
19.进一步，抗肝损伤的药物用于抑制肝细胞的炎症反应。
20.进一步，所述肝细胞为lps处理导致的细胞受损的肝细胞。
21.进一步，紫丁香苷和木香烃内酯体外处理lps处理导致的细胞受损的肝细胞的浓度比为1：1。
22.进一步，抗肝损伤的药物为具有抗氧化能力和保肝活性的药物。
23.本技术方案的原理以及有益效果在于：
24.川木香为传统中药，具有治疗胃肠道疾病，如脘腹胀痛、呕吐、肠鸣泄泻、里急后重、两肋不舒的功效，现代药理学研究表明川木香提取物及其中的单体化合物显示出抗肿瘤、抗炎、解痉、治疗胃溃疡、肝胆疼痛、神经保护等多种生理活性。紫丁香苷和木香烃内酯是从川木香中提取的主要成分。紫丁香苷和木香烃内酯在川木香中的含量差异较大，例如文献“超高效液相色谱法同时测定川木香中紫丁香苷、木香烃内酯和去氢木香内酯含量，天津中医药”中报道了：紫丁香苷在川木香中的含量为0.2-2mg/g，木香烃内酯在川木香中的含量为5-25mg/g。并且，紫丁香苷和木香烃内酯作为性质相差较大的两种物质，需要采用不同的方式从川木香中提取和纯化出来。即使从川木香中提取出的含有紫丁香苷和木香烃内酯的混合提取物，其中，紫丁香苷和木香烃内酯的含量比例也难以确定和维持。由于两种物质在川木香中的含量差异，从川木香中提取获得的含有紫丁香苷和木香烃内酯的混合提取物中，两种物质的量的比例几乎难以达到1：1，难以产生协同增效的效应。目前尚未见关于紫丁香苷和木香烃内酯以特定的比例联合用药的文献报道。本技术方案特别研究了两种纯化合物在不同用量比例下的作用效果，发现紫丁香苷和木香烃内酯的浓度比为1：1时，可产生非常显著的协同增效作用，提升肝损伤细胞的存活率。并且，如果采用其他比例，则紫丁
香苷和木香烃内酯更多地呈现出的是两种药物的剂量-效果叠加效应，未见明显的协同增效。
25.通过研究发现紫丁香苷联合木香烃内酯对lps诱导的l-02细胞肝损伤有显著的保护作用，与阳性药效果相当，表明该化合物具有较好的开发潜力。本技术方案首次在细胞层面证明了紫丁香苷联合木香烃内酯对l-02肝细胞的保护作用，并阐明了机制。紫丁香苷联合木香烃内酯对l-02细胞的保护作用是通过促进l-02细胞增殖、抑制l-02细胞凋亡的发生、并降低lps诱导的l-02细胞在g2/m期的阻滞作用达到的。紫丁香苷联合木香烃内酯可通过下调促凋亡蛋白caspase-3,7,9、炎症通路相关蛋白nf-κb和tnf-α的表达、上调周期相关蛋白cyclin b和cdk1的表达、保护由lps诱导的l-02肝细胞损伤。
26.综上所述，肝损伤严重危害人类健康，如何能切实有效的进行防治已成为医学界所面临的严峻挑战之一。治疗肝损伤的西药均具有一定的毒副作用或不足,而安全有效、毒副作用小的药物用于治疗肝损伤是一种行之有效的方法。川木香为我国常用中药材，主要分布于四川西部、西藏东部、重庆等地。《中华人民共和国药典》2020版一部记载川木香具有治疗脘腹胀痛、呕吐、肠鸣泄泻、里急后重、两肋不舒、肝胆疼痛的功效。川木香中提取的单体化合物紫丁香苷及木香烃内酯联合使用的作用效果研究不够全面，如何作用于疾病并未完全阐明。基于此，通过本研究能够全面明确紫丁香苷联合木香烃内酯防治肝损伤的作用，以期寻找到毒副作用小、安全有效、价格低的具有肝损伤保护作用的药物。
附图说明
27.图1为实施例1的紫丁香苷联合木香烃内酯对l-02细胞存活率的影响(mean
±
sd，n＝5；**p＜0.01vs正常对照组；##p＜0.01vs lps模型组)。
28.图2为实施例2的紫丁香苷联合木香烃内酯处理48h对l-02细胞存活率的影响(mean
±
sd，n＝5；*p＜0.05,**p＜0.01vs lps模型组；#p＜0.05,##p＜0.01vs对照组)。
29.图3为实施例3的brdu免疫荧光检测紫丁香苷联合木香烃内酯对l-02细胞增殖的影响(100
×
；mean
±
sd，n＝5；**p＜0.01vs正常对照组,##p＜0.01vs lps模型组)。
30.图4为实施例4的紫丁香苷联合木香烃内酯对l-02细胞周期的影响(mean
±
sd，n＝5；**p＜0.01vs正常对照组；#p＜0.05vs lps模型组)。
31.图5为实施例5的紫丁香苷联合木香烃内酯给药后的细胞流式凋亡检测结果(mean
±
sd，n＝5；**p＜0.01vs正常对照组,##p＜0.01vs lps模型组)。
32.图6为实施例6的紫丁香苷联合木香烃内酯对细胞周期相关蛋白的影响(mean
±
sd，n＝5；**p＜0.01vs正常对照组,##p＜0.01vs lps模型组)。
33.图7为实施例6的紫丁香苷联合木香烃内酯对细胞凋亡相关蛋白的影响(mean
±
sd，n＝5；**p＜0.01vs正常对照组,#p＜0.05，##p＜0.01vs lps模型组)。
34.图8为实施例6的紫丁香苷联合木香烃内酯对炎症通路相关蛋白的影响(mean
±
sd，n＝5；**p＜0.01vs正常对照组,##p＜0.01vs lps模型组)。
35.图9为实施例7的紫丁香苷和核心靶蛋白分子对接结果。
36.图10为实施例7的木香烃内酯和核心靶蛋白分子对接结果。
37.图11为实施例8的紫丁香苷联合木香烃内酯对肝功能和氧化应激相关指标的影响(mean
±
sd，n＝5；**p＜0.01vs正常对照组,##p＜0.01vs lps模型组；a：alt，ast；b：ldh；c：
mda；d：ros；e：sod；f：cat)。
具体实施方式
38.下面结合实施例对本发明做进一步详细的说明，但本发明的实施方式不限于此。若未特别指明，下述实施例以及实验例所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，且所用的材料、试剂等，均可从商业途径得到。
39.实施例1：紫丁香苷联合木香烃内酯对l-02细胞存活率的影响
40.(一)实验方法
41.(1)l-02细胞培养
42.(1.1)细胞的复苏和培养
43.将l-02细胞从液氮罐中取出，快速放入37℃的水浴锅中解冻，迅速并持续摇晃，直到将所有冻存的细胞融化为液体。转移至生物安全柜内，立即加入等体积的含有10％ fbs和1％青霉素/链霉素双抗的rpmi-1640培养基混合均匀(需37℃水浴锅预温)，1000rmp离心10min，弃上清，再加入少量培养基，重复以上离心过程1次。在细胞沉淀内加入rpmi-1640培养基，将适量细胞分别转入培养瓶中(每个培养瓶中的培养液为5ml)，调整细胞个数为1
×
106个/ml(使用细胞计数板计数)，置于co2细胞培养箱中常规培养，24h后换液。
44.(1.2)细胞的传代
45.待细胞增殖密度达到80％-90％后，吸出培养液，加入适量的pbs冲洗，然后吸出pbs，再加入0.25％的胰蛋白酶消化适当的时间，吸出胰蛋白酶后加入2ml rpmi-1640培养液终止消化，吹打均匀，按1:3比例传代备用。
46.(2)常用溶液配置
47.pbs磷酸缓冲液的配置：将pbs粉末(其中0.24g kh2po4，8g nacl，0.2g kcl，1.44g nahpo4)置于烧杯中，先加入700ml超纯水溶解，然后用磁力搅拌器搅拌至完全溶解于超纯水后定容至1l，室温状态下调节ph值至7.4，摇匀后120℃高压灭菌锅中灭菌40min，置于4℃冰箱备用。
48.0.3％ triton-100溶液的配置：72.8ml的pbs(ph＝7.4)中加入28.2ml triton-100，充分溶解混匀，加入超纯水补至1l，37℃水浴充分溶解后，配成浓度为30％ triton-100溶液，置于4℃冰箱保存备用，使用前稀释至0.3％即可。
49.l-02肝细胞(培养基)的配置：将10％胎牛血清和1％的青霉素/链霉素双抗加入rpmi-1640培养液，混匀，置于4℃冰箱保存备用。
50.细胞冻存液的配置：dmso和fbs分别按1:9的比例进行配置，充分混匀后放入4℃冰箱备用。
51.4％多聚甲醛溶液的配制：40g多聚甲醛溶于800ml pbs，60-65℃下加热，滴加naoh 2ml至澄清，60℃恒温水浴过夜，使其充分溶解，调节ph值至7.0，冷却后加pbs至1000ml，4℃冰箱保存备用(鉴于多聚甲醛毒性较强，配置需在通风橱或生物安全柜内操作，戴口罩避免吸入呼吸道)。
52.2mol/l的hcl溶液的配制：在100ml的超纯水中缓慢加入20ml hcl液体，充分混匀后置于4℃冰箱保存备用。
53.0.9％ nacl溶液的配制：称取9g分析纯nacl，放入玻璃烧杯中，加1000ml超纯水稀
syr+5μm cos和20μm syr+20μm cos)，sily给药组加入40μm的sily(水飞蓟素，silymarin)，于co2细胞培养箱中继续培养24h。在接下来的7d中，在指定的时间点加入mtt试剂孵育2h(相同时间点)，酶标仪490nm检测吸光度(od)值，汇总后得到l-02肝细胞的每天相对存活率。
71.(二)实验结果
72.为了评价紫丁香苷联合木香烃内酯(syr+cos)对l-02细胞存活率的影响，利用mtt法检测了syr+cos药物处理lps诱导l-02肝细胞后的相对存活率(不同浓度与不同处理时间)。如图1所示分别为10μm、40μm的syr+cos在7d内对l-02细胞存活率的影响。结果表明：与对照组相比，lps模型组的l-02细胞存活率显著降低，证明造模成功。与模型组lps相比，syr+cos药物处理组均能使得l-02细胞存活率显著增加，且syr+cos浓度40μm比10μm效果更好。
73.在对照组中，随着天数的增加，细胞存活率稳定在100％左右；而在lps模型组中，l-02细胞的存活率受到了明显的抑制。在10μm syr+cos组和40μm syr+cos组中，l-02细胞的存活率相对于lps模型组有所提升，且40μm syr+cos组对细胞存活率的提升作用更为明显。因此可以得知，syr+cos在体外显著提升了l-02细胞的存活率。
74.实施例2：紫丁香苷和木香烃内酯的协同增效作用的研究
75.本方案使用了紫丁香苷联合木香烃内酯的方式缓解肝细胞损伤，紫丁香苷(syringin，syr)的结构式如式(1)所示，木香烃内酯(costunolide，cos)的结构式如式(2)所示。
[0076][0077]
对数生长期的l-02肝细胞加入96孔板中，用0.25％胰蛋白酶消化，用加入10％胎牛血清和1％的青霉素和链霉素双抗的rpmi 1640培养基悬浮，在光学显微镜下利用细胞计数板计数(细胞密度调整为1
×
106个/ml)。使用96孔板培养l-02细胞(每孔加入约100μl的细胞悬液)，在5％ co2培养箱中培养24h。除正常对照组(control)加入40μm的dmso外，syr+cos给药组、syr给药组、cos给药组和lps模型组均加入lps(终浓度20μm)孵育4h，之后用pbs清洗3次。syr+cos给药组、syr给药组、cos给药组分别加入终浓度40+40μm的syr+cos、终浓
度40μm的syr、终浓度40μm的cos，于co2细胞培养箱中继续培养48h。然后加入mtt试剂孵育2h，酶标仪490nm检测吸光度(od)值，汇总后得到不同药物处理48h后的l-02肝细胞的相对存活率。以对照组的平均存活率为100％，lps组的平均存活率为20.42％，lps+syr+cos组的平均存活率为82.37％，lps+cos组的平均存活率为30.41％，lps+syr组的平均存活率为38.05％，统计柱状图参见图2。lps+syr+cos组的平均存活率大于lps+cos组和lps+syr组的平均存活率之和，这说明syr和cos两种药物按照1：1的浓度比联合使用，带来的促进存活率提升的效果，远远优于两种药物单独使用所带来的存活率提升的效果之和。因此，syr和cos两种药物按照1：1的浓度比使用，产生了协同增效的效应，呈现出1+1＞2现象。
[0078]
发明人也进行了探索了syr和cos的用量关系，实验过程参照前述，只是将syr和cos两种药物的比例进行了调整。当syr和cos的浓度比为1：2时，lps+syr+cos组(cos：53.3μm，syr：26.7μm)的细胞平均存活率为69.25％。当syr和cos的浓度比为2：1时，lps+syr+cos组(cos：26.7m，syr：53.3μm)的细胞平均存活率为71.37％。在syr和cos的浓度比为1：2或者2：1时，虽然两种药物联合使用的效果优于单独使用，但是带来这种效果优势的原因主要是药物浓度的累积效应，并未呈现出两种药物浓度比1：1使用时的1+1＞2现象。仅仅由于syr和cos的浓度比的变化(从1：1变化为1：2和2：1)，细胞平均存活率数值(相对于同样总剂量的syr和cos为1：1的情况)就下降了接近10％之多，这是发明之前所未能预想到的。这说明syr和cos的联合使用且发挥理想的协同作用的关键点在于二者的浓度比例为1：1。
[0079]
实施例3：紫丁香苷联合木香烃内酯对l-02细胞增殖的影响
[0080]
(一)实验方法
[0081]
(1)实验原理：
[0082]
brdu为一种胸腺嘧啶核苷的相似物(类似物)，它常被用来标记活细胞中新合成的dna，并选择性地整合到新合成的dna(细胞周期的s期)而不是胸腺嘧啶。并且当dna复制到子细胞中时，这种融合也能够稳定的存在。因此brdu特异性抗体可以通过检测brdu的结合情况来判断细胞的增殖能力。
[0083]
(2)实验步骤：
[0084]
(a)添加brdu：24孔板上各孔分别加入对数生长期的l-02细胞(密度80％左右)，在co2培养箱常规培养24h。然后每孔加入40μm的药物syr+cos和brdu溶液(空白对照组加入浓度为0.2％的dmso)，置于摇床上混合均匀(终浓度为1μg/ml)，置于co2细胞培养箱中继续孵育1h。
[0085]
(b)移去原细胞培养基：孵育完成后，用pbs洗涤细胞(洗涤3次，平摇，每次5min)，除去原细胞培养基，每孔加入200μl的4％多聚甲醛溶液(用于固定)，室温下固定30min。
[0086]
(c)去除4％多聚甲醛溶液(固定液)：置于摇床上用pbs洗涤3次，每次5min，平摇。每孔加入200μl的浓度为2mol/l的hcl溶液，细胞培养箱中处理10min。除去hcl溶液，用1
×
pbs洗涤3次，每次10min，平摇。
[0087]
(d)封闭：每孔均用0.3％200μl的triton-100溶液洗涤3次，每次10min；除去triton-100溶液，用pbs洗涤3次，每次5min，平摇。每孔加入500μl 10％的山羊血清，37℃下封闭1h。
[0088]
(e)加一抗：按照1:200浓度将brdu一抗稀释后，每孔添加稀释的brdu一抗500μl，4℃孵育过夜；次日取出24孔板在室温下复温45min；用1
×
tbst溶液洗涤3次，每次10min用来
除去brdu。
[0089]
(f)加二抗：按照1:500浓度将brdu二抗稀释后，每孔添加稀释的brdu二抗500μl，室温下避光孵育2h；用1
×
tbst溶液洗涤3次，每次10min。
[0090]
(g)加染色液dapi：按照每孔50μl的浓度加入dapi染色液。室温下避光孵育20min；pbs洗涤细胞3次，每次10min。
[0091]
(h)制片、拍照、计数：在玻片上滴加抗荧光淬灭封片液，封片于载玻片上。随机选择6个40倍及20倍的视野，进行荧光信号观察与拍照，并计算细胞总数及brdu阳性细胞数(计算brdu阳性率)。
[0092]
(二)实验结果
[0093]
brdu可以在细胞增殖过程中通过结合复制的dna分子来取代胸腺嘧啶，从而准确反映细胞增殖。因此，采用brdu标记法检测了syr+cos对l-02细胞增殖的影响。按照l-02细胞的细胞核能被dapi染成蓝色，而增殖分裂的l-02细胞能被brdu染成绿色的染色原理。通过比较brdu阳性细胞(随机视野下)的数量和比例，就能够间接的知晓细胞的增殖情况。与对照组相比，40μm syr+cos作用于l-02细胞48h后，视野中brdu阳性细胞数与其差异不明显。与lps模型组相比，40μm syr+cos组brdu阳性细胞数增加了10％(图3)。数据证明syr+cos给药能够促进l-02细胞增殖。
[0094]
实施例4：紫丁香苷联合木香烃内酯对l-02细胞周期的影响
[0095]
(一)实验方法
[0096]
流式细胞周期检测
[0097]
(1)流式细胞仪检测1份样品中的细胞数≥1
×
105。
[0098]
(2)细胞的培养及给药：将1
×
105个l-02细胞接种到6孔板中，细胞培养箱过夜培养使细胞密度达到80％-90％左右。空白对照组加入浓度为0.2％的dmso，药物组加入40μm的syr+cos，无血清培养基替换，培养48h。
[0099]
(3)收集细胞：加入胰蛋白酶(事先温浴)用于消化l-02细胞，室温下1000rpm离心沉淀细胞5min，收集细胞沉淀，用完全的细胞培养基重悬细胞沉淀，制成单细胞悬液。然后将细胞悬浮液转移到5ml的离心管中。小心去除上清液，加入1ml冰浴预冷pbs缓冲液，悬浮细胞，将细胞悬浮液转移到1.5ml离心管中，1000rpm离心5min，收集细胞沉淀，继续重复pbs洗涤2-3次，直到完全去除胰蛋白酶及培养基成分。
[0100]
(4)固定细胞：最后一次洗涤后，先在细胞沉淀中加入250μl的预冷的pbs，然后在轻轻吹打悬浮细胞后缓慢加入750μl的预冷的75％的乙醇，吹打混匀，在4℃下固定过夜。
[0101]
(5)碘化丙啶(pi)染色：1000rpm离心细胞5min，弃去75％的乙醇，预冷的pbs清洗细胞2次；按照说明书用pbs对0.5％的pi进行稀释，加入0.01％的rna酶溶液，平摇混匀，37℃避光孵育30min。
[0102]
(6)检测：处理好的样品在流式细胞仪上检测，在488nm激发波长下测定dna的含量，pi所发出的红光通过630nm激发波长检测，细胞计数为12000个。
[0103]
(7)结果分析：检测结果用flowjo v10软件进行分析。
[0104]
(二)实验结果
[0105]
试验采用pi染色检测syr+cos对l-02细胞周期的影响，l-02细胞经syr+cos给药处理48h，流式检测结果如图4所示。与对照组相比，lps模型组g2/m期细胞比例从16.94
±
0.09％上升至35.27
±
0.23％。与lps模型组相比，40μm syr+cos组g2/m期细胞比例从35.27
±
0.11％下降到28.80
±
0.56％；s期的细胞比例从21.53
±
0.36％上升到25.99
±
0.41％；g1期的细胞比例从40.24
±
0.82％下降到37.10
±
0.57％。由此可见syr+cos对l-02细胞的细胞周期有影响，由数据可知，与正常组相比，lps模型组的g1期和s期的l-02细胞均呈现减少的趋势，而g2/m期的l-02细胞呈现增加的趋势，表明l-02细胞周期被阻滞于g2/m期。而在syr+cos给药以后，和lps模型组相比，40μm syr+cos组的l-02细胞在g2/m期呈现减少的趋势，说明syr+cos可降低lps诱导的l-02细胞在g2/m期的阻滞作用，达到保护肝细胞的作用。
[0106]
实施例5：紫丁香苷联合木香烃内酯对l-02细胞凋亡的影响
[0107]
(一)实验方法
[0108]
流式细胞凋亡检测
[0109]
(1)流式细胞仪检测1份样品中的细胞数≥1
×
105。
[0110]
(2)细胞的培养及给药：将1
×
105个l-02细胞接种到6孔板中，细胞培养箱过夜培养使细胞密度达到80％-90％左右。空白对照组加入浓度为0.2％的dmso，药物组加入40μm的syr+cos，无血清培养基替换，培养48h。
[0111]
(3)收集细胞：加入胰蛋白酶(事先温浴)用于消化l-02细胞，室温下1000rpm离心沉淀细胞5min，收集细胞沉淀，用完全的细胞培养基重悬细胞沉淀，制成单细胞悬液。然后将细胞悬浮液转移到5ml的离心管中。小心去除上清液，加入1ml冰浴预冷pbs缓冲液，悬浮细胞，将细胞悬浮液转移到1.5ml离心管中，1000rpm离心5min，收集细胞沉淀，继续重复pbs洗涤2-3次，直到完全去除胰蛋白酶及培养基成分。
[0112]
(4)染色液的制备：按照每样本100μl 1
×
binding buffer、2μl apc-annexin v以及2μl pi配制染色液，充分混匀。
[0113]
(5)染色：将每个细胞样品与100μl染色液混合，吹打混匀后，于室温中避光培养30min。
[0114]
(6)检测：细胞筛过滤染色的细胞，然后用计算机检测，计数12000个细胞。
[0115]
(7)结果分析：检测结果用flowjo v10软件进行分析。
[0116]
(二)实验结果
[0117]
本试验采用annexinv和pi双染细胞，之后再用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。其原理是因为存在于annexinv与磷脂酰丝氨酸(ps)之间的亲和力很高，而ps在正常情况下位于细胞膜内侧。当细胞发生早期凋亡时，细胞膜向外翻转(这种变化早于dna断裂)，ps能与annexinv结合，从而用于判断早期凋亡，且具有较高的敏感性；碘化丙啶(pi)在正常情况下不能穿透整个细胞膜，而死细胞和处于凋亡中晚期的细胞能改变膜的通透性，这样pi就能进入细胞膜而使细胞核染色。因此，可以据此判断细胞晚期凋亡。如图5所示，40μm的syr+cos给药48h后l-02细胞的凋亡率由lps模型组的51.73
±
0.11％显著降低到40μm syr+cos给药组的20.05
±
0.23％，由此可见syr+cos给药能够显著的减少由lps诱导的l-02细胞凋亡的产生，从而保护l-02细胞。
[0118]
实施例6：紫丁香苷联合木香烃内酯对l-02细胞周期相关蛋白以及凋亡相关蛋白的影响(一)实验方法
[0119]
western blot法检测相关蛋白表达水平
[0120]
(1)细胞蛋白的提取及浓度测定
[0121]
(a)细胞收集：0、10、40μm的syr+cos药物分别处理细胞48h，去上清后加入1ml pbs，4℃3000rpm离心5min，去上清。
[0122]
(b)细胞裂解：每管加入细胞裂解液100μl，于冰上裂解30min。
[0123]
(c)蛋白收集：13000rpm离心10min，收集上清液于离心管中，分装后于-80℃冰箱保存备用。
[0124]
(d)bca试剂盒测蛋白浓度：分别取不同浓度(0、2、4、6、8、10μl)标准蛋白加入96孔板中，体系补足至10μl，每孔加入显色剂150μl。酶标仪检测每个孔的吸光值(630nm)，并按说明书建立蛋白浓度的标准曲线。
[0125]
(e)样品中蛋白浓度的测定：取蛋白样品1μl，加入9μl pbs，加入150μl ecl显色剂，静置10min后，检测吸光度值(630nm)。
[0126]
(2)检测相关蛋白表达水平
[0127]
取4ml l-02型细胞以1
×
105/ml密度接种于6孔板中，同步用不同浓度药物处理24h。收集细胞，冰上裂解30min，12000r/min离心30min，吸取上清液，用bca蛋白浓度测定试剂盒检测总蛋白浓度，将裂解液蛋白(50～100μg)进行8％-15％sds-page，电泳转移至聚偏二氟乙烯膜(amersham bioscience)上。印迹后，将膜与特异性一抗在4℃孵育过夜。与hrp连接的二抗杂交后，通过增强的化学发光检测试剂(amersham biosciences)显可视化蛋白质条带。相关蛋白及其稀释比例如下：caspase-3(1:1000)；caspase-7(1:1000)；caspase-9(1:1000)；cyclin b(1:1000)；cdk1(1:1000)；tnf-α(1:1000)；nf-κb(1:1000)。
[0128]
(二)实验结果
[0129]
cyclin b为m期的周期蛋白，其在s期开始表达，在g2/m期到达峰值。而l-02细胞由g1期向s期转化主要受g1期cdk激酶控制。cdk1激酶主要调控g2/m期，其本身不具有蛋白激酶的活性，但当cyclin b含量积累到一定值时，cyclin b和cdk1相互结合成复合体即细胞促分裂因子(mpf)，cdk1使底物蛋白磷酸化，最终导致染色体凝缩，核纤层蛋白磷酸化使核膜解体。如图6所示，与对照组小鼠相比，lps模型组中cyclin b和cdk1蛋白的表达水平显著降低(**p＜0.01)；与lps模型组相比，经syr+cos给药后，cyclin b和cdk1蛋白的表达水平均显著增加(##p＜0.01)。数据表明，syr+cos能够上调cyclin b和cdk1的蛋白表达从而保护lps诱导的l-02肝细胞损伤。
[0130]
在正常组织的细胞群体中，细胞凋亡按照一定比例分布来维持组织细胞的生理功能，防止细胞损伤或者细胞瘤化，凋亡细胞数目过多可导致组织细胞群及其功能的病理改变。caspase家族蛋白与细胞凋亡密切相关，能够直接导致细胞解体，因此对其研究显得非常重要。为探究syr+cos对lps诱导的l-02肝细胞损伤的保护作用，采用western blot法检测细胞凋亡相关的信号转导蛋白(caspase-3,7,9)的表达水平。如图7所示，与对照组相比，lps模型组中caspase-3,7,9的表达水平显著增加(**p＜0.01)；与lps模型组相比，经syr+cos给药后，caspase-3,7,9的水平显著降低(##p＜0.01)。数据表明，syr+cos能够通过抑制促凋亡蛋白(caspase-3,7,9)的表达从而保护由lps诱导的l-02肝细胞损伤。
[0131]
在肝损伤发生时，通常整个病程都与炎症的发生、发展相伴相随。另外，当细胞周期的调控发生异常时，则可能导致炎症的发生，而炎症的发生进一步引发细胞不受机体控制的恶性增殖。通常在细胞中，nf-κb和抑制因子iκb是以非活性的状态结合在一起的。而当受到外界诸如tnf-α等的刺激后，p65由细胞质进入细胞核中，iκbα被降解。为了进一步探讨
syr+cos对nf-κb信号通路调控的影响，分析syr+cos是否通过nf-κb信号通路对lps诱导的l-02肝细胞损伤产生影响，采用western blot法检测nf-κb信号通路相关蛋白(nf-κb、tnf-α)的表达水平。如图8所示，与对照组相比，lps模型组中nf-κb、tnf-α的水平显著增加(**p＜0.01)；与lps模型组相比，经syr+cos给药后nf-κb、tnf-α的水平显著降低(##p＜0.01)。western blot结果显示，在nf-κb通路上，syr+cos可能通过下调nf-κb，tnf-α蛋白表达水平来抑制由lps诱导的l-02肝细胞损伤。
[0132]
实施例7：紫丁香苷联合木香烃内酯和核心靶蛋白分子对接结果
[0133]
(一)实验方法
[0134]
分子对接验证紫丁香苷联合木香烃内酯和核心蛋白结合力
[0135]
syr+cos的2d结构来自pubchem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)并以“sdf”格式保存。核心靶标对应的蛋白质的3d结构，包括cdk1、cyclin b、casp 3、7、9、nf-κb和tnf-α，从pdb数据库下载(https://www.rcsb.org)并以“pdb”格式保存。chem3d14.0软件和pymol 2.5软件分别用于去除原始配体和水分子并添加氢原子。使用discovery studio 2019软件在核心靶蛋白受体和syr和cos的小分子配体之间进行分子对接。使用libdock评分评估结合活性，并使用discovery studio 2019软件绘制核心靶蛋白受体和syr的小分子配体之间的结合模式图。所得图以3d和2d结构显示。
[0136]
(二)实验结果
[0137]
discovery studio 2019软件用于检查通过应用网络药理学确定的活性成分和高度连接的靶点。分子对接可视化结果表明，syr+cos能够有效进入关键靶蛋白的活性位点，并通过作用键和蛋白质相互作用与特定氨基酸残基相互作用。其中，syr与cyclin b的phe37、val150、pro195和ser78残基形成4个作用键(图9a)；与cdk1蛋白的gln5、ile6、gln49、tyr8和gly47残基形成5个作用键(图9b)；与nf-κb蛋白的glu225、glu222、gln241、lys221残基形成4个作用键(图9c)；与tnf-α蛋白的ser118、tyr103、asn116、cys114、gln113和gln126残基形成6个作用键(图9d)；与casp3蛋白的glu124、tyr195、tyr197、pro201和glu190残基形成5个作用键，与casp7蛋白的tyr523、asn448和pro227残基形成3个作用键(图9e)；与casp9蛋白的pro271、ser272、gly225、tyr153、ser144和gly147残基形成6个作用键(图9f)。cos与cyclin b的dt6,leu235,val187形成3个作用键(图10a)；与cdk1蛋白的his65,lys26,glu163和val164残基形成4个作用键(图10b)；与nf-κb蛋白的cys72,cys65,phe61,tyr9残基形成4个作用键(图10c)；与tnf-α蛋白的cys72,cys65,phe61,tyr9残基形成6个作用键(图10d)；与casp3蛋白的pro35,phe37,tyr38,pro195,leu34残基形成5个作用键，与casp7蛋白的pro227,phe221,tyr223,val292残基形成4个作用键(图10e)；与casp9蛋白的lys73,val124残基形成2个作用键(图10f)。
[0138]
实施例8：紫丁香苷联合木香烃内酯对肝功能及氧化应急相关指标的影响
[0139]
(一)实验方法
[0140]
肝功指标和抗氧化能力测定
[0141]
l-02细胞在6孔微量滴定板中以每孔1
×
106个细胞的密度孵育，并用60μg/ml lps处理4小时，然后用syr+cos处理48小时。用pbs洗涤细胞三次，并丢弃培养基。为了收集处理过的细胞，加入100μl磷酸盐缓冲盐水(pbs)，然后用100μl triton-100细胞裂解缓冲液(裂解。通过充分混合和吹扫裂解物实现了l-02肝细胞的均匀收集。在4℃下以3000rpm离心10
分钟后，根据制造商的说明，使用elias试剂盒分别测量alt、ast和ldh；mda、cat和sod的水平。为了量化细胞内ros水平，使用dcfh-da/h2dcfda(2'，7'-二氯荧光素二乙酸酯)-细胞活性氧检测试剂盒(abcam，uk)。dcfda在活细胞中被ros氧化形成2'，7'-二氯荧光素(dcf)，其在529nm处具有高荧光性。细胞用pbs洗涤3次，然后加入稀释至20μm终浓度的dcfda。然后将细胞在37℃的黑暗中孵育45min。用pbs洗涤三次后，用多模微孔板读取器(tecan trading ag，switzerland)分别在495nm和529nm的激发和发射波长下测量荧光。ros水平计算为实验细胞和对照细胞之间的吸光度比，并以百分比表示。为了测量细胞内ros的水平，使用了dcfh-da/h2dcfda(2'，7'-二氯荧光素二醋酸盐)-细胞检测试剂盒检测ros。活细胞用ros氧化dcfda产生2'，7'-二氯荧光素(dcf)，其在529nm处发出高荧光。在加入稀释至20μm终浓度的dcfda之前，用pbs洗涤细胞3次，然后在37℃的黑暗中孵育45min。在用pbs进行三次额外清洗后，使用多模微孔板阅读器测量荧光，其激发波长和发射波长分别为495nm和529nm。实验细胞和对照细胞之间的吸光度比率分别用于计算ros水平的百分比。
[0142]
(二)实验结果
[0143]
为了进一步评估syr+cos的肝保护活性，测量了培养基中alt、ast(图11a)和ldh(图11b)的释放。与对照组相比，lps诱导组的alt、ast和ldh水平显著提高(图11)。与lps诱导组相比，给予syr+cos可显著抑制alt、ast和ldh水平。氧化应急相关指标使用分别测定mda(图11c)、sod(图11d)、cat(图11e)和ros(图11f)活性。lps诱导组sod、cat水平降低，mda和ros水平升高。然而，给予不同浓度的syr+cos可能会逆转这一趋势。结果表明，syr+cos具有较强的抗氧化能力和保肝活性。
[0144]
以上所述的仅是本发明的实施例，方案中公知的具体技术方案和/或特性等常识在此未作过多描述。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明技术方案的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。本技术要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。

技术特征：
1.一种由紫丁香苷和木香烃内酯组成的组合物在制备抗肝损伤的药物中的应用。2.根据权利要求1所述的一种由紫丁香苷和木香烃内酯组成的组合物在制备抗肝损伤的药物中的应用，其特征在于：紫丁香苷和木香烃内酯的用量比为1：1。3.根据权利要求2所述的一种由紫丁香苷和木香烃内酯组成的组合物在制备抗肝损伤的药物中的应用，其特征在于：抗肝损伤的药物用于提升肝细胞的存活率。4.根据权利要求3所述的一种由紫丁香苷和木香烃内酯组成的组合物在制备抗肝损伤的药物中的应用，其特征在于：抗肝损伤的药物用于提升肝细胞的增殖能力。5.载有权利要求4所述的一种由紫丁香苷和木香烃内酯组成的组合物在制备抗肝损伤的药物中的应用，其特征在于：抗肝损伤的药物用于缓解肝细胞的细胞周期的g2/m期阻滞。6.根据权利要求5所述的一种由紫丁香苷和木香烃内酯组成的组合物在制备抗肝损伤的药物中的应用，其特征在于：抗肝损伤的药物用于抑制肝细胞的凋亡。7.根据权利要求6所述的一种由紫丁香苷和木香烃内酯组成的组合物在制备抗肝损伤的药物中的应用，其特征在于：抗肝损伤的药物用于抑制肝细胞的炎症反应。8.根据权利要求7述的一种由紫丁香苷和木香烃内酯组成的组合物在制备抗肝损伤的药物中的应用，其特征在于：所述肝细胞为lps处理导致的细胞受损的l-02肝细胞。9.根据权利要求8所述的一种由紫丁香苷和木香烃内酯组成的组合物在制备抗肝损伤的药物中的应用，其特征在于：紫丁香苷和木香烃内酯体外处理lps处理导致的细胞受损的l-02肝细胞的浓度比为1：1。10.根据权利要求9所述的一种由紫丁香苷和木香烃内酯组成的组合物在制备抗肝损伤的药物中的应用，其特征在于：抗肝损伤的药物为具有抗氧化能力和保肝活性的药物。

技术总结
本发明涉及抗肝损伤组合制剂技术领域，具体涉及一种由紫丁香苷和木香烃内酯组成的组合物在制备抗肝损伤的药物中的应用。本技术方案通过研究发现紫丁香苷联合木香烃内酯对LPS诱导的L-02细胞肝损伤有显著的保护作用，与阳性药效果相当，表明该化合物具有较好的开发潜力。本技术方案首次在细胞层面证明了紫丁香苷联合木香烃内酯对L-02肝细胞的保护作用，并阐明了机制。紫丁香苷和木香烃内酯的浓度比为1：1时，可产生非常显著的协同增效作用，提升肝损伤细胞的存活率。本技术方案可以解决目前临床上缺少毒副作用小、安全有效、价格低的具有肝损伤保护作用的药物的技术问题，两种化合物以特定的比例联合使用具有一定的应用前景和价值。值。值。


技术研发人员：毛景欣 李艳 王晓冬
受保护的技术使用者：重庆医药高等专科学校
技术研发日：2023.07.26
技术公布日：2023/9/26